依托泊苷納米混合膠束的制備及其理化性質(zhì)

張欣欣 許潔 蔣巖 趙麗艷 張萬(wàn)明

摘 要：為提高依托泊苷制劑的水溶性和穩(wěn)定性，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化依托泊苷納米混合膠束（ETP mPEG-PLA/P123）的處方工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以投藥量、mPEG-PLA所占質(zhì)量比和水化體積為自變量，以依托泊苷包封率、載藥量以及粒徑為因變量，進(jìn)行3因素5水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，采用熒光探針?lè)y(cè)定臨界膠束濃度（CMC），并對(duì)所制備的膠束制劑進(jìn)行理化性質(zhì)和釋放行為的評(píng)估。結(jié)果表明，ETP mPEG-PLA/P123膠束制劑的最優(yōu)處方工藝如下：mPEG-PLA與P123質(zhì)量比為38∶62，投藥量為5 mg，水化體積為6 mL;采用最優(yōu)處方制得的混合膠束的包封率為87.4%，載藥量為4.19%，粒徑為115.6 nm，PDI為0.216，Zeta電位為-16.3 mV;熒光探針?lè)y(cè)定的CMC值為1.7×10-3 g/L，mPEG-PLA/P123膠束穩(wěn)定性良好;體外釋放實(shí)驗(yàn)中，依托泊苷可從膠束中緩慢而持續(xù)地釋放，在48 h內(nèi)釋放量可達(dá)80%。采用優(yōu)化處方制得的ETP mPEG-PLA/P123納米混合膠束，能顯著增加依托泊苷的溶解度，膠束制劑穩(wěn)定性好，且有一定的緩釋作用，可為進(jìn)一步拓寬依托泊苷新型制劑的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：藥劑學(xué);依托泊苷;P123;膠束;UPLC;薄膜水化法;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ460.7;R961?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.7535/hbkd.2021yx04009

收稿日期：2021-04-13;修回日期：2021-05-09;責(zé)任編輯：張士瑩

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81274005）;河北省教育廳高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（JYT2020002）;河北省衛(wèi)生健康委科研基金（20180812）

第一作者簡(jiǎn)介：張欣欣（1994—），女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物分析、藥劑學(xué)方面的研究。

通訊作者：張萬(wàn)明教授。E-mail： 429269523@qq.com

張欣欣，許潔，蔣巖，等.依托泊苷納米混合膠束的制備及其理化性質(zhì)[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（4）：389-399.ZHANG Xinxin， XU Jie， JIANG Yan， et al.Preparation and evaluation of physicochemical properties of etoposide nano-mixed micelles[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2021，42（4）：389-399.

Preparation and evaluation of physicochemical properties of etoposide nano-mixed micelles

ZHANG Xinxin1，XU Jie1，JIANG Yan1，ZHAO Liyan1，2，ZHANG Wanming1，2

（1.School of Pharmacy，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China;2.Hebei Key Laboratory of Neuropharmacology，Zhangjiakou，Hebei 075000，China）

Abstract：In order to enhance the aqueous solubility and stability of etoposide preparation，the central composite design-response surface method was used to optimize the prescription technology of etoposide nano-mixed micelles （ETP mPEG-PLA/P123）.Based on the results of single factor test，central composite design-response surface method of three factors and five levels was carried out to optimize the prescription technology with drug dosage，the mass ratio of mPEG-PLA and hydration volume as independent variables，and the entrapment efficiency，drug loading and particle size as dependent variables.The critical micelle concentration （CMC） was determined by fluorescence probe method，and the physicochemical properties and release behavior of the prepared micelle preparations were evaluated.The results showed that the optimal prescription of ETP mPEG-PLA/P123 micelle preparation was that mPEG-PLA∶P123=38∶62，the drug dosage was 5 mg，and the hydration volume was 6 mL.After optimization，the? entrapment efficiency and drug loading were 87.4% and 4.19%，the particle size was 115.6 nm，PDI was 0.216，and Zeta potential was -16.3 mV.The CMC value was 1.7×10-3 g/L，so mPEG-PLA/P123 micelles had high stability.In vitro release experiments，etoposide could be released from micelles slowly and continuously，up to 80% within 48 h.The optimized ETP mPEG-PLA/P123 nano-mixed micelles were able to enormously improve the aqueous solubility of etoposide，and the micelle preparation had good stability and a certain slow-release effect.The results of this study could provide theoretical guidance for further broadening the range of application of new etoposide preparations.

Keywords：

pharmaceutics;etoposide;P123;micelles;UPLC;thin film hydration method;central composite design-response surface method

鬼臼毒素是從小蘗科鬼臼屬植物華鬼臼的根和莖中提取的木脂類(lèi)抗腫瘤成分。由鬼臼毒素結(jié)構(gòu)改造而得的衍生物依托泊苷（etoposide，ETP）作為一種臨床常用化療藥物，對(duì)于肺癌、白血病、淋巴瘤、睪丸腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤均有治療作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，依托泊苷能與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合，形成牢固的藥-酶-DNA復(fù)合物，阻礙TopoⅡ?qū)NA的修復(fù)[2-3]。然而，依托泊苷在臨床應(yīng)用中存在水溶性差（153 mg/L）、易代謝失活、生物利用度低以及劑量限制性血液毒性等問(wèn)題[4-5]。此外，市售的依托泊苷注射液中添加的輔料如無(wú)水乙醇、苯乙醇、聚山梨酯80等，也可能引發(fā)機(jī)體的超敏反應(yīng)[6]。因此，構(gòu)建依托泊苷新型給藥系統(tǒng)，對(duì)增加依托泊苷的溶解性、提高其生物利用度和靶向緩釋特性具有重要意義。

膠束制劑可以改變活性物質(zhì)原有的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布，在提高藥效、降低藥物毒性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7-11]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員在對(duì)依托泊苷的研究中發(fā)現(xiàn)其膠束制劑的抗腫瘤作用明顯優(yōu)于依托泊苷注射液，但對(duì)膠束本身的穩(wěn)定性和載藥量仍有待深入研究。本研究以普郎尼克P123和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（mPEG-PLA）共同作為載體材料制備負(fù)載ETP的混合膠束制劑。普朗尼克P123是由親水性的聚氧乙烯嵌段和疏水性的聚氧丙烯嵌段構(gòu)成的兩親性共聚物，具有安全、易降解、無(wú)免疫原性、良好生物相容性[12]、免于被肝臟和腎臟清除和高載藥[13]性能等優(yōu)點(diǎn)。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸中的聚乙二醇能提供膠束微粒間的空間位阻[14]，提高納米載藥體系的穩(wěn)定性。聚乳酸（PLA）因水分子間的排斥作用，促使疏水鏈間相互吸引而締合，為脂溶性藥物提供疏水內(nèi)腔，提高膠束的載藥量和穩(wěn)定性。

本研究采用薄膜水化法制備依托泊苷納米混合膠束，通過(guò)單因素考察與星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方，建立mPEG-PLA/P123比例、投藥量和水化體積3個(gè)因素對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的函數(shù)關(guān)系，并對(duì)制備的新型膠束制劑進(jìn)行粒徑、電位、臨界膠束濃度等理化性質(zhì)的評(píng)估，以及差示掃描量熱分析和釋放行為考察，為進(jìn)一步研究依托泊苷新型制劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

ACQUITY UPLC色譜儀，PDA檢測(cè)器，Empower3.0化學(xué)工作站（美國(guó)Waters公司提供）;Standby sartorius ME/SE系列微量電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司提供）;HJ-4D數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力加熱攪拌器（金壇市友聯(lián)儀器研究所提供）;GAOKE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪高科儀器廠提供）;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司提供）;DZF-6020型真空干燥箱（寧波市江南儀器廠提供）;JPCQ1028型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（武漢嘉鵬電子科技有限公司提供）;SHA-B水浴恒溫振蕩器（國(guó)旺儀器公司提供）;Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司提供）;Lab Tech UV2100紫外-可見(jiàn)分光光度儀（北京萊伯泰科有限公司提供）;HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金南儀器制造有限公司提供）;ZETASIZER Nano series納米粒度電位儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司提供）;HITACHI F-700熒光光譜儀（日立公司提供）;ZNCL-TS加熱套（鞏義市英裕儀器公司提供）;RC8CD溶出儀，RZQ-8D取樣收集系統(tǒng)（天大天發(fā)公司提供）;DSC1差示掃描量熱儀（瑞士梅特勒托利多公司提供）。

1.2 試藥

依托泊苷（批號(hào)為EC220094，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%），安耐吉化學(xué)試劑有限公司提供;P123（批號(hào)為MKBQ0305V），Sigma公司提供;甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（濟(jì)南岱罡生物科技有限公司提供）;乙腈，色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供;甲醇、丙酮、無(wú)水乙醇，均為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 ETP mPEG-PLA/P123的制備

采用薄膜水化法制備負(fù)載依托泊苷的mPEG-PLA/P123共聚物膠束。將一定量的mPEG-PLA，P123和ETP溶解于適量甲醇中，攪拌至溶解（1 000 r/min，15 min）。使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器至甲醇完全蒸發(fā)并形成干燥藥膜，之后真空干燥過(guò)夜以除去殘留的有機(jī)溶劑。再加入適量超純水，超聲處理，于50 ℃恒溫振蕩1 h后，通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，除去未包封的藥物和共聚物的聚集體，得到ETP膠束制劑。

2.2 色譜條件

Waters BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm（ETP），流動(dòng)相為乙腈/水（二者體積比為50∶50），體積流量為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

以“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)mPEG-PLA/P123空白膠束溶液和ETP mPEG-PLA/P123載藥膠束溶液進(jìn)樣。結(jié)果如圖1所示，在284 nm波長(zhǎng)下，輔料對(duì)依托泊苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.2 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取10 mg依托泊苷，放入10 mL容量瓶中，乙腈定容，制得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的依托泊苷儲(chǔ)備液。將質(zhì)量濃度依次稀釋至80，40，20，10，5 μg/mL，進(jìn)樣。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得到線性回歸方程為y=2.029 9x+2.109，R2=0.999 9。在5～80 μg/mL范圍內(nèi)，依托泊苷的線性關(guān)系良好。

2.3 ETP載藥量和包封率的測(cè)定

精密吸取0.2 mL ETP mPEG-PLA/P123膠束溶液，放入10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即為所得供試品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將所得峰面積帶入線性方程，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算ETP mPEG-PLA/P123膠束溶液中ETP的含量。

ETP載藥量=膠束中ETP含量/（膠束中ETP含量+載體材料總量）×100%，

ETP包封率=膠束中ETP含量/ETP的投藥量×100%。

2.4 單因素考察

2.4.1 投藥量

固定載體材料mPEG-PLA和P123各50 mg，有機(jī)溶劑為甲醇，水化體積4 mL，其他條件與2.1項(xiàng)下一致，考察投藥量為2，4，6，8，10 mg時(shí)對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，隨著投藥量的增加，包封率和粒徑均呈下降趨勢(shì)，載藥量則先升高后降低。故對(duì)投藥量項(xiàng)進(jìn)行后續(xù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法分析。

2.4.2 mPEG-PLA所占質(zhì)量比

固定載體材料（mPEG-PLA與 P123）總量為100 mg，投藥量為4 mg，其他條件不變，考察mPEG-PLA占載體材料總量為0.2，0.3，0.5，0.7和0.8時(shí)，對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，隨著mPEG-PLA占比的增加，包封率和載藥量先降再升，而粒徑呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。因此，將mPEG-PLA與P123的比例作為后續(xù)處方優(yōu)化考察因素之一。

2.4.3 有機(jī)溶劑種類(lèi)

固定載體材料m（mPEG-PLA）∶m（P123）=3∶7 （30 mg∶70 mg），投藥量為4 mg，其他條件不變，考察有機(jī)溶劑分別為甲醇、乙腈和丙酮時(shí)對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，有機(jī)溶劑的改變，對(duì)包封率、載藥量和粒徑均無(wú)顯著影響。由于丙酮揮發(fā)性和毒性較強(qiáng)，乙腈沸點(diǎn)較高，故本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為有機(jī)溶劑。

2.4.4 超聲時(shí)間

固定載體材料m（mPEG-PLA）∶m（P123）=3∶7 （30 mg∶70 mg），投藥量為4 mg，有機(jī)溶劑為甲醇，其他條件不變，考察超聲時(shí)間為5，10，20，30，60 min時(shí)，對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，僅粒徑略有下降，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到10 min后，粒徑基本不變。故選取10 min為本實(shí)驗(yàn)的超聲時(shí)間。

2.4.5 水化體積

固定載體材料m（mPEG-PLA）∶m（P123）=3∶7 （30 mg∶70 mg），投藥量為4 mg，有機(jī)溶劑為甲醇，超聲時(shí)間為10 min，其他條件不變，考察水化體積為2，4，6，8，10 mL時(shí)，對(duì)膠束包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，隨著水化體積的增加，會(huì)導(dǎo)致膠束粒徑減小，而包封率和載藥量則呈先升后降的趨勢(shì)。因此，將水化體積作為后續(xù)處方優(yōu)化考察因素之一。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

在單因素考察基礎(chǔ)上，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化ETP mPEG-PLA/P123膠束。以投藥量（X1）、mPEG-PLA占比（X2）和水化體積（X3）作為3個(gè)自變量，建立對(duì)依托泊苷納米膠束包封率（Y1）、載藥量（Y2）和粒徑（Y3）的函數(shù)關(guān)系。利用Design Expert 10 （32-bit） 軟件進(jìn)行3因素5水平的CCD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素的取值范圍如下：投藥量2～10 mg，mPEG-PLA占比0.3～0.7，水相體積2～10 mL。各水平取值見(jiàn)表6，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表7。

根據(jù)Design Expert 10 （32-bit） 軟件對(duì)各因素及指標(biāo)進(jìn)行多元線性及二項(xiàng)式擬合，確定最優(yōu)處方參數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，二次多項(xiàng)式回歸模型是描述各因素與指標(biāo)關(guān)系的最佳模型，數(shù)學(xué)模型如下：

Y1=71.78-22.98X1-2.98X2+0.39X3+0.25X1X2+2.70X1X3-

0.90X2X3-4.78X21+2.43X22-3.88X23（r2=0.980 0，P<0.01）;

Y2=4.13+0.11X1-0.16X2+0.06X3-0.05X1X2+0.16X1X3-

0.03X2X3-0.73X21+0.10X22-0.24X23（r2=0.969 3，P<0.01）;

Y3=116.80-7.01X1+2.07X2+3.04X3+0.77X1X2-0.45X1X3-

0.45X2X3+2.17X21-0.41X22+0.21X23（r2= 0.884 2，P<0.01）。

方差分析見(jiàn)表8—表10。

由表8—表10可知，各模型P<0.000 1，表明以上二次多項(xiàng)式方程的顯著性極高，也顯示了獨(dú)立變量X1，X2和X3對(duì)因變量Y1，Y2和Y3 的影響;失擬項(xiàng)均大于0.05，說(shuō)明各回歸方程與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合度良好，使用二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可取。

根據(jù)二項(xiàng)式擬合方程繪制因素對(duì)各指標(biāo)影響趨勢(shì)的三維效應(yīng)面與等高線圖，描述各獨(dú)立變量（投藥量、mPEG-PLA占比、水化體積）對(duì)因變量（包封率、載藥量和粒徑）響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

2.6 最優(yōu)處方的驗(yàn)證試驗(yàn)

為獲得最大的包封率、載藥量及最小粒徑，使用Design-Expert軟件評(píng)估了獨(dú)立變量對(duì)響應(yīng)影響的顯著性，使用響應(yīng)面圖確定了制備膠束的最佳條件。最優(yōu)處方：m（mPEG-PLA）∶m（P123）=38∶62，投藥量為5 mg，水化體積為6 mL。預(yù)測(cè)此條件下膠束的包封率為86.05%，載藥量為4.21%，粒徑為118.05 nm。根據(jù)最佳條件將預(yù)測(cè)值與最新制備的3批ETP mPEG-PLA/P123膠束的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，以證明該模型的適用性，結(jié)果見(jiàn)表11。

由表11可知，該膠束實(shí)際的平均包封率為87.4%，平均載藥量為4.19%，粒徑為116.6 nm，該方法的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的絕對(duì)值均小于5%。結(jié)果表明，該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可取。

3 ETP mPEG-PLA/P123混合膠束制劑理化性質(zhì)

3.1 膠束粒徑及Zeta電位

利用Zetasizer粒度儀測(cè)定ETP mPEG-PLA/P123膠束的粒徑和Zeta電位。將2.1項(xiàng)下膠束溶液用超純水適當(dāng)稀釋?zhuān)瑸V膜過(guò)濾，測(cè)定其電位和粒徑（d），結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

由圖3和圖4可知，ETP mPEG-PLA/P123膠束粒徑分布均一，平均粒徑為115.6 nm，PDI為0.216，Zeta電位為-16.3 mV。

3.2 臨界膠束濃度

在室溫下，使用芘作為熒光探針，通過(guò)熒光分光光度計(jì)，測(cè)定mPEG-PLA/P123混合膠束的臨界膠束濃度（CMC）。 將適量芘溶解在丙酮中，然后分別加入到9個(gè)10 mL容量瓶中，并在氮?dú)庀抡舭l(fā)丙酮。將以超純水稀釋的質(zhì)量濃度分別為6.4×10，3.2×102，1.6×103，8×103，4×104，2×105，1×106，5×106，2.5×107 μg/mL的空白膠束溶液加入上述容量瓶中，稀釋至刻度，

使混合膠束溶液中芘的最終濃度保持在5×10-7 mol/L。將所得溶液于45 ℃恒溫振蕩2 h，冷卻到室溫過(guò)夜平衡。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各濃度溶液中芘的熒光激發(fā)光譜，發(fā)射波長(zhǎng)為390 nm，激發(fā)波長(zhǎng)的范圍為300～360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm，記錄337.2 nm和334.8 nm處的熒光強(qiáng)度I337.2和I334.8。以I337.2和I334.8的強(qiáng)度比與聚合物濃度（c）的對(duì)數(shù)作圖，CMC值為拐點(diǎn)處曲線的切線與低濃度點(diǎn)上水平切線的交點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，mPEG-PLA/P123空白膠束的CMC為2.5×10-3 g/L，該臨界膠束質(zhì)量濃度與mPEG-PLA（1.7×10-3 g/L）相近，低于P123（CMC為5×10-2 g/L）。因此，在體內(nèi)稀釋條件下，mPEG-PLA/P123混合膠束具有更高的穩(wěn)定性和保證膠束完整性的能力。

3.3 熱性能

采用差示掃描量熱儀測(cè)定天然依托泊苷、mPEG-PLA/P123空白膠束、依托泊苷和mPEG-PLA/P123的物理混合物以及ETP mPEG-PLA/P123載藥膠束的熱性能，以空標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝為空白對(duì)照。溫度掃描設(shè)定為40～200 ℃，速度為20 ℃/min，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6中，a—d分別為天然依托泊苷、mPEG-PLA/P123空白膠束、ETP mPEG-PLA/P123載藥膠束以及依托泊苷和mPEG-PLA/P123的物理混合物的熱分析圖。

由圖6可知，天然依托泊苷在189 ℃時(shí)出現(xiàn)放熱峰，此為依托泊苷的特征峰;在空白膠束中，58 ℃處出現(xiàn)一個(gè)放熱峰，當(dāng)其與依托泊苷物理混合后，在58 ℃和185 ℃處出現(xiàn)兩者的疊加峰，說(shuō)明依托泊苷以晶體形式存在;在載藥膠束中，未發(fā)現(xiàn)依托泊苷的特征峰，表明膠束內(nèi)部的依托泊苷可能處于分散的無(wú)定形或無(wú)序結(jié)晶相形式。

3.4 體外釋放行為

采用動(dòng)態(tài)透析袋法研究依托泊苷在不同制劑中的體外釋放行為。將依托泊苷注射液、依托泊苷原料藥溶液以及負(fù)載依托泊苷的膠束溶液置于透析袋（截留Mw=3 500）中，然后放入200 mL釋放介質(zhì)（含有0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液）中，恒溫保持在（37±0.5）℃，并以100 r/min攪拌。分別于1，3，5，7，9，12，24，36，48 h時(shí)收集樣品2 mL ，并以同等體積空白釋放介質(zhì)替換，最后通過(guò)UPLC測(cè)定釋放的ETP濃度，計(jì)算累計(jì)釋放率。釋放曲線如圖7所示。

由圖7可以看出，在1～5 h內(nèi)，依托泊苷注射液和原料藥溶液釋放速率較快，在7 h已達(dá)到釋放末期，累計(jì)釋放率均在80%以上;與之相比，依托泊苷膠束溶液釋放緩慢，此時(shí)釋放率僅為30%左右;當(dāng)釋放時(shí)間為48 h時(shí)，膠束制劑中依托泊苷的最大釋放率達(dá)到82%，因此ETP mPEG-PLA/P123膠束制劑符合緩釋制劑的特點(diǎn)。

4 結(jié) 論

1）臨界膠束濃度（CMC）是衡量?jī)捎H性聚合物膠束性能的主要指標(biāo)之一，反映了膠束制劑的稀釋穩(wěn)定性。CMC值越小，形成膠束的聚合物所需濃度越低，膠束的結(jié)構(gòu)也更穩(wěn)定。一般而言，與混合膠束相比，單一聚合物形成的膠束受其鏈段限制，常出現(xiàn)載藥量較低和穩(wěn)定性較差等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)成功制備了以P123和mPEG-PLA為載體的依托泊苷納米混合膠束。普朗尼克P123是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、安全性高的多功能藥用輔料，以P123自組裝形成的膠束，具有較高的包封率和載藥量[15]，但其穩(wěn)定性較差，且隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑變大、PDI增加。而mPEG-PLA的加入顯著增強(qiáng)了該膠束的穩(wěn)定性[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該混合膠束的臨界膠束質(zhì)量濃度（2.5×10-3 g/L）與mPEG-PLA（1.7×10-3 g/L）相近，低于P123（CMC為5×10-2 g/L），表明與P123相比，mPEG-PLA/P123混合膠束具有更高的自身穩(wěn)定性、完整性和抗稀釋能力。

2）載藥膠束制劑的釋放采用動(dòng)態(tài)透析袋法。為滿足漏槽條件，選擇磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4，0.5%十二烷基硫酸鈉）為釋放介質(zhì)考察依托泊苷聚合物膠束的體外釋放特性。由于依托泊苷在PBS水溶液中的溶解度極低，為了使釋放介質(zhì)中藥物濃度遠(yuǎn)低于其飽和濃度[17]（即維持漏槽條件），采用添加表面活性劑的方法提高藥物的溶解度。藥物釋放實(shí)驗(yàn)中常用的釋放介質(zhì)包括磷酸鹽（PBS）緩沖溶液[18-19]、含Tween 80的PBS溶液[20-21]以及含十二烷基硫酸鈉（SDS）的PBS溶液[22]等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依托泊苷在以上3種釋放介質(zhì)中的溶解度分別為0.36，1，2.5 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)選用含SDS的磷酸鹽緩沖溶液研究疏水藥物依托泊苷的釋放行為。相較于傳統(tǒng)制劑，ETP mPEG-PLA/P123膠束在7 h內(nèi)的釋放率僅為30%。因此，該膠束制劑具有顯著的緩釋作用，可延長(zhǎng)依托泊苷的血液循環(huán)時(shí)間，維持血藥濃度，增加藥物在腫瘤細(xì)胞中的累積率。

3）本研究以P123和mPEG-PLA共同作為載體材料，采用薄膜水化法制備了負(fù)載ETP的納米混合膠束制劑，通過(guò)單因素考察與星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方，對(duì)制備的新型膠束制劑進(jìn)行了理化性質(zhì)評(píng)估。研究結(jié)果表明，以mPEG-PLA/P123為載體材料制備的ETP膠束制劑，在水溶性、安全性、緩釋性、穩(wěn)定性和載藥量等方面均具有顯著優(yōu)勢(shì)，是一種極具應(yīng)用前景的納米制劑。

今后，關(guān)于ETP mPEG-PLA/P123納米膠束制劑的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布以及抗腫瘤活性與機(jī)制方面還有待作進(jìn)一步的研究。

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