UPLC-MS/MS法檢測(cè)中藥制劑中的27種非法添加化藥成分

辜 慧， 杜 鋼， 李澍才， 張媛媛

(四川省食品檢驗(yàn)研究院， 四川 成都 611731)

0 引 言

中藥以副作用小、療效確切、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)幾千年歷史中被廣泛應(yīng)用于各類疾病的防治。與傳統(tǒng)藥物相同，中藥同樣需要采用可靠的手段來(lái)證明其安全性和有效性，中藥雖然起效慢，但其療效緩和，可以到達(dá)標(biāo)本兼治的效果，因此有些中藥常被大眾服用以改善體質(zhì)[1]。一些不法商家利用中藥制劑成分復(fù)雜、現(xiàn)有分析方法無(wú)法對(duì)各成分均進(jìn)行全面檢測(cè)的特點(diǎn)，向中藥中非法添加化藥成分，以加快中藥療效，從而增加藥品銷量。在患者不知情的情況下，若持續(xù)服用含有非法添加化藥成分的中藥制劑，會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)知的不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害生命安全[2]。非法添加藥物種類繁多，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因具有檢測(cè)范圍廣、選擇性高、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)[3-9]，在多種化合物同時(shí)檢測(cè)中具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本文從減肥藥、壯陽(yáng)藥、降糖藥、解熱鎮(zhèn)痛藥中選定易被添加的27種化藥成分作為檢測(cè)對(duì)象，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。該方法前處理簡(jiǎn)單、快速、具有穩(wěn)定可靠的定量分析能力、高分辨率及更低的檢出限，以期為中藥制劑非法添加的檢驗(yàn)工作提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1290-G6460 QQQ三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司），ME204天平（十萬(wàn)分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司）；FB15065超聲波發(fā)生器（美國(guó)Fisher公司）；Milli-Q型高純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑

西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明、酚酞、咖啡因、芬氟拉明（批號(hào)：S042714，美國(guó) A ChemTek Inc，100 μg/mL）；雙醋酚?。ㄅ?hào)：7-RJH-182-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS，97%）；西地那非、羥基豪莫西地那非、他達(dá)那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非、偽伐地那非（批號(hào)：S037021，美國(guó) A ChemTek Inc，100 μg/mL）；硫代西地那非（批號(hào)：B0002255，BePure，99.8%）；2-羥基丙基去甲他達(dá)那非（批號(hào)：1-HPA-25-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS，98%）；育亨賓（批號(hào)：520024-201401，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.3%）；貝諾酯（批號(hào)：100225-201704，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.9%）；對(duì)乙酰氨基酚（批號(hào)：100018-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.9%）；氨基比林（批號(hào)：100503-201803，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.7%）、地塞米松（批號(hào)：100129-201907，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.8%）；醋酸地塞米松（批號(hào)：100122-201707，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.2%）；吡羅昔康（批號(hào)：100177-201704，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.5%）；二甲雙胍、苯乙雙胍（批號(hào)：C0007483，BePure，10 μg/mL）；格列本脲、格列美脲、吡格列酮（批號(hào)：C0007484，BePure，10 μg/mL）。

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜純，德國(guó)CNW公司)。分析用水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm，1.8 μm），進(jìn)樣體積：1 μL，柱溫：35 ℃，流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈，流量為0.5 mL/min，梯度洗脫，程序見(jiàn)表 1。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，電離電壓：3.0 kV；干燥氣流量：9 L/min；干燥氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：9 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；霧化器流量：40 psi（1psi=6.895 kPa）。具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 2。

表2 27種化藥成分定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 溶液的配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取上述固體對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再分別精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置同一容量瓶中，用甲醇稀釋，配制成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用前用甲醇逐步稀釋至濃度分別為10，20，50，100，150，200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.3.2 供試品溶液

片劑、散劑、丸劑及顆粒劑，取10份研細(xì)混勻；膠囊劑，取10粒內(nèi)容物研細(xì)混勻；液體制劑，取10份混勻。精密稱取樣品1 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液（必要時(shí)可將續(xù)濾液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專?/p>

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

取濃度為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及不含任何化學(xué)藥陰性樣品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別得到對(duì)照品及陰性樣品總離子流圖，經(jīng)提取MRM色譜圖，陰性樣品色譜圖中均無(wú)干擾目標(biāo)物測(cè)定的色譜峰。結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)。27種化藥成分正模式下MRM總離子流圖如圖1所示。

圖1 27種化藥成分總離子流圖

2.4.2 線性范圍考察

取“2.3.1”項(xiàng)下濃度為10，20，50，100，150，200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以27種化學(xué)藥的定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明27種化藥成分在10～ 200 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.992，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.3 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

向不含任何化學(xué)成分的中藥制劑中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，以信噪比為3時(shí)計(jì)算各成分的檢測(cè)限，以信噪比為10時(shí)計(jì)算各組分的定量限。結(jié)果檢測(cè)限（LOD）在 0.0061～0.3750 μg/g，定量限（LOQ）在 0.0204～1.2500 μg/g，見(jiàn)表 3。表明該方法具有較高的靈敏度，能夠滿足27種化藥成分的檢測(cè)要求。

表3 27種化藥成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限及定量限

2.4.4 進(jìn)樣精密度考察

取“2.3.1”項(xiàng)下濃度為 100 ng·mL–1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，在MRM模式下計(jì)算提取定量離子峰面積的RSD為0.1%～ 6.0%（n=6），表明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性考察

取一批陽(yáng)性（檢出貝諾酯）樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，平行制備6份樣品，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，計(jì)算得樣品中貝諾酯平均含量為40.02 μg/g，RSD為5.8% (n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

以經(jīng)檢測(cè)不含非法添加化藥成分的空白樣品為基質(zhì)，采用 3個(gè)濃度 (1.0，2.0，5.0 μg·g–1)添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度為 1 μg/mL），按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)添加濃度平行操作6次，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。27種化藥成分的平均回收率在80.4%～ 120.9%之間，RSD為0.8%～ 7.8%。

表4 27種化藥成分的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4.7 溶液穩(wěn)定性考察

取“2.4.5”項(xiàng)下回收試驗(yàn)溶液（含量為 1.0 μg/g），在制備后分別室溫放置 0、2、4、8、12、16、24 h，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，在MRM模式下計(jì)算提取定量離子峰面積的RSD為1.5%～ 6.9%，結(jié)果表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品測(cè)定

采用上述方法對(duì)50批次日常監(jiān)督抽檢中藥制劑進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果均未檢出27種非法添加化藥成分。對(duì)10批次委托樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果一批鼻炎顆粒檢出地塞米松（3.82 μg/g）和醋酸地塞米松（619.71 μg/g）、一批私人診所配制中藥制劑檢出貝諾酯（40.02 μg/g）、兩批中藥制劑檢出西地那非（49768.89 μg/g、84247.39 μg/g）。

3 討 論

3.1 樣品前處理方法的考察

檢測(cè)非法添加物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法及文獻(xiàn)中多數(shù)采用100%甲醇超聲提取[10-17]，且甲醇對(duì)本文中27種化藥成分的溶解性均良好，故采用甲醇超聲提取的方法。經(jīng)過(guò)比較超聲時(shí)間，確定了前處理?xiàng)l件為超聲10 min。一般情況下，非法添加劑量比較高，因此在實(shí)際測(cè)定樣品過(guò)程中，為避免進(jìn)樣濃度過(guò)高導(dǎo)致儀器污染，宜根據(jù)樣品實(shí)際含量，提取后再進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯筮M(jìn)樣。

3.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用正離子模式，在水相中加入0.1%甲酸，可以增加離子化的效率，增加各化合物的響應(yīng)值。同時(shí)比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相的分析效果，結(jié)果表明乙腈能夠更好分離27種化藥成分，同時(shí)能夠降低柱壓，保護(hù)色譜柱。所以采用流動(dòng)相0.1%甲酸-乙腈系統(tǒng)，進(jìn)行梯度洗脫。

將27種非法添加藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng·mL–1），在正離子模式下，直接進(jìn)樣，確定各化合物母離子參數(shù)。確定母離子后，用子離子掃描方式選取豐度較高的2個(gè)子離子分別作為定量和定性離子，在相應(yīng)模式下優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。色譜峰按出峰時(shí)間進(jìn)行采集，最大程度增加了提取離子的掃描時(shí)間，使MRM靈敏度和重現(xiàn)性增強(qiáng)。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)減肥類、壯陽(yáng)類、降糖類、解熱鎮(zhèn)痛類中藥制劑中易被添加的27種化藥成分，該方法靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單且回收率良好，可用于日常檢測(cè)，為打擊不法商家、維護(hù)良好的中藥制劑市場(chǎng)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，對(duì)保證消費(fèi)者用藥安全具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。