青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)體系的建立

楊 帆，胡章薇，嚴(yán)浩浩，劉耀霞，張學(xué)飛，閆佳會(huì)，侯 璐，姚 強(qiáng)

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016)

青稞(Hordeumvulgare)也叫裸大麥，是大麥的一種特殊類型，也是青藏高原最具特色的農(nóng)作物之一。因適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，青稞在高海拔藏區(qū)農(nóng)牧民的食物結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重、不可替代的地位。病害是影響青稞生產(chǎn)的重要因素，其中由大麥堅(jiān)黑粉菌(Ustilagohordei)引起的堅(jiān)黑穗病和裸黑粉菌(Ustilagonuda)引起的散黑穗病是青稞生產(chǎn)上的重要病害，這2種黑穗病均為種子傳播的系統(tǒng)性病害。青稞發(fā)病后均產(chǎn)生黑粉狀病穗，單株產(chǎn)量損失率高達(dá)100%，同時(shí)種子帶菌亦加重了翌年的再侵染為害。研究表明,使用殺真菌的種子處理劑和種植抗性品種，可有效控制青稞黑穗病害[1]，但青稞屬于小宗作物，關(guān)于其抗黑穗病方面的育種資源和品種較少，生產(chǎn)上主要采用播前藥劑拌種防治黑穗病。因農(nóng)戶無法掌握青稞種子的帶菌量是否達(dá)到防治指標(biāo)，盲目采取播前藥劑拌種，造成青稞田間藥劑殘留嚴(yán)重、大面積環(huán)境污染。因此檢測(cè)青稞種子的帶菌量，依據(jù)帶菌程度進(jìn)行播前種子處理，嚴(yán)把健康良種關(guān)口，是青稞黑穗病綠色防治的重要技術(shù)手段。

種傳病害的常規(guī)檢測(cè)是將種子放置在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再進(jìn)行病原體形態(tài)特征觀察，由于病害不同，所需培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法和病菌的生長速度亦有所不同，以此方法確認(rèn)種子是否攜帶病原菌耗時(shí)且費(fèi)力。因此迫切需要建立一種簡單、快速和有效的種子帶菌量檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由Notomi等[2]報(bào)道的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的4條正反向外引物和正反向內(nèi)引物，在59～67 ℃恒溫條件下利用高活性鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，特異、高效、快速的擴(kuò)增靶基因。該檢測(cè)體系的靈敏度是普通PCR的100倍。這種特異、高效、快速的分子檢測(cè)技術(shù)已成功應(yīng)用于真菌[3-7]、細(xì)菌、病毒[8]等的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，加入2條環(huán)引物可加快LAMP反應(yīng)速度，使整個(gè)反應(yīng)時(shí)間縮短1/3到1/2[9]。LAMP結(jié)果可通過電泳儀[10]、real-time PCR儀[10]及濁度儀[11]進(jìn)行檢測(cè)，還可通過SYBR Green I[12]、鈣黃綠素[13]、羥基奈酚藍(lán)[14]染色后用肉眼識(shí)別。鑒于LAMP檢測(cè)過程操作簡單，反應(yīng)時(shí)間短，結(jié)果易于判斷，本研究基于青稞黑穗病的ITS基因序列設(shè)計(jì)、篩選最佳引物組，利用最佳引物組對(duì)LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，建立以實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線和SYBR Green I染色為雙重判定標(biāo)準(zhǔn)的青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)技術(shù)，為青稞黑穗病的便捷檢測(cè)和綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試病原菌：青稞黑穗病病菌采自青海青稞主產(chǎn)區(qū)具有典型癥狀的堅(jiān)黑穗病和散黑穗病的病穗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定分別為大麥堅(jiān)黑粉菌(Ustilagohordei)和裸黑粉菌(Ustilagonuda)；對(duì)比菌種選用青稞上常見病害的病原菌(詳見表1)，供試病原菌均由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 用于LAMP檢測(cè)的青稞病原菌信息Table 1 Isolates of barely disease used to test species-specific of LAMP

試劑：真菌基因組DNA提取試劑盒，OMEGA Bio-Tek公司；Prime STAR Max Premix (2×)、dNTPs 10 mmol/L，TaKaRa公司；Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase(10×Isothermal Amplification Buffer、MgSO4、Bst DNA聚合酶)，美國NEB公司；甜菜堿5 mol/L，美國Sigma-Aldrich公司；SYBR Green Ⅰ，北京索萊寶科技有限公司。

儀器：Monad MiniSpeed 3300離心機(jī)，北京必吉生物科技有限公司；PowerPac Universal電泳儀、BBx24B細(xì)胞組織破碎儀、PCR儀，美國BIO-RAD公司；ABI 7500 RT-PCR儀，美國Applied Biosystems公司；NanoDrop OneC微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌DNA提取及測(cè)序 黑粉菌的DNA提?。簩⒋篼湀?jiān)黑粉菌和裸黑粉菌冬孢子粉分別放入加有鋼珠(直徑0.2 mm)的1.5 mL離心管內(nèi)，加入緩沖液后經(jīng)細(xì)胞組織破碎儀破碎10 min；其他對(duì)照病原菌分別于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后刮取菌絲,放于裝有直徑2 mm鋼珠的1.5 mL離心管內(nèi)，液氮冷凍后進(jìn)行組織破碎6 min。病原菌總DNA采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取，具體操作參照試劑盒說明，獲得的DNA稀釋后于―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將提取的DNA進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，選用的引物為真菌通用引物(ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)。PCR擴(kuò)增體系為：DNA 2 μL、Prime STAR Max Premix (2×) 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL，滅菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 獲得ITS序列后利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選大麥堅(jiān)黑粉菌(U.hordei)和裸黑粉菌(U.nuda)與其他病原菌同源性低的區(qū)段，并利用在線軟件PrimerExploreV5(http:// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設(shè)計(jì)青稞黑穗病菌的LAMP引物，共生成引物序列3組，詳見表2，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 用于青稞黑穗病菌LAMP測(cè)試設(shè)計(jì)的引物組信息Table 2 Designed primer set for LAMP detection of barley smut

1.2.3 LAMP引物組的篩選 最佳引物組的確定采用Bst 2.0 WarmStart DNA Kit方法，反應(yīng)體系為Mix 12.5 μL，引物(40 μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、5 μmol/L外引物F3/B3、10 μmol/L環(huán)引物L(fēng)F/LB)2.5 μL，熒光染料0.5 μL，病原菌DNA模板1 μL，無菌去離子水補(bǔ)足25 μL。

實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)條件為65 ℃ 70 min，間隔1 min讀取熒光。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線確定最適引物組。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化 LAMP檢測(cè)體系的建立：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、dNTPs(10 mmol/L)3.5 μL、MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL、Bst DNA聚合酶(8 000 U/mL) 1 μL、引物(40 μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、5 μmol/L外引物F3/B3、10 μmol/L環(huán)引物L(fēng)F/LB各1 μL)6 μL、SYBR Green Ⅰ(1∶1 000)1.5 μL、20 ng/μL菌株DNA 2 μL，無菌去離子水補(bǔ)足25 μL。合蓋后輕擊底部使溶液充分混合并瞬時(shí)離心，最后加入20 μL石蠟油。擴(kuò)增反應(yīng)條件為65 ℃ 60 min，間隔1 min讀取熒光。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線和SYBR Green Ⅰ染色對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行雙重判定，其中擴(kuò)增曲線呈“S”型為陽性，呈直線為陰性；加入SYBR Green Ⅰ染料0.5 μL后，反應(yīng)體系呈綠色為陽性，呈橙色為陰性。

LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化：在上述檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上對(duì)dNTPs、甜菜堿、Mg2+、Bst DNA聚合酶的濃度及反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其中dNTPs設(shè)1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L 5個(gè)濃度；甜菜堿設(shè)0，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 5個(gè)濃度；Mg2+設(shè)4，6，8，10 mmol/L 4個(gè)濃度；Bst DNA聚合酶設(shè)80，160，240，320 U/mL 4個(gè)濃度；陰性對(duì)照均以ddH2O為模板。優(yōu)化后，將反應(yīng)混合物分別在61，63，65和67 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增，以實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線及SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果來確定最佳LAMP檢測(cè)體系。

1.2.5 LAMP靈敏度檢測(cè) 根據(jù)已優(yōu)化的LAMP檢測(cè)體系，將黑粉菌DNA分別稀釋為2，2×10-1，2×10-2，2×10-3，2×10-4和2×10-5ng/μL，以不同質(zhì)量濃度的黑粉菌DNA 2 μL作為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。通過實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線和SYBR Green Ⅰ染色來確定LAMP檢測(cè)的靈敏度。

1.2.6 LAMP特異性檢測(cè) 利用篩選的最適引物組和最優(yōu)檢測(cè)體系，分別對(duì)大麥堅(jiān)黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌、禾谷鐮孢菌的總DNA在65 ℃條件下反應(yīng)55 min進(jìn)行擴(kuò)增。通過實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線和SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果來評(píng)估LAMP檢測(cè)方法的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)體系引物組篩選

采用設(shè)計(jì)的青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)體系的3組引物，分別以大麥堅(jiān)黑粉菌(Ustilagohordei)和裸黑粉菌(Ustilagonuda)基因組DNA為模板，65 ℃進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)果顯示，引物組① 2種黑穗病菌的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線均呈“S”型，陰性對(duì)照的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線呈直線型(圖1)；引物組② 2種黑穗病菌的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線也均呈“S”型，但陰性對(duì)照的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線發(fā)生非特異性擴(kuò)增；引物組③ 2種黑穗病菌及陰性對(duì)照均未發(fā)生擴(kuò)增。因此確定引物組①為青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)體系的最佳引物組。

圖1 青稞黑穗病菌的RT-LAMP擴(kuò)增曲線(引物組①)Fig.1 RT-LAMP amplification of barleysmut (Primer set ①)

2.2 LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.2.1 dNTPs濃度的優(yōu)化 根據(jù)設(shè)定反應(yīng)體系，在其他條件不變時(shí)，設(shè)置dNTPs濃度為1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L，分別以大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌基因組DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果(圖2和圖3)顯示，dNTPs濃度越高擴(kuò)增開始時(shí)間越早。SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果(圖4-A中的1―5和圖4-B中的1―5)顯示，dNTPs濃度為1.0 mmol/L時(shí)檢測(cè)結(jié)果呈陰性，其他濃度的檢測(cè)結(jié)果均為陽性。因此根據(jù)擴(kuò)增時(shí)間確定dNTPs的最適濃度為1.8 mmol/L。

2.2.2 甜菜堿濃度的優(yōu)化 當(dāng)dNTPs濃度為1.8 mmol/L，其他條件不變時(shí)，設(shè)置甜菜堿濃度為0，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L，分別以大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌基因組DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果(圖2和圖3)和SYBR Green Ⅰ顯色法結(jié)果(圖4-A中6―10和圖4-B中的6―10)均顯示，5種甜菜堿濃度下檢測(cè)結(jié)果均為陽性，且甜菜堿濃度越高擴(kuò)增所需時(shí)間越短，從而確定甜菜堿的最佳濃度為0.8 mmol/L。

圖2 大麥堅(jiān)黑粉菌RT-LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimized results of RT-LAMP detection system for Ustilago hordei

圖3 裸黑粉菌RT-LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimized results of RT-LAMP detection system for Ustilago nuda

2.2.3 Mg2+濃度的優(yōu)化 當(dāng)dNTPs濃度為1.8 mmol/L，甜菜堿濃度為0.8 mmol/L，其他條件不變時(shí)，分別設(shè)置Mg2+濃度為4，6，8，10 mmol/L，分別以大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌基因組DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果(圖2和圖3)和SYBR Green Ⅰ顯色法結(jié)果(圖4-A中11―14和圖4-B中11―14)均顯示，Mg2+濃度為8和10 mmol/L時(shí)檢測(cè)結(jié)果呈陽性，以擴(kuò)增所需時(shí)間最短為前提，最終確定Mg2+最適濃度為10 mmol/L。

2.2.4 Bst DNA聚合酶濃度的優(yōu)化 當(dāng)dNTPs濃度為1.8 mmol/L，甜菜堿濃度為0.8 mmol/L，Mg2+濃度為10 mmol/L，其他條件不變時(shí)，設(shè)置Bst DNA聚合酶濃度分別為80,160,240,320 U/mL,分別以大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌基因組DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果(圖2和圖3)顯示,Bst DNA聚合酶濃度分別為80，160，340，320 U/mL 時(shí)均可發(fā)生擴(kuò)增，且隨著Bst DNA聚合酶濃度的降低擴(kuò)增所需時(shí)間延長。SYBR Green Ⅰ顯色法結(jié)果(圖4-A中15―18和圖4-B中的15―18)顯示，4種不同Bst DNA聚合酶濃度下反應(yīng)體系均變綠，與實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)結(jié)果一致。故確定開始擴(kuò)增時(shí)間最早的320 U/mL為Bst DNA聚合酶最適反應(yīng)濃度。

A.以大麥堅(jiān)黑粉菌為模板RT-LAMP檢測(cè)體系的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；B.以裸黑粉菌為模板RT-LAMP檢測(cè)體系的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果。N.陰性對(duì)照；1～5.dNTPs濃度分別為1.8，1.6，1.4，1.2，1.0 mmol/L；6～10.甜菜堿濃度分別為0.8，0.6，0.4，0.2，0 mmol/L；11～14．Mg2+濃度分別為4，6，8，10 mmol/L；15～18．Bst DNA聚合酶濃度分別為320，240，160，80 U/mL A.System optimization using U.hordei as a template;B.System optimization using U.nuda as a template.N.Negative control;1-5.dNTPs with concentrations of 1.8,1.6,1.4,1.2 and 1.0 mmol/L,respectively;6-10.Betaine concentrations of 0.8,0.6,0.4,0.2 and 0 mmol/L,respectively;11-14.Mg2+ concentrations of 4,6,8 and 10 mmol/L,respectively;15-18.Concentrations of Bst DNA polymerase at 320,240,160 and 80 U/mL,respectively圖4 大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌RT-LAMP檢測(cè)體系的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果Fig.4 Optimized results of LAMP detection system for Ustilago hordei and Ustilago nuda

2.2.5 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 當(dāng)dNTPs濃度為1.8 mmol/L，甜菜堿濃度為0.8 mmol/L，Mg2+濃度為10 mmol/L，Bst DNA聚合酶濃度為320 U/mL，設(shè)置反應(yīng)溫度分別為61，63，65，67 ℃，其他條件不變時(shí)，分別以大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌基因組DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線和SYBR Green Ⅰ顏色變化均顯示，大麥堅(jiān)黑粉菌和祼黑粉菌在61，63，65，67 ℃下均能發(fā)生擴(kuò)增，其中65 ℃條件下開始擴(kuò)增的時(shí)間最早，SYBR Green Ⅰ顯色最亮(圖5)，從而確定最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。

2.3 LAMP靈敏度檢測(cè)

利用引物組①，對(duì)質(zhì)量濃度為2 ng/μL～2×10-5ng/μL的大麥堅(jiān)黑粉菌、裸黑粉菌DNA進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，RT-LAMP擴(kuò)增曲線和SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果(圖6和圖7)均顯示，RT-LAMP對(duì)大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌的最低檢出質(zhì)量濃度為2×10-4ng/μL。根據(jù)病原菌DNA濃度的擴(kuò)增時(shí)間，確定大麥堅(jiān)黑粉菌擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為60 min，裸黑粉菌擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為45 min。

A．大麥堅(jiān)黑粉菌實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線；B．裸黑粉菌實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線A.Real-time fluorescence amplification curve of U.hordei;B.Real-time fluorescence amplification curve of U.nuda圖6 青稞黑穗病菌RT-LAMP靈敏度檢測(cè)Fig.6 Sensitivity detection of RT-LAMP of barley smut

N．陰性對(duì)照；1～6．分別表示以祼黑粉菌DNA模板為2×10-5 ，2×10-4 ，2×10-3 ，2×10-2 ，2×10-1 ，2 ng/μL濃度下的顯色結(jié)果；7～12．分別表示以大麥黑粉菌DNA模板為2×10-5 ，2×10-4 ，2×10-3 ，2×10-2 ，2×10-1,2 ng/μL濃度下的顯色結(jié)果N.Negative control;1―6. Color change of U.nuda at DNA concentrations of 2×10-5,2×10-4,2×10-3,2×10-2,2×10-1 and 2 ng/μL,respectively;7―12.Color change of U.hordei at DNA concentrations of 2×10-5,2×10-4,2×10-3,2×10-2,2×10-1 and 2 ng/μL,respectively圖7 青稞黑穗病菌可視化反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)Fig.7 Sensitivity detection of visual reaction of barley smut

2.4 LAMP特異性檢測(cè)

分別以大麥堅(jiān)黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌、禾谷鐮孢菌的總DNA為模板進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌的擴(kuò)增曲線呈“S”型(圖8-A)；加入SYBR Green Ⅰ后，檢測(cè)體系顏色變?yōu)榫G色(圖8-B)，其他待測(cè)菌株RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果和SYBR Green Ⅰ顯色結(jié)果均為陰性，表明所建立的LAMP檢測(cè)體系能夠特異性檢測(cè)出青稞的大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌2種病原菌。

A．實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線；B．SYBR Green Ⅰ顯色結(jié)果。N．陰性對(duì)照；1―6．分別表示以大麥堅(jiān)黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌、禾谷鐮孢菌DNA為模板的擴(kuò)增體系A(chǔ).Real-time fluorescence amplification curve;B.Color change of SYBR Green Ⅰ.N.Negative control;1-6.Color change of barley 6common diseases of U.hordei,U.nuda,Dactylobotrys graminicola,Pyrenophora graminea,Pyrenophora teres and Fusarium graminearum,respectively圖8 青稞黑穗病菌RT-LAMP和可視化反應(yīng)特異性檢測(cè)Fig.8 Specific detection in RT-LAMP and visual reaction of barley smut

3 討 論

青稞是藏區(qū)農(nóng)牧民不可替代的主糧，也是藏區(qū)主要飼料和釀酒等農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)的重要原料。青稞產(chǎn)業(yè)已成為青藏高原的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。青稞黑穗病是影響青稞高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要系統(tǒng)性病害，由于青稞屬于小宗糧食作物，關(guān)于其病害病原菌分子檢測(cè)方面的研究報(bào)道甚少。因此通過開展種子帶菌量檢測(cè)，依據(jù)帶菌程度進(jìn)行播前種子處理是青稞黑穗病綠色防治的重要技術(shù)手段。

青稞黑穗病的病原菌侵染植株后，隨著植株的生長而在其組織的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)大量繁殖和延伸，尤其是在分生組織內(nèi)，開花后在子房內(nèi)大量繁殖，最終植株的花序被病原菌冬孢子所取代[15]。大麥堅(jiān)黑粉菌與裸黑粉菌的區(qū)別在于，前者侵染后植株明顯矮于健康植株，菌絲始終定殖在分生組織內(nèi)，直到花器形成，病菌菌絲才侵入子房，形成被一層薄膜包裹的冬孢子，青稞收割脫粒過程中薄膜破裂釋放出冬孢子，散落于田間或聚集于種皮，再與種子一同萌發(fā)，進(jìn)而侵染種子的胚芽鞘進(jìn)行再侵染。后者侵染后植株明顯高于健康植株，病穗在露出苞葉后不久，黑粉團(tuán)包膜破裂釋放冬孢子，冬孢子隨風(fēng)飄落到附近植株正開口的花器中侵染子房，以休眠菌絲形態(tài)潛伏于種子內(nèi)成為次年田間病害的初侵染源?；诙邘Ь绞降牟煌?，種子檢測(cè)方式亦不同。大麥堅(jiān)黑粉菌通過直接顯微觀察、洗滌離心種皮攜帶物進(jìn)行顯微觀察以及冷凍吸水紙法等進(jìn)行檢測(cè)；祼黑粉菌主要通過種胚染色后顯微觀察。但這些方法均耗時(shí)耗力。在分子生物學(xué)方面，對(duì)青稞堅(jiān)黑穗病的種子檢測(cè)鮮見報(bào)道[16-17]，青稞散黑穗的種子檢測(cè)相對(duì)較多[18-21]。2005年Eibel等[22]開發(fā)、評(píng)估了ELISA法檢測(cè)青稞黑穗病，但在檢測(cè)種子帶菌時(shí)需去除種皮、胚乳和盾片，時(shí)間和人力方面不占優(yōu)勢(shì)；2012年Wunderle等[23]用RT-PCR對(duì)不同生育時(shí)期小麥和青稞植物組織中的黑穗病菌進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度為40 ng/μL，遠(yuǎn)低于本研究的檢測(cè)靈敏度，且LAMP檢測(cè)在1 h內(nèi)便可快速檢測(cè)出目的基因，具有操作簡單、靈敏度高、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)。

LAMP檢測(cè)技術(shù)易受氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，為了避免開蓋進(jìn)行電泳檢測(cè)后造成污染，本研究采用實(shí)時(shí)熒光LAMP和SYBR Green I顯色法2種方法判定檢測(cè)結(jié)果，并在體系中加入石蠟油進(jìn)行密封處理。本試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)體系中dNTPs、甜菜堿、Mg2+、Bst DNA聚合酶及反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示在dNTPs濃度為1.8 mmol/L，甜菜堿濃度為0.8 mmol/L，Mg2+濃度為10 mmol/L，Bst DNA聚合酶濃度為320 U/mL的條件下，65 ℃下反應(yīng)45～60 min，大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌DNA模板最低檢出限達(dá)到了2×10-4ng/μL。特異性檢測(cè)結(jié)果表明該檢測(cè)方法對(duì)大麥堅(jiān)黑粉菌(U.hordei)和裸黑粉菌(U.nuda)具有特異性。這表明建立的LAMP檢測(cè)體系可以快速、靈敏、特異地檢測(cè)大麥堅(jiān)黑粉菌(U.hordei)和裸黑粉菌(U.nuda)。

大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌ITS基因序列同源性高達(dá)98%，加之目前可利用的其他分子信息較少，本試驗(yàn)采用的2種方法還不能直接區(qū)分大麥堅(jiān)黑粉菌和裸黑粉菌，但大麥堅(jiān)黑粉菌為種皮表面帶菌，裸黑粉菌為種子內(nèi)部帶菌，因此，后續(xù)試驗(yàn)將從二者種子帶菌方式不同為突破口，對(duì)青稞2種黑穗病菌開展進(jìn)一步區(qū)分檢測(cè)，并研發(fā)快速檢測(cè)試劑盒，以期準(zhǔn)確、快速檢測(cè)青稞種子的帶菌量，為青稞黑穗病的綠色防控提供參考。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光LAMP和SYBR Green Ⅰ顯色法對(duì)青稞黑穗病的LAMP檢測(cè)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 4.5 μL、甜菜堿(5 mol/L) 4 μL、MgSO4(100 mmol/L) 2.5 μL、Bst DNA聚合酶(8 000 U/ml)1 μL、引物(40 μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、5 μmol/L外引物F3/B3、10 μmol/L環(huán)引物L(fēng)F/LB各1 μL)6 μL、SYBR Green I(1∶1 000)1. 5 μL、20 ng/μL菌株DNA 2 μL，無菌去離子水補(bǔ)足25 μL，最后加入石蠟油20 μL密封。

本研究所建立的青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)體系在65 ℃條件下，45 min即可特異性檢出裸黑粉菌，60 min即可特異性檢出大麥堅(jiān)黑粉菌，檢測(cè)靈敏度為2×10-4ng/μL。

DOI:10.13926/j.cnki.apps.00514.

DOI:10.13926/j.cnki.apps.00514.