胡黃連苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷保護(hù)作用

王瀟璐,于竹芹,汪貫習(xí),劉宗保,周縝,郭云良

(青島大學(xué),山東 青島 266021 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)系； 2 松山醫(yī)院； 3 醫(yī)學(xué)部外科實(shí)驗(yàn)中心)

腦卒中是臨床上常見(jiàn)的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中約占80%[1]。東亞人群患腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)位居全球首位[2-3]。腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血后血流再通進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷和功能障礙的過(guò)程，是一種涉及多個(gè)因素的復(fù)雜病理生理現(xiàn)象[4]。氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)神經(jīng)細(xì)胞模型，是通過(guò)氧糖剝奪后快速恢復(fù)氧糖供應(yīng)，從而在細(xì)胞水平模擬臨床腦缺血再灌注損傷，以進(jìn)行細(xì)胞機(jī)制和藥物研究[5]。正常情況下，自由基的生成和清除會(huì)形成動(dòng)態(tài)平衡。在缺血再灌注時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基[6-7]。大量的活性氧(ROS)是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的主要原因[8-9]。ROS是有氧代謝產(chǎn)生的自由基，是一種不穩(wěn)定的化合物質(zhì)，易與核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡[10]。ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會(huì)進(jìn)一步引起DNA損傷和局部炎癥反應(yīng)，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能導(dǎo)致隨后的炎癥因子風(fēng)暴，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-12]。因此，研究開(kāi)發(fā)抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)藥物至關(guān)重要。傳統(tǒng)中藥胡黃連是玄參科植物西藏胡黃連的干燥根莖[13]。研究證明，胡黃連的主要有效成分是環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，主要單體有效成分為胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅲ；胡黃連苷具有保護(hù)肝臟[14]，保護(hù)腦缺血再灌注[15-17]、腎缺血再灌注、急性胰腺炎[18]以及減輕炎癥反應(yīng)[19]的作用。但胡黃連苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用和最佳劑量尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R模型模擬腦缺血再灌注損傷過(guò)程[20-21]，旨在探討胡黃連苷對(duì)OGD/R損傷的保護(hù)作用及其最佳劑量，以期為缺血性腦血管病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

胡黃連苷Ⅰ(分子式為C24H28O11，分子量為492.47)、胡黃連苷Ⅱ(分子式為C23H28O13，分子量為512.46)、胡黃連苷Ⅲ(分子式為C25H30O13，分子量為538.5)(B20515，上海源葉生物科技有限公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone， USA)；DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基(GIBCO，USA)；胰蛋白酶(Trypsin，GIBCO，USA)；澳洲胎牛血清(GIBCO，USA)；細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用100×青-鏈霉素混合液(P1400，Solarbio)；Cell counting kit-8(DOJINDO，Japan)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株(批號(hào)為20181105)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供，置于含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底面積達(dá)80%時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入2.5 g/L的胰蛋白酶，消化30 s后以1 000 r/min離心5 min，使用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液以2×108/L接種于96孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3 OGD/R模型制備

細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率為80%時(shí)，將含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基更換成無(wú)糖無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，連續(xù)充以無(wú)氧氣體(體積分?jǐn)?shù)0.90的N2、體積分?jǐn)?shù)0.09的CO2和體積分?jǐn)?shù)0.01的O2)，4 h后取出，換成含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 分組設(shè)計(jì)

前期實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行正常培養(yǎng)，不做其他處理)、模型組(建立OGD/R模型)、胡黃連苷組(建立OGD/R模型，在復(fù)氧的同時(shí)加入5、10、20、40、80 μmol/L等5個(gè)濃度梯度的胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ)。每次每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)和檢測(cè)細(xì)胞存活率、LDH釋放量和ROS水平，確定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅲ的最佳濃度。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳濃度作為研究因素，采用2×2×2的析因設(shè)計(jì)分組，每個(gè)因素各取2個(gè)水平，即胡黃連苷Ⅰ(0用、1不用)、胡黃連苷Ⅱ(0用、1不用)、胡黃連苷Ⅲ(0用、1不用)，不同水平完全交叉組合形成了23個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即8個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 復(fù)氧復(fù)糖24 h后，在倒置顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況、數(shù)量、形態(tài)的變化。

1.5.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化、離心，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞、計(jì)數(shù)。取細(xì)胞懸液每孔100 μL(2×108/L)鋪在96孔板中，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時(shí)，制備OGD/R模型。造模結(jié)束后，在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育3 h，同時(shí)再設(shè)一個(gè)空白孔作為對(duì)照，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度值。計(jì)算各組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/對(duì)照組吸光度均值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3LDH釋放量測(cè)定 SH-SY5Y細(xì)胞分組及培養(yǎng)同前，在OGD/R后，于96孔板中取各組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液適量，進(jìn)行LDH測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞損傷程度。

1.5.4細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞分組及培養(yǎng)同前，在OGD/R后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA工作液，37 ℃孵育30 min，棄去上清液，洗滌2次，使用PBS吹打均勻，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。結(jié)果以熒光強(qiáng)度比值表示，熒光強(qiáng)度比值=實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度/對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胡黃連苷對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組細(xì)胞大部分正常貼壁生長(zhǎng)，僅少量半貼壁，漂浮細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞形態(tài)呈兩極或多極，細(xì)胞突起明顯，細(xì)胞之間相互交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞膜光滑、完整，胞體折光性較強(qiáng)。與對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞的間隙變大，部分細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞突起明顯減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞團(tuán)脫落，胞體折光性下降，部分細(xì)胞裂解成碎片。胡黃連苷組在藥物濃度為20～80 μmol/L時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好，OGD/R導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化明顯減輕。雖然細(xì)胞間隙增大、突起有所回縮，但是細(xì)胞數(shù)量比模型組明顯增加，細(xì)胞貼壁性增強(qiáng)，可觀察到正常形態(tài)細(xì)胞，大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，少部分細(xì)胞皺縮變形或脫壁，細(xì)胞碎片與模型組相比明顯減少，生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯改善。其中藥物濃度為20、40 μmol/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)較好、貼壁能力較強(qiáng)，兩個(gè)濃度組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異；當(dāng)藥物濃度為80 μmol/L時(shí)細(xì)胞間隙增大。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量。見(jiàn)圖1。

2.2 胡黃連苷對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

經(jīng)過(guò)OGD/R處理后模型組的細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降，差異均有顯著性(F=101.9～364.1，t=20.66～38.15，P<0.01)；與模型組、胡黃連苷5 μmol/L組相比較，胡黃連苷20、40、80 μmol/L組的細(xì)胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.71～8.84，P<0.05)；但是20、40、80 μmol/L的胡黃連苷對(duì)細(xì)胞存活率的影響差異無(wú)顯著性(P>0.05)。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量。見(jiàn)圖2。

2.3 胡黃連苷對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞損傷程度的影響

與模型組相比，胡黃連苷Ⅰ 20、40、80 μmol/L組和胡黃連苷Ⅲ 20、40、80 μmol/L組SH-SY5Y細(xì)胞的LDH釋放量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=156.7～252.0，t=8.19～13.78，P<0.01)；而胡黃連苷Ⅰ 20、40、80 μmol/L組間和胡黃連苷Ⅲ 20、40、80 μmol/L組間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。胡黃連苷Ⅱ 40、80 μmol/L組SH-SY5Y細(xì)胞的LDH釋放量與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=94.4，t=16.12、16.89，P<0.01)。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量，胡黃連苷Ⅱ則選擇以40 μmol/L為最佳劑量。見(jiàn)圖3。

2.4 胡黃連苷對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

與對(duì)照組相比較，OGD/R各組SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平均有顯著升高(F=385.7～630.0，t=35.41～43.78，P<0.01)。與模型組相比較，胡黃連苷20、40、80 μmol/L組SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.80～31.39，P<0.01)，而胡黃連苷5、10 μmol/L組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，胡黃連苷40、80 μmol/L組間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以40 μmol/L為最佳劑量。見(jiàn)圖4。

2.5 胡黃連苷組合優(yōu)化對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞的影響

按照上述細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率、LDH釋放量和ROS水平結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ最佳劑量分別為20、20、20、40 μmol/L，胡黃連苷Ⅱ最佳劑量分別為20、20、40、40 μmol/L，胡黃連苷Ⅲ最佳劑量分別為20、20、20、40 μmol/L。對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，從用藥劑量最小化和療效最大化的角度考慮，選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳劑量為20 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

光學(xué)顯微鏡下觀察，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ聯(lián)合用藥組細(xì)胞狀態(tài)最好，較其他組改善更加明顯，OGD/R導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞損傷明顯減輕，雖然細(xì)胞突起有所回縮，但是大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，貼壁性較其他組好，少部分細(xì)胞皺縮變形或脫壁，細(xì)胞碎片與模型組相比明顯減少。見(jiàn)圖5。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞存活率、LDH漏出率、ROS水平結(jié)果也優(yōu)于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.9～186.3，t=2.64～40.17，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 胡黃連苷對(duì)OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞存活率、LDH漏出率和ROS水平的影響

3 討 論

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)，是導(dǎo)致全球成年人死亡的主要原因之一[22-23]。腦缺血的主要發(fā)病機(jī)制為腦局部組織血流量減少導(dǎo)致氧氣和葡萄糖輸送不足以支持細(xì)胞代謝需求[24]。腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血后重新獲得血流灌注或者氧氣供應(yīng)后產(chǎn)生的一系列損傷和功能障礙，從而引起神經(jīng)元不可逆性損傷或死亡[25]。研發(fā)能夠減輕再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物至關(guān)重要。

胡黃連是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，別名割孤露澤、胡連，始載于《唐本草》，功效退虛熱、消疳熱、清熱燥濕、瀉火解毒[26]。胡黃連苷的主要有效成分是環(huán)烯醚萜苷[27-28]。既往有研究結(jié)果表明，在腦缺血再灌注損傷中，胡黃連苷Ⅱ具有抗炎、抗氧化、減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[29]和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用[30]。

研究表明，缺血再灌注損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)密不可分[31]。神經(jīng)元因抗氧化防御能力弱，維持能量穩(wěn)態(tài)能力較低，極易遭受氧化應(yīng)激損傷[32]。測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞的存活率是檢測(cè)神經(jīng)保護(hù)藥物作用的常用實(shí)驗(yàn)方法[33]。正常情況下LDH不能通過(guò)細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，漏出到培養(yǎng)液中的LDH增加，故LDH釋放量可作為細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志物，與細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)[34]。當(dāng)體內(nèi)腦缺血再灌注或體外OGD/R損傷時(shí)，細(xì)胞的凋亡通常伴隨著細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞通透性上升。

本研究結(jié)果顯示，胡黃連苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R損傷具有保護(hù)作用，且胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ在20 μmol/L時(shí)效果最好。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ各20 μmol/L聯(lián)合用藥，系最佳級(jí)聯(lián)優(yōu)化組合。胡黃連苷可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，因此胡黃連苷可能是治療腦缺血再灌注損傷有效且有潛力的藥物。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳劑量及聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)化尚未有研究報(bào)道，本文結(jié)果對(duì)減輕缺血低氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷和保護(hù)治療機(jī)制研究具有重要的價(jià)值，對(duì)進(jìn)一步了解胡黃連苷的神經(jīng)保護(hù)作用具有重要意義。