馬鞍山地區(qū)白山羊線粒體DNA D-loop區(qū)和SRY基因的遺傳進化分析

楊心春,朱一笑,劉洪瑜,范恒功,周 明,劉旭光

(1 安徽農業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；2馬鞍山市金農牧業(yè)有限公司，安徽 含山 238191)

山羊在我國分布廣泛，經歷多年的自然選擇和人工選擇，每個地區(qū)逐漸形成了具有不同遺傳特點、體型外貌和生產性能的山羊品種。作為一種遷徙率較高的物種，山羊群體的遺傳結構和遺傳多樣性可能會隨時間推移發(fā)生一定的變化[1]。由于地理隔離和對不同氣候的適應，不同山羊種群的結構始終遵循地理分布[2]。動物線粒體DNA(mtDNA)基因組含有D-loop區(qū)，作為基因組中進化速率最快、多態(tài)性最高的區(qū)域，mtDNA受自然選擇影響較大，變異程度也較大[3]。mtDNA單倍型、結構和功能的多樣性廣泛應用在分子進化、系統(tǒng)學、群體遺傳分析、個體鑒定、歷史起源的鑒定等方面[4]。SRY基因作為哺乳動物雄性Y染色體上的特異性別決定基因，普遍存在于哺乳動物的Y染色體上，其中的HMG-box在研究物種中序列高度保守[5]。曹學濤等[6]在關于綿羊Y染色體特異性引物及SNPs的篩選研究中，證明了6個綿羊Y染色體基因片段與牛、山羊和牦牛具有較高的同源性，說明Y染色體基因具有一定的保守性。Cinar等[7]對土耳其本地山羊品種的研究反映了SRY基因對物種起源的影響。Chen等[8]通過對國內雙峰駱駝Y染色體多態(tài)性的研究明確了其父系起源和系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律。以往的研究表明，SRY基因在動物的起源、系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳學方面，基于其高度保守性和遺傳進化信息的完整性，作為母系遺傳mtDNA遺傳標記的重要補充，可以成為了解父系遺傳多樣性非常理想的標記分子[9-10]。

馬鞍山地區(qū)白山羊額寬嘴短，純白色，有鬢，被毛粗、短、直，毛色絲光特征明顯，生長速度快，性成熟早，肉質鮮美、營養(yǎng)豐富，深受當地消費者青睞，是十分具有潛力的地方品種資源，但目前關于該山羊種質的相關研究還較為少見，對該白山羊品種資源的保存和開發(fā)利用十分不利。為此，本試驗采用PCR測序的方法，測定馬鞍山地區(qū)白山羊SRY基因編碼區(qū)和mtDNA D-loop區(qū)基因全序列，通過測序和分子特征分析，對安徽馬鞍山地區(qū)白山羊品種內的群體遺傳多樣性以及與國內部分山羊品種間遺傳距離進行分析，以期為馬鞍山地區(qū)白山羊品種資源的有效保存、開發(fā)和遺傳改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

從安徽馬鞍山地區(qū)采集品種特征明顯、無血緣關系的公羊個體血樣19份，母羊個體血樣40份，利用含肝素鈉抗凝劑的負壓采血管，頸靜脈采血8 mL于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 血液DNA的提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒提取馬鞍山地區(qū)白山羊血液基因組DNA，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA樣品。

1.2.2SRY基因和mtDNA D-loop區(qū)序列的擴增與測定 根據GenBank中山羊SRY基因序列和線粒體基因組的基因序列設計引物，所用引物信息見表1。

表1 馬鞍山白山羊SRY基因序列和mtDNA D-loop區(qū)序列擴增所用引物及其信息Table 1 Primers used for amplification of Maanshan white goat SRY gene sequence and mtDNA D-loop region

利用公羊血液提取的DNA進行SRY基因PCR擴增，PCR反應總體系15 μL，其中上、下游引物各0.6 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O補足至15 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 60 s，共32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

利用母羊血液提取的DNA進行mtDNA D-loop區(qū)PCR擴增，PCR反應總體系為15 μL，其中上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O補足至15 μL。PCR反應條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 90 s，共32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小、純度及亮度，選取擴增效果良好且足量的樣品送華大基因公司進行正反雙向測序。

1.3 數據處理

使用DNAman軟件，對PCR擴增所得的19條SRY基因全序列以及40條mtDNA D-loop區(qū)全序列，與從GenBank中下載的20種國內部分山羊品種mtDNA D-loop區(qū)全序列(表2)進行編輯整理，用Clustalx 2.0軟件進行序列比對；使用DNAsp 5.0[11]軟件統(tǒng)計馬鞍山地區(qū)白山羊SRY基因序列和mtDNA D-loop區(qū)序列的多態(tài)位點數、核苷酸單倍型數目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數，并進行Tajima’s中性顯著性檢驗；基于Kimura2-parameter模型，利用MEGA X軟件計算安徽馬鞍山地區(qū)白山羊與中國部分山羊品種間的遺傳距離，并采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 國內部分山羊品種mtDNA D-loop區(qū)全序列Table 2 Sequences of mtDNA D-loop sequences of some Chinese goat varieties

2 結果與分析

2.1 馬鞍山地區(qū)公母羊血樣DNA提取

利用血液基因組DNA提取試劑盒提取山羊血液基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果顯示提取的DNA質量良好，可以進行下一步試驗。

2.2 馬鞍山地區(qū)白山羊SRY基因和mtDNA D-loop區(qū)序列的PCR擴增

利用提取的公母羊血液基因組DNA，PCR擴增公羊SRY基因編碼區(qū)和母羊mtDNA D-loop區(qū)序列，結果如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，公羊擴增的目的基因片段長度為800 bp左右，母羊擴增的目的基因片段長度為1 200 bp左右，與預期的片段大小一致。

M.DNA Marker 2000；1～10.SRY基因PCR擴增產物M.DNA Marker 2000；1-10.PCR products of SRY gene圖1 馬鞍山地區(qū)白山羊SRY基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR products of SRY in Maanshan white goat

M.DNA Marker 2000；1～10.D-loop區(qū)PCR擴增產物M.DNA Marker 2000；1-10.PCR products of D-loop region圖2 馬鞍山地區(qū)白山羊mtDNA D-loop區(qū)的PCR擴增產物Fig.2 PCR products of mtDNA D-loop region in Maanshan white goat

2.3 馬鞍山地區(qū)白山羊公羊SRY基因編碼區(qū)的遺傳變異

對19頭白山羊公羊核苷酸多態(tài)性及SRY全序列堿基組成進行分析，結果表明在SRY基因整個編碼區(qū)共含有92個變異位點，占核苷酸總數的10.50%，其中單一多態(tài)位點(singleton variable sites)34個，簡約信息位點(parsimony informative sites)58個。A、G、C和T 4種堿基平均含量的占比分別為30.4%，23.2%，23.7%和22.7%，A+T平均含量占比為53.1%，G+C平均含量占比為46.9%，A+T平均含量的占比較G+C高6.2%。

利用DNAsp 5.0軟件對白山羊SRY基因的單倍型進行分析，結果(表3)表明，19頭公羊個體含有H1～H19共19種單倍型，單倍型多樣性(Hd)為1.000，核苷酸多樣性(Pi)為0.018 68，平均核苷酸差異數(k)為15.152。

表3 馬鞍山地區(qū)白山羊SRY基因的單倍型分布Table 3 SRY haplotypes of Maanshan white goat

2.4 馬鞍山地區(qū)白山羊母羊mtDNA D-loop區(qū)的遺傳變異

對40頭白山羊母羊核苷酸多態(tài)性及mtDNA D-loop區(qū)序列堿基組成進行分析，結果表明母羊mtDNA D-loop區(qū)共含有986個變異位點，占核苷酸總數的69.24%，其中單一多態(tài)位點150個，簡約信息位點836個。A、G、C和T 4種堿基的平均含量占比分別為31.1%，15.9%，25.1%和27.9%，A+T平均含量的占比為59%，G+C平均含量的占比為41%，A+T平均含量的占比較G+C平均含量的占比高18%。利用DNAsp 5.0對白山羊mt-DNA D-loop區(qū)的單倍型進行分析，結果(表4)表明，40頭母羊含有H1～H32共32種單倍型，單倍型多樣性(Hd)為0.986，核苷酸多樣性(Pi)為0.127 13，平均核苷酸差異數(k)為12.915。

表4 馬鞍山地區(qū)白山羊mtDNA D-loop區(qū)的單倍型分布Table 4 mtDNA D-loop haplotypes of Maanshan white goat

2.5 馬鞍山地區(qū)白山羊與國內部分山羊品種間的系統(tǒng)進化分析

基于Kimura2-parameter模型,利用MEGA X軟件計算安徽馬鞍山地區(qū)白山羊與國內部分山羊品種間的遺傳距離，結果表明馬鞍山地區(qū)白山羊與馬頭山羊的遺傳距離最大，為0.034 1；與遼寧絨山羊的遺傳距離最近，為0.000 1。采用鄰接法(NJ)構建馬鞍山地區(qū)白山羊與國內其他20個山羊品種間的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果(圖3)表明，馬鞍山地區(qū)白山羊首先與黃淮山羊、西藏山羊聚為一支，包含3種單倍型；其次與遼寧絨山羊聚為一支，包含7種單倍型；再與貴州白山羊聚為一支，包含5種單倍型；最后與安哥拉山羊、波爾山羊聚為一支，包含7種單倍型。說明馬鞍山地區(qū)白山羊在起源中受到較多其他羊種群體擴張的影響。

LNG.遼寧絨山羊；HHG.黃淮山羊；YCW.陽城白山羊；AGL.安哥拉山羊；BOER.波爾山羊；GZW.貴州白山羊；SNW.陜南白山羊；BJG.板角山羊；BCW.北川白山羊；CDW.川東白山羊；MTG.馬頭山羊；HMG.海門山羊；XHG.徐淮山羊;NMG.內蒙古絨山羊；LLYG.龍陵黃山羊；LLG.隆林山羊；TBG.西藏山羊;YLG.云嶺山羊；CDMG.成都麻羊；QBMG.黔北麻羊。圈內數字表示遺傳距離;圈外數字表示馬鞍山地區(qū)白山羊羊只編號LNG.Liaoning cashmere goat;HHG.Huanghuai goat;YCW.Yangcheng white goat;AGL.Angora goat;BOER.Boer goat;GZW.Guizhou white goat;SNW.Shaannan white goat;BJG.Banjiao goat;BCW.Beichuan white goat;CDW.Chuandong white goat;MTG.Matou goat;HMG.Haimen goat;XHG.Xuhuai goat;NMG.Inner Monggolia cashmere goat;LLYG.Longling yellow goat；LLG.Longlin goat；TBG.Tibetan goat；YLG.Yunling goat；CDMG.Chendu brown goat；QBMG.Qianbei brown goat.Numbers in circle indicate genetic distance.Numbers outside circle indicate number of Maanshan white goats圖3 馬鞍山地區(qū)白山羊與國內部分山羊品種的系統(tǒng)進化關系Fig.3 Phylogenetic relationship between Maanshan white goats and other goat breeds in China

3 討 論

單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是評價群體遺傳多樣性和分化狀況的重要指標，二者數值越大，表明遺傳多樣性越豐富[12]。本試驗中的Hd和Pi數值均較高，說明馬鞍山地區(qū)白山羊多態(tài)程度高，遺傳多樣性豐富，這與王杰[13]對中國北方11種隴東黑山羊多態(tài)信息的單倍型和核苷酸多樣度范圍的測定結果一致。說明馬鞍山地區(qū)白山羊擁有較強的遺傳選擇潛力以及豐富的遺傳多樣性，在未來的遺傳育種工作中應該額外重視。

馬鞍山地區(qū)白山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列中A+T的平均含量明顯高于G+C，符合mt DNA D-loop區(qū)的堿基組成規(guī)律，與趙中權等[14]、姜雪鷗等[15]、閆益波等[16]以及Liu等[17]的研究結果一致，說明mtDNA D-loop區(qū)全序列均富含A/T堿基，可能是A/T堿基含量越豐富mtDNA D-loop區(qū)變異率越高[16]。本研究中，40個母羊個體的mt DNA D-loop區(qū)共有150個單一多態(tài)位點，具備較高的多態(tài)性，在一定程度上支持了張紅平等[18]關于4個引進山羊品種mtDNA控制區(qū)序列變異和系統(tǒng)發(fā)生關系的研究。本研究中公羊SRY基因變異位點只占核苷酸總量的10.50%，占比較少，而4種堿基含量也大致相同，19個公羊樣本含有19種單倍型。劉仲娜等[19]關于麥洼牦牛SRY基因序列的分析顯示，牦牛的G+C含量為47.6%，且親緣關系與綿羊和山羊最近。蔣利等[20]在阿勒泰羊和藏綿羊SRY基因序列分析及親緣關系研究中也發(fā)現，A+T含量略微高于G+C，且A、G、C、T 4種堿基含量大致一樣。在SRY基因方面，馬鞍山地區(qū)白山羊與其他品種山羊的系統(tǒng)發(fā)育進化關系還需進一步分析。

本研究利用安徽馬鞍山地區(qū)白山羊與國內部分山羊構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示大部分馬鞍山地區(qū)白山羊與遼寧絨山羊聚為一支，其余部分分別與黃淮山羊、西藏山羊、貴州白山羊、安哥拉山羊及波爾山羊聚為一支。而且馬鞍山地區(qū)白山羊與遼寧絨山羊劃分為同一個支系，且二者遺傳距離最近；與馬頭山羊遺傳距離最遠。

mtDNA D-loop區(qū)的錯配分析常用于檢測群體擴張和推斷群體擴張時間，Jyotsana等[21]利用錯配分析檢驗了33個印度山羊群體的地理擴張，表明印度山羊群體的擴張模型合理可靠。郝榮超等[22]關于中國南部和西北地區(qū)山羊mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性及群體分化的研究顯示，中國南部和西北山羊至少發(fā)生過3次群體擴張。Guang等[23]對長江沿岸中國山羊遺傳多樣性的研究表明，長江沿岸的16個山羊種群具有較高的多樣性和聚類性，共鑒定出173種單倍型，其相互間存在遺傳物質的交換。Liu等[17]對15個種群藏山羊的錯配分析表明，其中的3個單倍群至少有1次群體擴張。Chen等[24]用失配分布和Fu’s Fs統(tǒng)計對中國山羊進行分析，結果表明中國山羊曾發(fā)生過群體擴張事件。從本研究構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，馬鞍山地區(qū)白山羊中的一部分與西藏山羊處于同一分支，表明二者之間在歷史上可能存在遺傳物質的交換。白文林[25]利用Fu’s Fs中性檢驗對中國產絨山羊品種父系與母系起源的分子特征及遺傳分化研究表明，中國產絨山羊群體在歷史上可能發(fā)生過群體擴張事件。

綜上可知，馬鞍山地區(qū)白山羊與遼寧絨山羊遺傳距離最近，其次是黃淮山羊、西藏山羊以及貴州白山羊，與馬頭山羊遺傳距離最遠。從構建的NJ發(fā)育樹來看，馬鞍山地區(qū)白山羊與國內多個山羊品種混合在一起，說明馬鞍山地區(qū)白山羊在起源中受到較多其他羊種群體擴張的影響。