水稻心白突變體xb1的淀粉理化特性分析

呂 軍 姜秀英 劉 軍 解文孝 韓 勇 沈 楓

(遼寧省水稻研究所，遼寧 沈陽 110101)

隨著生活水平的日益提高，人們對(duì)稻米品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)有了更高的要求。淀粉是稻米胚乳的主要成分，其組成、結(jié)構(gòu)和理化特性決定了稻米的外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)[1－3]。因此，深入研究水稻淀粉特性，對(duì)改良水稻品質(zhì)具有十分重要的意義。

堊白是由于籽粒灌漿不充分，胚乳中的淀粉和蛋白顆粒排列疏松，相互間存在的空隙影響了光的透射而形成的白色不透明部分。根據(jù)其在胚乳上的不同位置可分為腹白、背白和心白等多種類型[4－6]。胚乳淀粉排列不緊密，導(dǎo)致米粒在加工過程中易斷裂，整精米率降低，蒸煮后米粒斷裂，影響食味品質(zhì)[7－8]。

長期以來，已利用自然突變和人工誘變獲得了大量胚乳淀粉突變體材料，如堊白突變體、高直鏈淀粉突變體、糯性突變體、粉質(zhì)突變體、糖質(zhì)突變體、暗色突變體、皺縮突變體等[9－12]，其中已報(bào)道的堊白突變體有g(shù)pa1、osbt1、ospk2、flo4、flo5 等。并對(duì)這些突變體開展了淀粉合成相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)這些突變體的淀粉特性均發(fā)生了一定的變化，如直鏈淀粉含量、淀粉粘滯特性、熱力學(xué)特性、支鏈淀粉鏈長分布等。進(jìn)一步通過基因克隆及功能研究，逐步明確了其在淀粉合成及調(diào)控中的作用。

Wang 等[13]發(fā)現(xiàn)突變體gpa1 呈現(xiàn)白心胚乳，胚乳中復(fù)合淀粉顆粒呈圓形且包裹松散，該突變基因OsRab5a位于第12染色體，編碼一個(gè)GTP酶(GTPase)，參與胚乳細(xì)胞液泡中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因GIF1，位于第4 染色體，參與籽粒灌漿早期的碳源分配，該基因突變后產(chǎn)生心白，粒重、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量降低。Li 等[14]發(fā)現(xiàn)突變體osbt1呈現(xiàn)心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量降低，支鏈淀粉中短鏈增加，中長鏈減少，復(fù)合淀粉顆粒發(fā)育不正常，該突變基因OsBT1 編碼ADPG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在水稻種子發(fā)育過程中參與調(diào)控淀粉合成和復(fù)合淀粉顆粒的形成。Cai 等[15]發(fā)現(xiàn)突變體ospk2 呈現(xiàn)心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降，蛋白和脂肪含量增加，支鏈淀粉中中短鏈比例降低，中長鏈增多，該突變基因OsPK2 編碼一種質(zhì)體丙酮酸激酶(pyruvate kinase PK)，在淀粉合成、復(fù)合顆粒形成和籽粒灌漿過程中起重要作用。Flo4 是一個(gè)T-DNA 插入突變體，胚乳呈現(xiàn)心白表型，粒重下降，蛋白質(zhì)含量和脂肪含量增加，該突變基因OsPPDKB編碼丙酮酸磷酸雙激酶，在水稻胚乳淀粉代謝和結(jié)構(gòu)中起重要作用[16]。flo5 突變體籽粒呈現(xiàn)心白表型，粒重減小，支鏈淀粉的長鏈[聚合度(degree of polymerization，DP)≥30]顯著減少，快速黏度分析儀(rapid viscosity analyzer，RVA)譜發(fā)生顯著變化，突變基因SSIIIa編碼淀粉合成酶，主要參與支鏈淀粉B2-B4 鏈的延伸[17－18]。SSIIa和SSIIIa雙突變植株中，胚乳支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，短鏈和長鏈減少，中長鏈含量增加，雙突植株表現(xiàn)出明顯的堊白表型[19]。近幾年，一系列水稻flo突變體被鑒定，包括flo12、flo14、flo15、flo16 等[20－24]，這些突變體的突變基因有些還未被克隆，有些雖已被克隆，但調(diào)控的分子機(jī)理尚不清晰。水稻胚乳淀粉的合成與調(diào)控是非常復(fù)雜又精細(xì)的過程，因此還需要挖掘更多胚乳淀粉突變體，進(jìn)一步解析淀粉的生物合成途徑與調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)，為稻米品質(zhì)改良提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

本研究以經(jīng)甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)誘導(dǎo)粳稻品種遼星1 號(hào)獲得的心白突變體xb1 為材料，對(duì)其表型特征及淀粉理化特性進(jìn)行了分析，旨在了解心白突變的形成機(jī)制，為進(jìn)一步的突變基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 突變體材料

遼星1 號(hào)經(jīng)EMS 誘變處理，在其后代對(duì)胚乳堊白性狀進(jìn)行篩選，從中發(fā)現(xiàn)一個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳的、表型明顯的心白突變體，命名為xb1。野生型遼星1 號(hào)和突變體xb1 種植于遼寧省水稻研究所試驗(yàn)地，成熟期收獲籽粒，自然晾干，并在室溫下保存。

1.2 突變體表型特征

利用Laser Jet M1136 掃描儀(惠普中國)對(duì)野生型和突變體xb1 的籽粒、糙米和糙米橫截面進(jìn)行拍照。利用游標(biāo)卡尺測(cè)量10 粒種子的粒長、粒寬和粒厚，求平均值，重復(fù)3 次。隨機(jī)選取1 000 粒種子稱重，求平均值，重復(fù)3 次。

1.3 淀粉粒結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

分別選取野生型和突變體xb1 的完整精米樣品，用刀片將米粒橫向切開，使橫斷面向上，利用真空鍍膜儀對(duì)橫斷面鍍金后，在JSM－7500F 掃描電鏡(日本電子)上觀察和拍照。

1.4 淀粉粒的粒徑分布

淀粉提取:將精米用3 倍體積的亞硫酸鈉水溶液浸泡，精米充分吸收膨脹后，轉(zhuǎn)移至勻漿機(jī)中勻漿粉碎，隨后將勻漿液轉(zhuǎn)移至200 目篩網(wǎng)中過濾，并用亞硫酸鈉水溶液充分清洗濾渣，收集濾液，靜置過夜，倒掉上清液，用新的亞硫酸鈉溶液清洗，重復(fù)5～8 次，待淀粉呈白色，上清液透明時(shí)，徹底倒掉上清液，將淀粉自然晾干，轉(zhuǎn)移至恒溫箱中水分平衡1 周，研缽研磨分散，過200 目樣品篩。

取100 mg 淀粉于干凈EP 管中，加入1 mL 75%酒精，渦旋混勻后超聲混勻，利用Matersizer 3000 激光粒度分析儀(Malvern Instruments Ltd，Worcestershire，英國)進(jìn)行粒度分布測(cè)定，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.5 總淀粉、直鏈淀粉和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

總淀粉含量測(cè)定:稱取100 mg 淀粉于15 mL 試管中，加入4 mL 80%乙醇，70℃放置2 h，期間漩渦混勻。12 000 r·min－1離心10 min，加4 mL 80%乙醇，重復(fù)清洗3 次。小心倒出上清，加入0.2 mL 80%乙醇，渦旋混勻，再加入3 mL 耐熱α－淀粉酶，沸水浴孵育6 min，期間間斷渦旋混勻。將試管放置于50℃的水浴鍋中，然后加入0.1 mL 淀粉葡糖苷酶，渦旋混勻，50℃孵育30 min。用蒸餾水調(diào)節(jié)體積。取0.1 mL 至新的試管中，加入3 mL GOPOG 試劑，渦旋混勻，于50℃孵育20 min，用1510－04201 多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司)于510 nm 波長下測(cè)定吸光度值。

直鏈淀粉含量測(cè)定:稱取10 mg 淀粉于EP 管中，加入100 μL 乙醇，900 μL NaOH 溶液，渦旋混勻。沸水煮10 min，待冷卻后定容至10 mL。取0.5 mL 上清于離心管中，加入0.1 mL 乙酸，0.2 mL 碘化鉀溶液，定容至10 mL，室溫放置10 min 顯色，用1510－04201 型多功能酶標(biāo)儀于620 nm 處測(cè)定吸光度值。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定: 采用凱氏定氮法，利用KJELTEC2300 凱氏定氮儀(丹麥FOSS 公司)測(cè)定野生型和突變體的蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3 次，取平均值。

1.6 支鏈淀粉鏈長分布

取已純化淀粉5 mg，重懸于5 mL 雙蒸水中，沸水浴60 min，間斷渦旋混勻。取2.5 mL 的糊化樣品，加入125 μL 醋酸鈉，5 μL 三氮化鈉和5 μL 異淀粉酶，38℃放置24 h。加入395 μL 硼氫化鈉，室溫放置24 h。取600 μL 于離心管中，室溫氮吹干燥。溶于600 μL 流動(dòng)相中，12 000 r·min－1離心5 min，取上清，用ICS5000 離子色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，采用電化學(xué)檢測(cè)器及DionexTMCarboPacTMPA200(3.0 mm×250 mm)離子色譜柱。流動(dòng)相A(100%水溶液)，流動(dòng)相B(100 mmol·L－1NaOH、1 mol·L－1NaAC)，流動(dòng)相C(100 mmol·L－1NaOH)，流速為0.4 mL·min－1，柱溫為30℃。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.7 淀粉的粘滯特性

采用3D 型RVA 快速黏度分析儀(澳大利亞Newport Scientific 公司)測(cè)定。儀器自動(dòng)讀出的一級(jí)參數(shù)有:熱漿黏度(hot paste viscosity，HPV)、峰值黏度(peak paste viscosity，PKV)、冷膠黏度(cool paste viscosity，CPV)、糊化溫度(pasting temperature，PaT)，二級(jí)參數(shù)有:崩解值(breakdown viscosity，BDV ＝PKVHPV)、消減值(setback viscosity，SBV ＝CPV-PKV)、回復(fù)值(consistency viscosity，CSV ＝CPV-HPV)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.8 淀粉的熱力學(xué)特性

采用200-F3 差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry，DSC，德國Netzsch 公司)測(cè)量淀粉的熱力學(xué)特性。稱取5 mg 米粉于鋁盤中，加入10 μL 超純水，密封2 h。升溫速率為10℃·min－1，溫度范圍為20～120℃。測(cè)定后根據(jù)測(cè)定曲線的吸熱峰邊界和面積，分析得到糊化起始溫度(onset temperature，To)、峰值溫度(peak temperature，Tp)、終止溫度(conclusion temperature，Tc)熱焓值(enthalpy of gelatinization，△H)和糊化距離(gelatinization range，Tr ＝Tc-To)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型特征

突變體xb1 是粳稻品種遼星1 號(hào)經(jīng)EMS 誘變后篩選得到的能穩(wěn)定遺傳的胚乳堊白突變體，其種子表型與野生型(WT)相似(圖1-A)，而突變體xb1 的糙米較野生型相比，中心呈現(xiàn)白色粉質(zhì)不透明，邊緣一圈呈現(xiàn)透明，即心白表型(圖1-B、C)。在籽粒表型性狀上，突變體xb1 種子的粒長與野生型無顯著差異(圖1-D)，但粒厚顯著低于野生型(圖2-F)，粒寬和千粒重極顯著降低(圖1-E、G)。

2.2 突變體的淀粉粒結(jié)構(gòu)和淀粉粒徑分布

利用掃描電鏡對(duì)野生型和突變體xb1 糙米的橫切面進(jìn)行觀察，野生型胚乳中的淀粉顆粒大小均一，排列較緊密，相互嵌合擠在一起呈現(xiàn)規(guī)則的多面體結(jié)構(gòu)(圖2-A、B、C)，而突變體xb1 糙米的不透明部位胚乳中的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，顆粒與顆粒之間存在較大的間隙，形成卵圓形或正圓形(圖2-D、E、F)，說明突變體xb1 的淀粉合成過程中出現(xiàn)了異常，導(dǎo)致淀粉結(jié)構(gòu)的改變。

利用激光粒度分析儀對(duì)淀粉粒的粒徑值和粒徑分布進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示(圖3)，突變體xb1 與野生型的淀粉粒大小分布相似，均呈單峰分布，但其分布曲線的峰值明顯高于野生型，且淀粉顆粒的大小分布范圍也相對(duì)集中。突變體xb1 的平均粒徑(11.05 μm)略小于野生型的平均粒徑(11.57 μm)，但淀粉粒粒徑值大于13 左右的淀粉粒數(shù)量明顯低于野生型。說明淀粉顆粒的粒徑分布受到心白突變的影響。

2.3 突變體的種子成分分析

對(duì)突變體和野生型種子成分分析結(jié)果顯示(圖4)，突變體的蛋白質(zhì)含量極顯著升高，野生型種子的蛋白質(zhì)含量為8.8%，突變體升高至11.2%。突變體的總淀粉含量極顯著減少，由81.5%減少到78.2%，而直鏈淀粉含量無顯著變化，說明該突變并未影響到直鏈淀粉的合成，而與蛋白質(zhì)和淀粉中支鏈淀粉的積累存在密切的聯(lián)系。

2.4 突變體的支鏈淀粉鏈長分布

為進(jìn)一步分析突變體中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)，對(duì)突變體xb1 和野生型的支鏈淀粉的鏈長分布進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，突變體種子的支鏈淀粉鏈長分布發(fā)生了明顯變化(圖5)，與野生型相比，突變體xb1 的聚合度(DP)在6～9 之間的短鏈及25～35 之間的中長鏈比例有所增加，而DP 值在10～24 之間的中短鏈及36～50 之間的長鏈比例有所減少，說明突變體xb1 中支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.5 突變體淀粉的熱力學(xué)特性

由表1 和圖6 可知，突變體xb1 的峰值溫度(Tp)與野生型相近，起始溫度(To)和糊化距離(Tr)均略高于野生型，但差異不顯著，而終止溫度(Tc)顯著高于野生型，熱焓值(△H)極顯著高于野生型。表明該突變不會(huì)對(duì)糊化溫度產(chǎn)生太大影響，但會(huì)造成熱能值顯著提高。

2.6 突變體淀粉的粘滯特性

利用快速黏度分析儀RVA 對(duì)突變體與野生型的黏度特性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，兩者的淀粉黏度存在明顯差異(表2 和圖7)。從RVA 譜特征值看，突變體xb1除了糊化溫度與野生型相近外，其他參數(shù)均發(fā)生了極顯著的變化，突變體xb1 的熱漿黏度(HPV)、峰值黏度(PKV)、冷膠黏度(CPV)和消減值(SBV)分別較野生型升高了55.9%、27.0%、33.1%和111.7%。崩解值(BDV)和回復(fù)值(CSV)分別較野生型降低了34.6%和5.8%。

圖1 野生型和突變體xb1 的表型分析Fig.1 Phenotypic analysis of wild type and xb1 mutant

表1 野生型與突變體xb1 淀粉的DSC 熱力學(xué)參數(shù)Table 1 DSC thermal parameters of wild type and xb1 mutant

圖2 野生型和突變體xb1 的掃描電鏡觀察Fig.2 Observation of scanning electron micrographs of the wild type and xb1 mutant

表2 野生型與突變體xb1 的RVA 譜主要參數(shù)Table 2 Major parameters of RVA profiles in wild type and xb1 mutant

圖3 野生型與突變體xb1 胚乳淀粉粒的粒徑值和粒徑分布Fig.3 Starch particle size and distribution of the wild type and xb1 mutant

3 討論

堊白不僅影響稻米的外觀品質(zhì)，而且影響稻米的加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)，因而直接決定了稻米的市場價(jià)格和受歡迎程度[25－26]。而堊白的形成機(jī)制較為復(fù)雜，與水稻植株內(nèi)“源庫流”的協(xié)調(diào)、籽粒灌漿動(dòng)態(tài)及胚乳內(nèi)淀粉的形成和積累密切相關(guān)，同時(shí)還易受環(huán)境條件的影響，因此，堊白性狀的研究是當(dāng)前水稻品質(zhì)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[27－31]。本研究篩選到一個(gè)穩(wěn)定遺傳的心白突變體xb1，其籽粒的粒長未發(fā)生明顯改變，但粒寬、粒厚和粒重顯著低于野生型。電鏡掃描結(jié)果顯示突變體xb1 的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，呈現(xiàn)卵圓形或正圓形。激光粒度儀測(cè)定結(jié)果顯示突變體xb1 的淀粉顆粒的粒徑分布發(fā)生了改變。說明突變體xb1 的淀粉合成過程發(fā)生了異常，導(dǎo)致淀粉粒結(jié)構(gòu)和分布發(fā)生改變。

圖4 野生型與突變體xb1 的理化性質(zhì)Fig.4 Physicochemical properties of wild type and xb1 mutant

圖5 野生型與突變體xb1 支鏈淀粉鏈長分布Fig.5 Chain length distribution profiles of amylopectin in wild type and xb1 mutant

淀粉是胚乳的主要成分，由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分組成。本研究結(jié)果表明，突變體xb1 在直鏈淀粉含量沒有發(fā)生明顯變化的前提下，總淀粉含量極顯著降低，說明淀粉中支鏈淀粉含量極顯著減少。同時(shí)支鏈淀粉的鏈長分布也發(fā)生了顯著變化，相較于野生型，突變體xb1 的聚合度(DP)在6～9 之間的短鏈及25～35 之間的中長鏈比例增加，而DP 值在10～24 之間的中短鏈及36～50 之間的長鏈比例減少。前人研究表明，支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是決定淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及其功能特性的關(guān)鍵，也是造成直鏈淀粉含量相近的水稻品種間蒸煮食味品質(zhì)差異的主要原因[32－33]。支鏈淀粉的生物合成較為復(fù)雜，主要由可溶性淀粉合成酶(SSS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(DBE)共同催化合成。Satoh 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，突變體sbe1 的種子具有正常的表型，但中鏈(DP12～21)和長鏈(DP>37)減少，而短鏈(DP<10)和中長鏈(DP24～34)有所增加。本研究中突變體xb1 的支鏈淀粉鏈長的變化特點(diǎn)，與突變體sbe1 的變異特點(diǎn)一致，但突變體xb1 是否含有sbe1 的等位基因突變型，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 突變體xb1 與野生型的淀粉熱力學(xué)曲線Fig.6 DSC thermograms of starch in wild type and xb1 mutant

圖7 野生型與突變體xb1 的RVA 譜Fig.7 RVA profiles of wild type and xb1 mutan

淀粉結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的理化指標(biāo)的改變。目前關(guān)于稻米淀粉結(jié)構(gòu)與淀粉理化特性的關(guān)系，不同研究者的研究結(jié)論不盡相同。Vandeputte 等[35]認(rèn)為DP6～9 的短鏈相對(duì)數(shù)量與稻米淀粉的糊化起始溫度(To)、最高溫度(Tp)、終結(jié)溫度(Tc)及起始成糊溫度(pasting temperature，PT)呈負(fù)相關(guān)，而DP12～22 鏈長呈現(xiàn)相反結(jié)果。賀曉鵬等[36]研究指出，支鏈淀粉不同鏈長范圍的支鏈數(shù)量比例主要與淀粉的糊化溫度相關(guān)，而與淀粉的膠稠度和RVA 特征值關(guān)系不密切。而突變體xb1 淀粉的糊化起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Tc)和糊化距離(Tr)均未發(fā)生明顯改變，這與RVA 譜參數(shù)中的糊化溫度較野生型沒有明顯差異的結(jié)論一致。這一結(jié)果可能是直鏈淀粉含量未發(fā)生改變導(dǎo)致的，即突變體xb1 淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量關(guān)系較為密切。與此同時(shí)，突變體xb1 的RVA 譜特征值均發(fā)生了顯著改變，DP6～9、DP25～35的增加和DP10～24、DP36～50 的減少，使熱漿黏度(HPV)、峰值黏度(PKV)、冷膠黏度(CPV)和消減值(SBV)極顯著提高，崩解值(BDV)和回復(fù)值(CSV)極顯著降低。

4 結(jié)論

水稻心白突變體xb1 的直鏈淀粉含量相對(duì)野生型未有明顯改變，其糊化溫度也沒有明顯差異，進(jìn)一步證實(shí)淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量密切相關(guān)。突變體xb1 的支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)中，DP6～9(短鏈)、DP25～35(中長鏈)的增加和DP10～24(中短鏈)、DP36～50(長鏈)的減少，使RVA 譜特征值均發(fā)生顯著改變，說明淀粉的粘滯特性受支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)的影響。本研究通過分析心白突變體xb1 的淀粉理化性質(zhì)，有助于更深入了解淀粉合成、堊白發(fā)生機(jī)理，為進(jìn)一步克隆該突變基因及稻米品質(zhì)改良奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。