簡(jiǎn)述SSR分子標(biāo)記技術(shù)的現(xiàn)狀

王振 于雪

摘要：中國(guó)是世界最大的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，種子產(chǎn)業(yè)憑借其高附加值、高科技含量以及低污染、低能耗的特點(diǎn)端坐在大農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的最上端。現(xiàn)代育種技術(shù)迅猛發(fā)展，品種的選育和推廣速度越來(lái)越快，大量品種的被審定和推廣。由于種子具有較高的科技含量和商業(yè)價(jià)值，某些種子生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)者唯利是圖，以劣質(zhì)種子冒充優(yōu)質(zhì)種子更甚者竊取他人的材料進(jìn)行種子生產(chǎn)，嚴(yán)重?fù)p害其他種子生產(chǎn)者和消費(fèi)者的利益，甚至給國(guó)家?guī)?lái)巨大損失。在當(dāng)前水稻品種數(shù)量眾多并且差異較小的情況下，建立一種準(zhǔn)確、可靠的品種鑒定方法，對(duì)維護(hù)種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)單位品種產(chǎn)權(quán)和經(jīng)濟(jì)利益具有重要意義。

關(guān)鍵詞：SSR分子 種子純度

種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的主要指標(biāo)。在種子生產(chǎn)中，由于忽視種子真實(shí)性和品種純度檢驗(yàn) ，偽劣摻假種子傷農(nóng)事件時(shí)有發(fā)生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了不可彌補(bǔ)的損失。因此，對(duì)種子純度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、有效的鑒定顯得十分重要。

純度是指品種在特征特性方面典型一致的程度，用該品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示。種子純度是種子質(zhì)量好壞的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一，對(duì)種子純度檢測(cè)是防止良種混雜退化、提高種子質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)的必要手段。目前檢測(cè)種子純度的方法有很多種，公認(rèn)最直觀準(zhǔn)確和最具權(quán)威性的種子純度檢測(cè)方法為田間小區(qū)種植鑒定，一般需要一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)才能取得結(jié)果，受季節(jié)和時(shí)間限制，嚴(yán)重滯后于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用種進(jìn)程。較多學(xué)者通過(guò)與田間種植鑒定結(jié)果比較分析發(fā)現(xiàn)，利用 SSR分子標(biāo)記技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定種子純度。當(dāng)前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種子純度檢測(cè)。SSR 標(biāo)記由于具有重復(fù)性好 、遺傳上呈共顯性 、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、引物序列易交流、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已成為種子純度鑒定的一種理想分子標(biāo)記方法。

一、 SSR 分子標(biāo)記原理

SSR 即簡(jiǎn)單序列重復(fù) ，不同品種基因組DNA中 ，存在著能夠穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）重復(fù)次數(shù)的差異，這種差異可以通過(guò)從種子、幼苗等組織中提取DNA，用SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增 ，經(jīng)電泳獲得 DNA 指紋圖譜加以區(qū)別。利用該原理和 SSR 標(biāo)記技術(shù)，在分子水平上鑒定品種純度也成為必然的發(fā)展趨勢(shì)。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)用于雜交種子純度鑒定 ，是基于F1雜交種子（父母本雜交后代）具有父母本共同的遺傳基礎(chǔ)，而父母本之間又在特定的 SSR位點(diǎn)存在多態(tài)性，通過(guò)篩選引物對(duì)樣品 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，凝膠電泳后觀察不同DNA 譜帶類型 ，F(xiàn)1具有雙親互補(bǔ)的帶型，很容易將雜交組合與其親本及其他混雜種子分辨開(kāi)來(lái)。

二、SSR 分子標(biāo)記鑒定純度技術(shù)要點(diǎn)

2.1 DNA 提取

多數(shù)研究者以新鮮葉片或發(fā)芽幼苗為材料來(lái)提取樣品中 DNA，提取的 DNA 質(zhì)量應(yīng)符合 PCR 擴(kuò)增的要求，常見(jiàn)的DNA 提取方法主要有以下幾種 ：CTAB 提取法、SDS 提取法 、磁珠提取法、堿煮法。CTAB 提取法：DNA 質(zhì)量高、得率高，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，成本低，但程序復(fù)雜;SDS 提取法：DNA 質(zhì)量高，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，程序較復(fù)雜;磁珠提取法：DNA 質(zhì)量高、得率較低，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，程序較簡(jiǎn)單;堿煮法質(zhì)量較低，存儲(chǔ)時(shí)間短、程序簡(jiǎn)單，成本極低。

2.2 PCR 擴(kuò)增

2.2.1 引物篩選。

引物篩選原則 ：一是雜合率高 、具有雙親共顯性;二是多態(tài)性高、區(qū)分異品種能力強(qiáng);三是綜合考慮多重電泳組合潛力、堿基基序重復(fù)、擴(kuò)增效果好（特異性擴(kuò)增強(qiáng)、非特異性擴(kuò)增少、引物擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好）。

2.2.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系。

通常 PCR 擴(kuò)增在 10 μL 反應(yīng)體積下進(jìn)行，包含 DNA 聚合酶、SSR 標(biāo)記引物、模板 DNA、d NTP、10 倍 PCR 反應(yīng)液，其中選用的引物為在父母本間具有差異性的引物 。

2.2.3 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序。

94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性 40 s，60 ℃退火 35 s（不同引物退火溫度有別 ），72 ℃延伸 45 s，共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存，經(jīng)過(guò) 35 個(gè)循環(huán)后，單個(gè) SSR 位點(diǎn)特定片段可得到幾百萬(wàn)倍的擴(kuò)增，從而可在凝膠上顯現(xiàn)出來(lái)。

2.3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。

目前，應(yīng)用于 SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的方法主要有溫度掃描凝膠電泳、DNA 測(cè)序、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、普通瓊脂糖凝膠電泳、phor 瓊脂糖凝膠電泳、熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳等。

2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)。

三、分子標(biāo)記技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在許多問(wèn)題

3.1分子標(biāo)記技術(shù)成本較高

分子標(biāo)記技術(shù)由于分子生物學(xué)、數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)等專業(yè)知識(shí)與技術(shù)，其在具體實(shí)踐過(guò)程中就會(huì)出現(xiàn)操作成本過(guò)高的現(xiàn)象。此外在農(nóng)作物種子的檢測(cè)與種植過(guò)程中，涉及的分子標(biāo)記檢測(cè)對(duì)象數(shù)量巨大，工作人員在進(jìn)行種子標(biāo)記行為與后期種子狀態(tài)跟進(jìn)過(guò)程中工作量巨大，進(jìn)而導(dǎo)致分子標(biāo)記技術(shù)參與種子檢測(cè)時(shí)的各項(xiàng)應(yīng)用成本較高。此外分子標(biāo)記技術(shù)成本較高將會(huì)導(dǎo)致分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用面較窄，一些預(yù)算較少的農(nóng)作物種植領(lǐng)域會(huì)放棄這一高成本的種子檢測(cè)技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)的操作成本較高導(dǎo)致該技術(shù)的替代性不得已完全，因此為提升技術(shù)在農(nóng)作物種植領(lǐng)域具體的應(yīng)用率應(yīng)該采取一定措施降低既降低分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用成本。

3.2分子標(biāo)記技術(shù)具體操作過(guò)程不規(guī)范

在分子標(biāo)記技術(shù)的具體操作工程中，需要專業(yè)技術(shù)工作人員借助相應(yīng)的基礎(chǔ)設(shè)施來(lái)對(duì)大量種子類的檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，同時(shí)在標(biāo)記后的觀察階段，需要專業(yè)人員依照相應(yīng)規(guī)定的時(shí)間對(duì)標(biāo)記種子進(jìn)行全方位的檢測(cè)。這樣繁瑣龐大的工作會(huì)直接導(dǎo)致工作人員在分子標(biāo)記技術(shù)的具體操作過(guò)程中出現(xiàn)各類不規(guī)范的現(xiàn)象，違反規(guī)定的操作會(huì)直接降低種子檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

四、結(jié)論

種子是農(nóng)業(yè)種植最根本的生產(chǎn)資料，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步的載體，其質(zhì)量直接關(guān)系到農(nóng)民利益，做好種子質(zhì)量鑒定工作是把控農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全的重要措施。這就需要運(yùn)用快速、準(zhǔn)確檢測(cè)種子質(zhì)量的方法，它對(duì)于種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、新品種注冊(cè)、假種辨別、產(chǎn)權(quán)登記保護(hù)都具有十分重要的作用。分子標(biāo)記技術(shù)在種子的純度鑒定方面有很大的用途，進(jìn)一步普及應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物種子檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用，能夠提升農(nóng)作物種子的監(jiān)測(cè)速率和檢測(cè)質(zhì)量。

1.慶安縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì) 2.綏化市種業(yè)技術(shù)服務(wù)中心