不結(jié)球白菜BrABF1基因的克隆與功能分析

徐園園 李竹帛 周賀芳 王建軍 王 鎮(zhèn) 侯喜林 劉同坤

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2淮南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，安徽 淮南 232001；3 蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215008)

植物開花是由營養(yǎng)生長到生殖生長的標志，是植物生命活動中的重要過程[1－3]。同時，植物的開花時間是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個重要農(nóng)藝性狀，適宜的開花時間能保證農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟學(xué)意義。但開花時間的調(diào)控本身極為復(fù)雜，是植物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。前人通過研究十字花科模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的開花機制，總結(jié)出六大開花調(diào)控路徑:光周期途徑[4]、春化途徑[5]、赤霉素途徑[6]、自主途徑[7]、溫敏途徑和年齡途徑[8－9]。由此可知，高等植物的開花過程不僅受內(nèi)源因素(植物體內(nèi)的激素水平、植物衰老等)的影響，同時也受到外界環(huán)境因素(光照長短、低溫春化等)的影響。

脫落酸(abscisic acid，ABA)屬于半萜類物質(zhì)，作為內(nèi)源信使通常被認為是響應(yīng)各種環(huán)境脅迫的“應(yīng)激激素”，在植物對抗非生物脅迫和生物脅迫中起著重要作用[9]，如有研究表明噴施ABA 可提高油菜植株的抗寒性、越冬率和產(chǎn)量[10]。除此之外，ABA 貫穿幾乎所有植物的整個生長過程，如參與種子的萌發(fā)和休眠、抑制幼苗的生長、促進氣孔關(guān)閉、促進葉片和果實脫落、促進植物的衰老進程等[11－13]。目前也有研究證明ABA 還廣泛參與了植物的成花誘導(dǎo)、花芽分化及開花調(diào)控等過程[14]，如外源ABA 處理可顯著誘導(dǎo)荔枝葉片中ABA 的生成，同時提高荔枝的成花率[15]。但ABA 如何調(diào)控植物開花，還值得進一步深入探究。

不結(jié)球白菜(Brassica rapassp.chinensis)屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)植物，因其營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、生長周期短等特點在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要的地位[22]。不結(jié)球白菜的開花抽薹時間在品種間存在差異，品質(zhì)、產(chǎn)量也受開花時間影響[23]。實際生產(chǎn)表明，先期抽薹的不結(jié)球白菜產(chǎn)量和品質(zhì)均存在顯著下降現(xiàn)象[24]，但是其深層調(diào)控機理尚不明確。因此研究不結(jié)球白菜抽薹開花的調(diào)控機制對于提高其產(chǎn)量以及種質(zhì)創(chuàng)新具有重要的指導(dǎo)意義。

前期研究已初步發(fā)現(xiàn)BrABF3 參與調(diào)控不結(jié)球的開花時間，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究其同源基因BrABF1 對不結(jié)球開花時間調(diào)控的作用。本研究采用同源克隆的方法獲得BrABF1 基因序列，利用生物信息學(xué)方法對BrABF1 基因進行序列分析，采用亞細胞定位技術(shù)研究不結(jié)球白菜BrABF1 的空間表達，利用GUS 染色的方法探究其在擬南芥中的表達部位，利用轉(zhuǎn)基因擬南芥研究BrABF1 對開花時間的影響，以期為選育新品種、明確不結(jié)球白菜開花的分子機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室提供的不結(jié)球白菜品種蘇州青為試驗材料，用蒸餾水將種子清洗數(shù)次后，置于室內(nèi)潔凈的培養(yǎng)皿中催芽2～3 d，之后將種子播種在滅菌的基質(zhì)中，將其置于相對濕度為85%±5%，光/暗時間為16 h/8 h，光/暗溫度為22℃/18℃的人工氣候室中培養(yǎng)[25]。

1.2 DNA、RNA 的提取及cDNA 合成

待蘇州青植株長至四葉期時，取葉片0.2 g，在液氮中充分研磨，用植物基因組提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)提取葉片基因組DNA，作為克隆BrABF1 啟動子的模板。用RNA Simple Total RNA Kit (TaKaRa，大連)提取樣品總RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為克隆基因所需要的模板。用Nano－300 微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)檢測提取的DNA、總RNA 濃度和純度。

1.3 BrABF1 基因及其啟動子的克隆

從白菜數(shù)據(jù)庫中查找BrABF1 的序列并設(shè)計引物BrABF1-F/R，引物序列見表1。以蘇州青的cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系:模板1.0 μL，正、反引物各1.0 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸3 min，共35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。用10 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物并回收條帶正確的目的片段。將回收產(chǎn)物連接到 pMD18-T 載體(TaKaRa，大連)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH－5α 感受態(tài)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，挑取陽性克隆進行PCR 并測序。

克隆BrABF1 基因的啟動子時用不結(jié)球白菜蘇州青品種的DNA 作為模板，所用引物pBrABF1-F/R 利用NCBI 在線軟件Primer-BLAST 設(shè)計，引物序列見表1。后續(xù)試驗過程參考上文。

表1 所用的引物Table 1 Primers used

1.4 BrABF1 基因的生物信息學(xué)分析

用Bioxm 2.7 軟件分析BrABF1 基因序列的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。為分析BrABF1在進化過程中與其他物種中的親緣關(guān)系，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載不同物種ABF1 蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0 軟件對氨基酸序列進行比對，用MEGA 7.0 軟件對氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析。

絲木棉源于異木棉。三十多年前，異木棉由一顆種子從異國他鄉(xiāng)漂洋過海，來到廣州。它原產(chǎn)南美洲的阿根廷，樹干肥大，有突刺，像刺猬一樣，而樹高通常在十米到十五米之間，樹姿優(yōu)美，花艷密集。在南方許多城市，特別是在廣州，市民直呼它的學(xué)名——異木棉，因其繁花掛枝，粉色拂面，格外美麗，也有地方稱其為“美人樹”或“美麗異木棉”。在日本，異木棉叫白杜，別稱絲木棉、桃葉衛(wèi)矛。在華軟學(xué)院，絲木棉被譽為?；?。

應(yīng)用在線軟件PlantCARE(http:/ /bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/) 分析BrABF1啟動子序列中的順式作用元件。

1.5 Gateway 技術(shù)載體的構(gòu)建

1.5.1BrABF1 基因片段的PCR 擴增BrABF1 載體的構(gòu)建采用Gateway 技術(shù)，所用引物gateway-BrABF1-F/R 序列見表1，用高保真酶進行PCR 擴增，反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性30 s；98℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測，最后用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對目的片段進行膠回收。

1.5.2 BP 重組反應(yīng) 將上一步回收的PCR 產(chǎn)物與入門載體pENTRTM/D-TOPO? 進行重組反應(yīng)?？傮w系6.0 μL:PCR 產(chǎn)物2.0 μL、pENTRTM/D-TOPO? 載體1.0 μL、鹽溶液1.0 μL、ddH2O 2.0 μL，25℃反應(yīng)30 min。將反應(yīng)后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH－5α 感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含有50 mg·L－1卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日早晨挑取陽性單克隆搖菌測序，測序結(jié)果正確的即為重組質(zhì)粒(入門載體)pENTRTM/D-TOPO? －BrABF1。

1.5.3 構(gòu)建表達載體 反應(yīng)總體系6.0 μL:表達載體 pEarlyGate101 1.0 μL，pENTRTM/D-TOPO ? －BrABF1 2.0 μL，LR 酶混合物1.0 μL，TE Buffer(pH 值8.0)2.0 μL，25℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH－5α 感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含有50 mg·L－1卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆菌落進行搖菌測序，結(jié)果正確說明獲得表達載體pEarlyGate101－BrABF1-YFP。

1.5.4 構(gòu)建GUS 表達載體 構(gòu)建方法參考1.5.3，總體系6.0 μL:表達載體pFast-G04 1.0 μL，pENTRTM/D-TOPO? －BrABF1 2.0 μL，LR 酶混合物1.0 μL，TE Buffer(pH 值8.0)2.0 μL，25℃反應(yīng)4 h。轉(zhuǎn)化過程同1.5.3。

1.6 BrABF1 的亞細胞定位

將構(gòu)建好的融合表達載體pEarlyGate101－BrABF1－YFP 采用液氮凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，均勻涂布于含有50 mg·L－1卡那霉素和100 mg·L－1利福平的LB 平板上，將平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取陽性單克隆菌落進行搖菌測序，檢測結(jié)果正確的即為pEarlyGate101－BrABF1－YFP 轉(zhuǎn)化成功的GV3101菌株。

將陽性單克隆菌液在含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中28℃、180 r·min－1培養(yǎng)20 h，接著取1%體積分數(shù)的菌液進行擴大培養(yǎng)，當菌液的OD600值達到1.0左右時，收集菌株，4 000 r·min－1離心5 min。用終濃度為10 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－12-N－嗎啉乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic Acid，MES，pH 值5.7)、150 μmol·L－1乙酰丁香酮重懸菌體，使其OD600值為0.8，室溫放置5 h，將含有pEarlyGate101－BrABF1－YFP 的農(nóng)桿菌菌液用1 mL 的無針頭注射器注射于一月齡的煙草葉片背面，其中H2B-RFP 用于細胞核標記。注射后的煙草植株置于人工氣候室培養(yǎng)3 d 后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況并拍照記錄。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將GUS 表達載體pBrABF1:GUS 和過表達載體pEarlyGate101－BrABF1-YFP 采用液氮轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101(詳細轉(zhuǎn)化步驟見1.6)。將含有pBrABF1:GUS 和pEarlyGate101－BrABF1-YFP 的農(nóng)桿菌分別接種于5 mL 含利福平和卡那霉素的液體LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng)18 h 后將菌液轉(zhuǎn)移至200 mL 含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0，5 000 r·min－1離心5 min 收集菌株，用滲透緩沖液重懸，使OD600為0.8。用蘸花法將擬南芥的花序浸入重懸液，侵染1 min，每周侵染1 次，共侵染2～3 次。剛侵染完植株所收獲的種子記為T0代。之后將消毒后的T0代種子播種于具有潮霉素(Hygromycin B)和特美汀(Termetin)的MS 板上，篩選出pBrABF1:GUS和35S:BrABF1-YFP陽性植株。

1.8 GUS 組織染色

利用潮霉素抗性在MS 固體培養(yǎng)基上篩選pBrABF1:GUS 轉(zhuǎn)基因擬南芥至T3代，用濃度為1 mg·mL－1的X-Gluc(5－溴－4－氯－3－吲哚－β-D－葡萄糖苷酸)染色液對板上15 d 大的擬南芥進行GUS 染色:將植株置于90%的丙酮溶液中預(yù)冷10～15 min；染色液清洗1～2 次；將植株置于染色液中，抽真空2～3次，每次10 min；37℃保溫12 h；30%酒精脫色30 min；用含有50%酒精、37%甲醛、5%乙酸的脫色液脫色1次；70%酒精清洗1 次。染色結(jié)束后將植株置于體式顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.9 過表達轉(zhuǎn)基因植株開花時間統(tǒng)計分析

以野生型和BrABF1 過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T2代為材料，統(tǒng)計其在短日照條件下的開花時間。將兩種基因型的擬南芥種植于相對濕度為85%±5%，光/暗時間為8 h/16 h，光/暗溫度為22℃/18℃的人工氣候室中。將播種的日期計為0 d，統(tǒng)計其開花時所用的時間，統(tǒng)計開花時的基葉數(shù)，并用Excel 軟件進行t 檢驗顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrABF1 基因的克隆

以不結(jié)球白菜蘇州青的cDNA 為模板克隆出來的BrABF1 條帶如圖1-A 所示。序列分析表明，不結(jié)球白菜BrABF1 基因含有1 個1 104 bp 的ORF，共編碼367個氨基酸(圖1-B)，BrABF1 基因的GeneBank 登錄號為MT643821。

圖1 BrABF1 基因的PCR 擴增產(chǎn)物(A)及核苷酸、編碼氨基酸序列(B)Fig.1 PCR amplified product of BrABF1(A)and nucleotide sequence，its encoded amino acid sequence (B)

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1BrABF1 的氨基酸序列比對和進化分析 用DNAMAN 6.0 軟件對ABF1 氨基酸序列進行比對(圖2-A)，用MEGA 7.0 軟件對氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖2-B 所示。不結(jié)球白菜與甘藍型油菜(Brassica napus)、高山離子芥(Chorispora bungeana)、蘿卜(Raphanus sativus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、薺菜(Capsella rubella)、山萮菜(Eutrema salsugineum)、亞麻芥(Camelina sativa)、野甘藍(原變種)(Brassica oleraceavar.oleracea) 的同源性分別為89.30%、65.25%、83.46%、70.47%、72.15%、65.05%、71.22%、89.30%；與不結(jié)球白菜、甘藍型油菜和野甘藍(原變種)的同源性最高，親緣性關(guān)系最近。

圖2 不結(jié)球白菜與其他物種ABF1 同源氨基酸序列比對(A)及進化樹分析(B)Fig.2 The alignment of amino acid of ABF1 from non-heading Chinese cabbage and other plants(A) and phylogentic tree(B)

2.2.2BrABF1 啟動子序列分析 通過用PlantCARE在線軟件分析BrABF1 啟動子序列(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BrABF1 啟動子序列中除了有大量的TATA-box 和CAAT-box 啟動子基本核心元件之外，還有很多光響應(yīng)元件、參與激素反應(yīng)的順式作用元件，以及少量參與低溫響應(yīng)的順式作用元件、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件等。這些結(jié)果表明光照條件、植物激素以及逆境脅迫可能參與BrABF1 基因的表達調(diào)控。

表2 BrABF1 啟動子區(qū)包含的順式作用元件Table 2 Cis-acting elements in BrABF1 promoter

2.3 BrABF1 的亞細胞定位分析

利用共聚焦顯微鏡觀察注射后的本氏煙草葉片中的熒光，結(jié)果表明(圖3):pEarleyGate101－BrABF1－YFP 在黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)激發(fā)光下可以看到明顯的黃色熒光，核標簽在紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)激發(fā)光下顯示紅色熒光，且黃色熒光和紅色熒光重合，表明BrABF1 蛋白定位在細胞核上。說明BrABF1 基因可能具有編碼蛋白的功能。

2.4 GUS 組織染色

GUS(β-D-glucuronidase，β-D－葡糖醛酸酶)染色實驗中，在體視顯微鏡下觀察到pBrABF1:GUS 轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉脈部分幾乎均被染色，而野生型擬南芥的葉脈處則沒有被染色(圖4)。說明能在pBrABF1:GUS 轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉脈處檢測到GUS 蛋白的表達，即:由BrABF1 驅(qū)動的GUS 蛋白主要在葉脈中特異性表達。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株開花時間統(tǒng)計分析

通過對野生型和35S:BrABF1-YFP過表達轉(zhuǎn)基因植株在短日照條件下的開花時間統(tǒng)計分析可知，轉(zhuǎn)基因植株開花時的基葉數(shù)明顯多于野生型植株(圖5-A)；轉(zhuǎn)基因植株的開花時間明顯晚于野生型植株(圖5－B，C)。表明在短日照條件下，BrABF1 基因在植物的開花過程中起抑制作用。

3 討論

植物在適宜的外部環(huán)境中，生長到一定階段的時候，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理結(jié)構(gòu)均會發(fā)生改變，其中由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變過程最為典型[26－27]，這個過程即高等植物的開花過程。有研究表明，不結(jié)球白菜抽薹開花性狀均受2 對主基因控制[28]。此外，該過程受多種激素調(diào)控，其中植物激素起到了至關(guān)重要的作用[29]。ABA 是植物的五大內(nèi)源激素之一，眾多研究表明，ABA 對植物開花具有重要影響，如劉揚等[30]認為適量ABA 處理可以誘導(dǎo)青葙花芽形成；喻雄等[31]研究表明ABA 有利于油茶花芽的生理分化和生長，高含量的ABA 則會促進花的凋落。而外源ABA 的施用可能會推遲擬南芥的開花時間[32]。

開花是影響不結(jié)球白菜品質(zhì)和產(chǎn)量的一個重要因素，ABF1 是植物組織中ABA 介導(dǎo)的滲透壓信號傳導(dǎo)的主要下游轉(zhuǎn)錄因子[33]，其基因表達水平低于其他ABF基因，但同樣在干旱脅迫中起著重要作用[20]。酵母單雜試驗表明，ABF1 能調(diào)節(jié)AtTPPI的表達應(yīng)對干旱脅迫[34]，本研究以不結(jié)球白菜蘇州青的cDNA 為模板克隆出BrABF1 基因，通過對其啟動子序列分析可知，BrABF1 基因的表達可能與光照、植物激素以及脅迫環(huán)境等因素有關(guān)；亞細胞定位試驗結(jié)果表明，BrABF1 蛋白定位在細胞核上，說明BrABF1 基因可能具有編碼蛋白的功能；GUS 染色結(jié)果表明BrABF1 啟動子驅(qū)動的GUS 蛋白主要在擬南芥的葉脈中特異性表達；通過統(tǒng)計短日照條件下野生型和轉(zhuǎn)基因植株的開花時間推測BrABF1 基因可能抑制植物的開花。有研究表明，包括ABI5 和其他的ABF 轉(zhuǎn)錄因子(如ABF1、ABF3 和ABF4)的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子能直接促進FLC的表達，在ABA 介導(dǎo)的開花時間中起抑制作用[35]。

圖3 BrABF1 在本氏煙草葉片中的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of BrABF1 in leaves Nicotiana benthamiana

圖4 擬南芥幼苗GUS 染色Fig.4 GUS staining of Arabidopsis seedlings

圖5 短日照條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時間統(tǒng)計分析(A 和B)及與野生型植株表型對比(C)Fig.5 Statistical analysis of flower time in transgenic Arabidopsis thaliana (A and B) and phenotypic comparison with wide type plants (C) under short-day conditions

基于上述研究結(jié)果，推測BrABF1 不僅參與植物ABA 信號途徑的抗逆反應(yīng)，而且能調(diào)控植物開花。這對今后進一步深入研究ABA 介導(dǎo)的不結(jié)球白菜開花具有很大的借鑒意義，可為提高不結(jié)球白菜的商品價值奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從不結(jié)球白菜中克隆出BrABF1 基因，BrABF1 基因ORF 序列長1 104 bp，編碼367 個氨基酸，其表達可能與光照、植物激素以及脅迫環(huán)境等因素有關(guān)。BrABF1 蛋白定位在細胞核上，主要在植物的葉脈中特異性表達。BrABF1 過表達植株在短日照條件下開花時間延遲，推測BrABF1 基因能抑制不結(jié)球白菜的開花。