葡萄籽提取物對(duì)采后獼猴桃青霉病的抑制效果與機(jī)理

楊秀蘭 石其宇 彭俊森 劉勤超 黃世安 許興亮 朱守亮 董曉慶

(1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/貴州省果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州省果樹(shù)蔬菜工作站，貴州 貴陽(yáng) 550025)

貴長(zhǎng)獼猴桃(Actinidia chinensis Planch)是貴州省果樹(shù)科學(xué)研究所選育出的優(yōu)質(zhì)獼猴桃品種，果實(shí)香甜適口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后易出現(xiàn)腐爛和霉變等問(wèn)題。貯藏期間霉菌侵染是導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)腐爛的主要原因，由青霉菌引起的青霉病是影響獼猴桃果實(shí)的重要病害之一[2]。段愛(ài)莉等[3]研究表明，引起獼猴桃霉?fàn)€的病原菌共5 種，分別為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、 交 鏈 孢 霉 屬(Alternaria)、 毛 霉 屬(Mucor)和擬青霉屬(Paecilomyces)，其中青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌，占63.3%。青霉菌易從果實(shí)傷口及其他病原菌侵染點(diǎn)侵入，過(guò)熟或長(zhǎng)時(shí)間貯藏的獼猴桃果實(shí)也易遭受青霉菌侵染，發(fā)生青霉病，導(dǎo)致果實(shí)腐爛，而且青霉菌還會(huì)產(chǎn)生真菌毒素(棒曲霉素)而危及食品安全[4]。目前控制獼猴桃青霉病的常用方法多使用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)殺菌劑的濫用不僅會(huì)增強(qiáng)病原菌抗藥性，而且會(huì)造成環(huán)境的嚴(yán)重污染，損害人類(lèi)身體健康。

天然植物源殺菌保鮮劑是果蔬采后病害的常用殺菌劑，不僅具有較強(qiáng)的抑菌活性，而且低毒、對(duì)環(huán)境友好，更重要的是能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)是從葡萄種子中提取出的一種多酚類(lèi)物質(zhì)混合物，其中的原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化能力[6]。研究表明，GSE 不僅有抗氧化作用，還具有強(qiáng)烈的抑菌作用[7－8]。董曉敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有明顯抑制作用。劉永衡等[10]研究表明，葡萄籽正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有較強(qiáng)的抑菌效果。高海艷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GSE 處理能降低采后桃果實(shí)的自然發(fā)病率，增強(qiáng)其抗病性。崔旸等[12]研究發(fā)現(xiàn)GSE 具有延緩鴨梨果實(shí)成熟衰老，維持果實(shí)品質(zhì)，控制鴨梨果實(shí)采后失重、腐爛及果柄褐變的功效。Duran 等[13]以殼聚糖(chitosan，CH)作為GSE 的載體所制成的抗菌活性涂料包裝對(duì)草莓的嗜氧細(xì)菌有較好的抑制作用，可極大延長(zhǎng)草莓貨架期。吳寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GSE 處理能保持鮮香菇良好的感官品質(zhì)，降低失重速率和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，還能有效抑制香菇中細(xì)菌的生長(zhǎng)。但是GSE 在獼猴桃采后貯藏中的效果研究甚少，關(guān)于獼猴桃果實(shí)病害防治中的研究更是鮮有報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)以貴長(zhǎng)獼猴桃為試材，研究GSE 處理對(duì)獼猴桃果實(shí)接種青霉菌后的作用效果，探索GSE在獼猴桃果實(shí)青霉病防治的應(yīng)用價(jià)值及可能機(jī)制，以期為GSE 作為天然抗菌物質(zhì)在果蔬病害防治方面的開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)供試材料貴長(zhǎng)獼猴桃，于2016年9月22月采自貴州省修文縣平灘村管理良好的果園(26.81°N，106.46°E；海拔1 019 m)，選擇無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害、大小基本一致的果實(shí)用于試驗(yàn)。

病原菌為擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)，由中國(guó)科學(xué)院北京植物研究所李博強(qiáng)課題組提供，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；GSE 為新疆紅葡萄籽水提取物，具體品種為赤霞珠，原花青素含量95%以上，購(gòu)于西安昌岳生物科技有限公司。氫氧化鈉、聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)、TritoX－100、愈創(chuàng)木酚、30%H2O2溶液、鄰苯二酚、亞油酸鈉、二水磷酸氫二鈉、一水磷酸氫二鈉、硼酸、硼砂、β－巰基乙醇、L－苯丙氨酸，均為分析純，購(gòu)于貴州省塞蘭博科技有限公司；濃鹽酸、幾丁質(zhì)、丙酮、脫鹽蝸牛酶、四硼酸鉀、對(duì)二甲氨基苯甲醛、N－乙酰葡萄糖胺、乙醇、昆布多糖、3，5－二硝基水楊酸、沒(méi)食子酸、葡萄糖、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)等，均為分析純，購(gòu)于貴州省格瑞恩科技有限公司；蘆丁生化試劑，購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ－2D 型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CP213 型電子天平，昆山吉和力儀器有限公司；FA－2104 型分析天平，上海啟閔生物科技有限公司；Eppendorf 移液槍(1 000 μL、100 μL)，德國(guó)Eppendorf 公司；SPX－250BⅢ生化培養(yǎng)箱、DK－98－Ⅱ型雙列八孔電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；YG16W 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；UV752 紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器有限公司；DW-HL678 型超低溫冰箱，成都川弘科生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌及孢子懸浮液的制備 將擴(kuò)展青霉接種于PDA 培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)活化7 d，隨后用含有0.05%吐溫－20 的無(wú)菌水沖下孢子，并采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度約為1×106個(gè)·mL－1。

1.3.2 試驗(yàn)處理 獼猴桃果實(shí)(硬度約16.0 kg·m－2，可溶性固形物約7.5%)用95%的乙醇擦拭，自然晾干，在每個(gè)獼猴桃果實(shí)的赤道部位用無(wú)菌不銹鋼鐵釘(Φ ＝4 mm)刺一個(gè)大小、深度一致的傷口(4 mm×5 mm)。將刺傷的果實(shí)分為兩組，每組150 個(gè)果實(shí):于20±1℃將一組獼猴桃果實(shí)浸泡在10 L 7 mg·mL－1GSE溶液(預(yù)試驗(yàn)篩選出的GSE 最佳濃度為7 mg·mL－1，稱(chēng)取葡萄籽提取物3.278 g 用水配制)中2 min，用于抗性誘導(dǎo)效果的研究；同樣溫度下將另一組浸泡在10 L的清水中2 min(作為對(duì)照)。自然條件下晾干，24 h后接種青霉菌孢子(用消毒的鑷子將孢子直接放在獼猴桃赤道損傷部位)，接種后用PE 塑料袋密封保濕(相對(duì)濕度85%～90%)，室溫(20±1℃)放置。每天測(cè)定病斑直徑和發(fā)病率，連續(xù)測(cè)定7 d。每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20 個(gè)果實(shí)。分別在接菌第0、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7 天每組分別隨機(jī)選擇3 個(gè)獼猴桃果實(shí)測(cè)定果實(shí)硬度以及可溶性固形物，3 次重復(fù)；并且取病斑周?chē)?.5 cm 范圍內(nèi)果肉組織混勻，用留樣袋裝好后于－80℃超低溫冰箱中保存進(jìn)行各項(xiàng)酶活性以及指標(biāo)測(cè)定。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)2 個(gè)果實(shí)。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.3.1 病斑直徑和發(fā)病率測(cè)定 病斑直徑采用十字交叉法，取平均值；以病斑直徑≥0.5 mm 確定為發(fā)病，按公式計(jì)算發(fā)病率:

1.3.3.2 總酚和類(lèi)黃酮含量測(cè)定 參考曹建康等[15]的方法略加修改。稱(chēng)取2.0 g 獼猴桃果肉樣品，加入9 mL 經(jīng)4℃預(yù)冷的1%HCl－甲醇，充分混勻，4℃避光提取20 min，期間搖動(dòng)數(shù)次，4℃、12 000×g離心15 min，取上清液于280 nm 和325 nm 波長(zhǎng)處比色測(cè)定吸光度值(OD)。以每克樣品在波長(zhǎng)280 nm 處吸光度值表示總酚含量，即OD280nm·g－1；以每克樣品在波長(zhǎng)325 nm波長(zhǎng)處吸光度值表示類(lèi)黃酮物質(zhì)含量，即OD325nm·g－1。

1.3.3.3 MDA 含量測(cè)定 參考曹建康等[15]的方法。稱(chēng)取1.0 g 獼猴桃樣品，加入5.0 mL TCA 溶液(100 g·L－1)，研磨成勻漿后于4℃、10 000×g離心20 min，取2.0 mL 上清液(對(duì)照空白管中加入2.0 mL TCA 溶液代替提取液)，加入2.0 mL 0.67% TBA 溶液，混合后在沸水中煮沸20 min，取出冷卻后再離心一次，分別測(cè)定上清液在450、532 和600 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

式中，Ⅴ0為樣品提取液總體積，mL；Ⅴ1為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3.4 酶液提取與酶活性測(cè)定 參考曹建康等[15]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入不同的提取緩沖液制成酶提取液并測(cè)定各酶活性，結(jié)果以U·g－1表示。

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液(含1%TritonX－100 和4% PVPP)，在冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

幾丁質(zhì)酶(chitinase，CHI):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液[含1 mmol·L－1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和5 mmol·L－1β－巰基乙醇]，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

β－1，3 葡聚糖酶(β－1，3-glucanase，GLU):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1EDTA、5 mmol·L－1β－巰基乙醇和1 g·L－1L－抗壞血酸)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO):取5.0 g獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1PEG、4% PVPP 和1%TritonX－100)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine amonialyase，PAL):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預(yù)冷的提取緩沖液(含40 g·L－1PVP、2 mmol·L－1EDTA 和5 mmol·L－1β－疏基乙醇)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 經(jīng)預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1EDTA，4% PVPP 和1%TritonX－100)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Excel 2013 軟件作圖，并采用SAS12.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSE 處理對(duì)損傷接菌后獼猴桃果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑的影響

由圖1 可知，GSE 處理可有效延緩獼猴桃果實(shí)接種擴(kuò)展青霉后果實(shí)發(fā)病率的上升。對(duì)照組獼猴桃果實(shí)在接種擴(kuò)展青霉1 d 后開(kāi)始發(fā)病，在接種5 d 后發(fā)病率達(dá)100%；GSE 處理組獼猴桃果實(shí)在接種2 d 后才開(kāi)始發(fā)病，接種6 d 后發(fā)病率達(dá)100%。GSE 處理組獼猴桃果實(shí)比對(duì)照組果實(shí)接種后發(fā)病率上升較慢，開(kāi)始發(fā)病時(shí)間與全部發(fā)病時(shí)間皆延后1 d(圖1-A)。獼猴桃果實(shí)接種擴(kuò)展青霉后，果實(shí)病斑直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷擴(kuò)大。GSE 處理組獼猴桃果實(shí)病斑直徑均小于對(duì)照組，在接種7 d 后對(duì)照組獼猴桃果實(shí)病斑直徑為1.58 cm，而GSE 處理組獼猴桃果實(shí)病斑直徑則為0.85 cm，較對(duì)照組減小46.20%(圖1-B)。在試驗(yàn)周期7 d 內(nèi)，GSE 處理均顯著抑制了接種后獼猴桃果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大(P<0.05)。

圖1 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 Effects of GSE treatment on infection incidence (A) and lesion diameter (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.2 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)總酚和總類(lèi)黃酮含量的影響

酚類(lèi)物質(zhì)是植物體中常見(jiàn)的次級(jí)代謝物，具有殺菌和抗氧化的作用[4]。獼猴桃果實(shí)接種擴(kuò)展青霉后，其總酚含量呈先升高后下降隨后升高再下降的波動(dòng)變化。除接種7 d 后對(duì)照組獼猴桃果實(shí)總酚含量高于GSE 處理組果實(shí)外，在接種后1～6 d 期間，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)總酚含量均顯著(P<0.05)高于對(duì)照組(圖2-A)。

類(lèi)黃酮具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒的功能[16]。在接種擴(kuò)展青霉后0～7 d 期間，獼猴桃果實(shí)總類(lèi)黃酮含量共出現(xiàn)2 個(gè)峰值。接種1 d 后，GSE處理果實(shí)和對(duì)照組獼猴桃果實(shí)總類(lèi)黃酮含量達(dá)到第一個(gè)峰值，其含量分別為3.22 和2.97 OD325nm·g－1。接種后1～4 d 期間獼猴桃果實(shí)總類(lèi)黃酮含量呈下降趨勢(shì)，4～6 d 期間呈上升趨勢(shì)。接種后6 d 總類(lèi)黃酮含量達(dá)到第二個(gè)峰值，GSE 處理組和對(duì)照組總類(lèi)黃酮含量分別為2.95 和2.60 OD325nm·g－1(圖2-B)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)接種擴(kuò)展青霉后的1～7 d 期間其果實(shí)總類(lèi)黃酮含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)總酚含量(A)和總類(lèi)黃酮含量(B)的影響Fig.2 Effects of GSE treatment on total phenols content (A) and total flavonoids content (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.3 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)CHI 和GLU 活性的影響

CHI 和GLU 是兩類(lèi)重要的能降解病原體細(xì)胞壁的病程相關(guān)蛋白，CHI 可降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)成分，GLU 能催化β－1，3－葡聚糖多聚體水解成寡糖，在以寡糖為誘發(fā)因子誘導(dǎo)植物的保衛(wèi)反應(yīng)，保衛(wèi)素破壞病原真菌細(xì)胞壁，從而對(duì)病原菌的生長(zhǎng)起抑制作用[17]。

獼猴桃接種擴(kuò)展青霉后GSE 處理組果實(shí)CHI 活性大致呈先升高后下降隨后升高再下降的趨勢(shì)。GSE處理組和對(duì)照組獼猴桃果實(shí)CHI 活性最低值均在接種后4 d，分別為17.57 和10.32 U·g－1，兩者相差7.25 U·g－1。對(duì)照組獼猴桃果實(shí)CHI 活性最高值為55.49 U·g－1，在接種后6 d 出現(xiàn)，此時(shí)GSE 處理組獼猴桃果實(shí)CHI 活性為58.20 U·g－1，仍高于對(duì)照組果實(shí)(圖3-A)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，接種擴(kuò)展青霉后，經(jīng)GSE 處理的果實(shí)CHI 活性在2～5 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

獼猴桃接種擴(kuò)展青霉后GSE 處理組果實(shí)GLU 活性在0～7 d 期間總體上呈逐漸升高的趨勢(shì)。0 d 時(shí)，GSE 處理組和對(duì)照組獼猴桃果實(shí)GLU 活性分別為10.59 和2.34 U·g－1，接種后7 d 其活性分別為15.81和7.95 U·g－1，分別上升了5.22 和5.61 U·g－1(圖3-B)。在接種擴(kuò)展青霉后0～7 d 期間，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)GLU 活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)CHI 活性(A)和GLU 活性(B)的影響Fig.3 Effects of GSE treatment on CHI activity (A) and GLU activity (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.4 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，是反映細(xì)胞膜受傷害程度的重要指標(biāo)[15]。MDA 含量越高，果實(shí)氧化越嚴(yán)重，果實(shí)抗逆性越差。接種擴(kuò)展青霉后，獼猴桃果實(shí)MDA 含量大致呈現(xiàn)略微上升而后下降的趨勢(shì)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)MDA 含量始終低于對(duì)照組，在接種3 d 后兩組果實(shí)MDA 含量差值最大，相差0.13 μmol·g－1(圖4)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)MDA 含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖4 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)MDA含量的影響Fig.4 Effects of GSE treatment on MDA content of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.5 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)LOX 活性的影響

LOX 能夠啟動(dòng)細(xì)胞膜的過(guò)氧化反應(yīng)，將不飽和脂肪硬催化為游離脂肪酸等物質(zhì)，加速膜脂降解，破壞細(xì)胞的正常功能[18－19]。接種擴(kuò)展青霉后，對(duì)照組獼猴桃果實(shí)LOX 活性在接種后0～4 d 呈先上升后下降的趨勢(shì)，在接種后2 d 其活性達(dá)到最高，為49.20 U·g－1；而GSE 處理組獼猴桃果實(shí)LOX 活性變化則與之相反，呈先下降后上升的趨勢(shì)，在接種后2 d 其活性最低，為4.33 U·g－1。在其后的4～7 d 兩者活性變化趨勢(shì)也大致相反。接種擴(kuò)展青霉后，除0 和4 d 對(duì)照組果實(shí)LOX活性低于處理組外，其余時(shí)間對(duì)照組果實(shí)LOX 活性均高于處理組(圖5)。在接種后的1、2、3、5、6 d，經(jīng)GSE處理的獼猴桃果實(shí)在接種擴(kuò)展青霉后其LOX 活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖5 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)LOX活性的影響Fig.5 Effects of GSE treatment on LOX activity of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.6 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)PPO 活性的影響

PPO 可通過(guò)催化形成木質(zhì)素及其他酚類(lèi)氧化產(chǎn)物等保護(hù)性屏障使植物體免受病菌侵害，也可通過(guò)形成醌類(lèi)物質(zhì)直接發(fā)揮抗菌作用[20]。獼猴桃果實(shí)接種擴(kuò)展青霉后，在0 d 時(shí)果實(shí)PPO 活性處于極低水平。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)PPO 活性在1～3 d 時(shí)處于較高水平(大于0.18 U·g－1)，后期較低；而對(duì)照組獼猴桃果實(shí)除接種后6 d 的PPO 活性達(dá)到0.25 U·g－1，其余時(shí)間其活性都不高。GSE 處理組獼猴桃果實(shí)PPO 活性在接種后1 d 達(dá)到最大值0.36 U·g－1，比對(duì)照組最大值(接種后6 d)高0.10 U·g－1(圖6)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在接種后1～3 d期間，經(jīng)GSE處理的獼猴桃果實(shí)PPO 活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但在接種后4～6 d 時(shí)，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)PPO活性卻顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖6 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)PPO 活性的影響Fig.6 Effects of GSE treatment on PPO activity of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.7 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)PAL 和POD 活性的影響

作為苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，PAL 與酚類(lèi)、木質(zhì)素、植保素以及類(lèi)黃酮等抗病物質(zhì)的合成密切相關(guān)[21]。POD 參與木質(zhì)素的合成，能促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，有利于提高植物體的抗病能力[22]。

接種擴(kuò)展青霉后，對(duì)照組獼猴桃果實(shí)PAL 活性呈先升高后下降再升高的變化趨勢(shì)，GSE 處理組果實(shí)PAL 活性呈現(xiàn)上下起伏的波動(dòng)變化(圖7-A)。處理組果實(shí)和對(duì)照組之間PAL 活性在接種后4～6 d 時(shí)差異顯著(P<0.05)。

獼猴桃接種擴(kuò)展青霉后，其果實(shí)POD 活性呈先升高后下降隨后升高再下降的趨勢(shì)，與果實(shí)總酚、總類(lèi)黃酮、CHI 等與植物體抗病相關(guān)的物質(zhì)變化趨勢(shì)基本一致。在接種后1 d，GSE 處理組獼猴桃果實(shí)POD 活性達(dá)到最高，為0.25 U·g－1，此時(shí)對(duì)照組果實(shí)POD 活性為0.048 U·g－1，其活性?xún)H為處理果實(shí)的20%左右。對(duì)照組果實(shí)POD 活性在接種后3 d 最高為0.14 U·g－1，此時(shí)處理果實(shí)POD 活性為0.17 U·g－1，仍高于對(duì)照組果實(shí)(圖7-B)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)POD 活性整體顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖7 GSE 處理對(duì)損傷接菌后的獼猴桃果實(shí)PAL 活性(A)和POD 活性(B)的影響Fig.7 Effects of GSE treatment on PAL activity (A) and POD activity (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

3 討論

本研究結(jié)果表明，GSE 作為外源因子可有效抑制由擴(kuò)展青霉引起的貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)青霉病的發(fā)生。GSE 處理不僅延遲了獼猴桃損傷接種擴(kuò)展青霉后果實(shí)發(fā)病率的上升，還抑制了獼猴桃果實(shí)青霉病病斑直徑的擴(kuò)大，提高了果實(shí)對(duì)擴(kuò)展青霉的抗性，增強(qiáng)了果實(shí)的抗病能力。這與GSE 對(duì)鴨梨黑斑病和青霉病的抑制作用相一致[8]。GSE 可抑制果實(shí)的發(fā)病率及病斑直徑擴(kuò)展，可能的原因是GSE 粗提物中含有多種具有抑菌以及提高果實(shí)抗病性的物質(zhì)[16]。

GSE 是從葡萄籽中分離提取的一種天然抗氧化物質(zhì)，其主要成分為低聚原花青素。原花青素是植物中一大類(lèi)由兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸和表兒茶素沒(méi)食子酸酯等單體聚合而成的，以黃烷－3－醇為主要結(jié)構(gòu)的聚多酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)[23]。此外，GSE 中還含有大量酚性羥基，可在體內(nèi)以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合自由基的方式有效清除體內(nèi)過(guò)量的自由基[24]，具有優(yōu)越的抑菌、抗氧化、清除自由基等重要作用[25]。Duran 等[13]研究證明，與不加入GSE 相比，加入GSE 的殼聚糖涂膜液能夠減少新鮮草莓表面的微生物含量，抑制病原菌的生長(zhǎng)。

酚類(lèi)物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物具有抑制病原菌生長(zhǎng)的作用，是植物抗病的機(jī)制之一[26]。類(lèi)黃酮不僅可以抵御活性氧及自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[27]，還能提高植物抗菌抗病毒的能力[28]。本研究結(jié)果表明，GSE 處理顯著提高了獼猴桃果實(shí)的總酚和總類(lèi)黃酮含量。這與多種誘抗劑如茉莉酸甲酯[29]、苯丙噻重氮[30]、銀杏葉提取物[16]的研究結(jié)論一致。

MDA 是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量可用于表示膜脂過(guò)氧化程度[31]。MDA 的大量積累會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞喪失正常功能，失去對(duì)病原菌的防御能力[32]。本試驗(yàn)經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實(shí)MDA 含量顯著降低，表明GSE 處理可降低細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，抑制獼猴桃的氧化損傷，從而提升獼猴桃果實(shí)的抗病性。也有研究表明，GSE 可降低香菇在4℃貯藏過(guò)程中的MDA 含量，減緩貯藏過(guò)程中細(xì)胞膜的損傷[14]。LOX 可啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致細(xì)胞屏障受損[33]。本試驗(yàn)中，獼猴桃果實(shí)經(jīng)GSE 處理后其LOX 活性顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明了GSE 具有抑制獼猴桃果實(shí)膜脂過(guò)氧化的功能。

CHI 和GLU 是植物中研究最廣泛、性質(zhì)最明確的兩類(lèi)病程相關(guān)蛋白，無(wú)論是單獨(dú)作用還是聯(lián)合作用，都有助于植物抵御病原體的侵染[34]?？共≌T導(dǎo)劑誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)與CHI 和GLU 活性升高有關(guān)，其抗病作用在楊梅[35]、蘋(píng)果[36]、桃[37]等果實(shí)的研究中已得到證明。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，GSE 處理提高了獼猴桃在損傷接種擴(kuò)展青霉后果實(shí)的CHI 和GLU 活性，這說(shuō)明GSE處理提升了獼猴桃果實(shí)的抗病性，對(duì)獼猴桃防御青霉菌侵染的效果明顯。

PPO、PAL 和POD 不僅參與植物體內(nèi)酚類(lèi)、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，還參與活性氧的清除[38－39]，具有抵御活性氧自由基傷害、增強(qiáng)植物體抗性的作用，是植物體內(nèi)重要的防御酶。研究證明植物抗病性的提高與誘抗劑處理后能夠誘導(dǎo)體內(nèi)防御相關(guān)的酶活性提高，從而降低對(duì)真菌侵染的敏感性密切相關(guān)[29，40－43]。如Pan 等[29]研究表明，茉莉酸甲酯可通過(guò)提高金魁獼猴桃果實(shí)內(nèi)POD 和PPO 活性，降低獼猴桃軟腐病的發(fā)生；熱水和山梨酸鉀單獨(dú)或者聯(lián)合處理均可提高徐香獼猴桃PPO、POD 和PAL 活性，抑制獼猴桃灰霉病的發(fā)生[41]。本試驗(yàn)中，GSE 處理顯著提高了獼猴桃果實(shí)POD 活性，從第4 天開(kāi)始顯著提高了PAL 活性，增強(qiáng)了果實(shí)多酚類(lèi)物質(zhì)的合成，提高了果實(shí)抗氧化特性。而GSE 處理并未一直提高PPO 活性，而是在前期顯著提升了獼猴桃果實(shí)的PPO 活性，但到后期處理組果實(shí)PPO 活性低于對(duì)照組果實(shí)。這可能是由于前期接種擴(kuò)展青霉后果實(shí)PPO 活性被誘導(dǎo)顯著提升以抵御病原入侵，但隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，獼猴桃果實(shí)抗性降低，PPO 活性也隨之下降。但其具體的原因還有待進(jìn)一步分析與探討。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，GSE 處理可以通過(guò)降低獼猴桃果實(shí)MDA 含量、LOX 活性，提高獼猴桃果實(shí)的總酚、總類(lèi)黃酮含量，提升獼猴桃果實(shí)CHI、GLU、PPO、PAL和POD 活性以抑制接種擴(kuò)展青霉后果實(shí)病情的發(fā)展，延緩果實(shí)發(fā)病率的上升，同時(shí)抑制果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大，GSE 對(duì)獼猴桃果實(shí)采后青霉菌侵染病害具有一定的抑制作用，對(duì)獼猴桃果實(shí)青霉病防治具有較好的作用。綜上，GSE 可作為綠色天然防腐劑應(yīng)用于果蔬貯藏保鮮。