雙向伯克霍爾德氏菌(Burkholderia ambifaria)的研究進展

馬賽箭 安超 薛文嬌 劉晨 丁浩

摘要：雙向伯克霍爾德氏菌（Burkholderia ambifaria）是伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的一個種，廣泛存在于植物根際土壤及植物體內(nèi)。現(xiàn)有研究表明，除了個別菌株具有致病性外，大部分雙向伯克霍爾德氏菌具有許多對植物和環(huán)境有益的功能，如生物修復、固氮、促生、誘導植物抗性等。近年來，雙向伯克霍爾德氏菌已經(jīng)在生物防治、生物促生、疫苗研制、天然產(chǎn)物開發(fā)等方面被廣泛研究，是一種具有重要應用價值的微生物資源。本文綜述了雙向伯克霍爾德氏菌的研究現(xiàn)狀，旨在為進一步應用研究提供參考。

關鍵詞：伯克霍爾德氏菌;生物防治;生物促生;天然產(chǎn)物;脂肪酶;疫苗開發(fā)

中圖分類號：S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0023-05

伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）是1992年根據(jù)基因分析后從假單胞菌屬（Pseudomonads）中分離出來的一個僅含7個物種的獨立屬[1]。伯克霍爾德氏菌屬最初是以植物和人類致病菌[洋蔥伯克霍爾德氏菌群（Burkholderia cepacia complex，簡稱Bcc）和類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）]的身份進入人類視野[2]。然而，隨著研究的深入，人們逐漸認識到伯克霍爾德氏菌屬廣泛分布于各種生境，是一類種類繁多、功能多樣的革蘭氏陰性菌，正式命名已經(jīng)達到100多種（http：//www.bacterio.net/burkholderia.html）。它們或獨立生存于水體、土壤中，或在植物、動物、真菌體內(nèi)寄生或共生?，F(xiàn)有的研究表明，除了個別伯克霍爾德氏菌屬菌株具有致病性外，伯克霍爾德氏菌屬的大部分物種擁有許多對植物、環(huán)境有益的功能，如生物修復、固氮、促生、誘導植物抗性等[3]。因此，伯克霍爾德氏菌屬受到越來越多地關注，并成為植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）的一個熱點研究菌屬[4]。雙向伯克霍爾德氏菌（Burkholderia ambifaria）是Coenye等于2001年在對19株來源于環(huán)境和臨床的洋蔥伯克霍爾德氏菌相似株進行多相分類研究時，提出的一個Bcc新成員，命名為雙向伯克霍爾德氏菌，模式菌株為B. ambifaria AMMD LMG 19182[5]。近年來，國內(nèi)外都進行了雙向伯克霍爾德氏菌在生物防治方面的研究，在生物酶制劑、疫苗研制、天然產(chǎn)物開發(fā)領域雙向伯克霍爾德氏菌也表現(xiàn)出一定的潛力。本文對雙向伯克霍爾德氏菌的生物功能研究現(xiàn)狀進行綜述，并展望其發(fā)展趨勢，以期為雙向伯克霍爾德氏菌的研究與利用提供參考依據(jù)。

1 雙向伯克霍爾德氏菌防治植物病害的有效成分

雙向伯克霍爾德氏菌具有多種抑制植物病源真菌活性的功能，能有效抑制黃瓜、胡椒、大豆、草莓和番茄中的土傳真菌包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、終極腐霉菌（Pythium ultimum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）等[6-7]。此外，該菌也可在體外及辣椒根部有效抑制寄生的根結線蟲（Meloidogyne incognita）的生長，控制其種群生物量，是一種具有廣譜抑制植物病蟲害的微生物[8]。經(jīng)基因組分析顯示，雙向伯克霍爾德氏菌基因中含有多種抗生素合成基因簇，圖1是雙向伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的抗生素的結構。

研究者于2009年首次從B. ambifaria 2.2N的菌體噴霧干燥物中分離獲得了Burkholdines（簡稱Bk），它是一類具有抗真菌活性的環(huán)脂肽物質(zhì)，是由2個非蛋白質(zhì)氨基酸組成;獲得的Burkholdines是包含β-羥基色氨酸和β-羥基天冬酰胺的八肽化合物BK-1229和BK-1097（圖1-A），這2個化合物對多個真菌具有抑制作用，且對供試真菌的抑菌效價是兩性霉素B的2～60倍[9]。隨后，該團隊又從B. ambifaria 2.2N菌中分離出3個Burkholdines類化合物，分別為Bk-1119、Bk-1213 和Bk-1215（圖1-B），并對這3個純化合物的抗真菌活性和溶血活性進行了評估，結果顯示它們對3個供試真菌釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）的抑制效價是兩性霉素B的25倍[10]。因此，推斷這些化合物可以為新型抗真菌藥物開發(fā)提供先導結構。對64株不同來源的雙向伯克霍爾德氏菌進行基因組挖掘及代謝組分析顯示，雙向伯克霍爾德氏菌擁有抗生素頭孢菌素（Cepacin）生物合成基因簇且能夠代謝產(chǎn)生抗生素Cepacin（圖1-C）;進一步測試表明，Cepacin能夠有效防治由真菌引起的作物真菌病害[11]。烯酰氧基蛋白（Enacyloxins）是由聚酮合酶（polyketide synthase，簡稱PKS）編碼的一類罕見的多烯類抗生素，Mahenthiralingam等篩選出了幾株具有抗菌活性的雙向伯克霍爾德氏菌菌株，它們對廣泛耐藥的革蘭氏陰性病原菌鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）表現(xiàn)出很強的抗菌活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株的抗菌代謝化合物為Enacyloxins（圖1-D）[12]。硝吡咯菌素（Pyrrolnitrin）（圖1-E）是一種強效的抗真菌、抗細菌的次級代謝產(chǎn)物，可由伯克菌屬、假單胞菌屬、黏球菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等產(chǎn)生。硝吡咯菌素在Bcc菌株對植物病源真菌如立枯絲核菌和鐮刀菌的生物防治中起關鍵作用。除此之外，硝吡咯菌素也能抑制白色念珠菌和一些革蘭氏陽性細菌的生物活性，但對革蘭氏陰性菌無效。雖然，目前沒有從雙向伯克菌中分離獲得硝吡咯菌素化合物的報道，但在B. ambifaria菌中發(fā)現(xiàn)了硝吡咯菌素合成基因及操縱子基因[13]。此外，筆者已經(jīng)通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術在雙向伯克霍爾德氏菌種中檢測到了硝吡咯菌素化合物。

雙向伯克霍爾德氏菌還能產(chǎn)生具有生防活性的揮發(fā)性物質(zhì)。研究者分別收集來源于植物根、根際土和臨床的3株雙向伯克霍爾德氏菌在獨立生長過程中的揮發(fā)性物質(zhì)，并進行植物促生、病原真菌生長抑制及細菌耐藥性等活性分析。結果表明，3株菌株中揮發(fā)性混合物組成相似，以含硫化合物、酮和芳香族類化合物為主要組成成分，其中，二甲基二硫醚（dimethyl disulfide）的含量最高。進一步分析顯示，二甲基二硫醚、乙酰苯（acetophenone）、3-己酮（3-hexanone）能夠促進植物根及地上部分生長;二甲基二硫、三硫化合物（dimethyl trisulfide）、4-辛酮（4-octanone）、甲基硫代磺酸甲酯（S-methyl methanethiosulfonate）、1-phenylpropan-1-one和2-十一酮（2-undecanone）能夠有效抑制病源真菌生長;二甲基三硫化物（dimethyl trisulfide）、1-甲硫基-3-戊酮（1-methylthio-3-pentanone）、鄰氨基苯乙酮（O-aminoacetophenone）等化合物具有增強大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性。另外，通過構建突變株的方法證明，這些活性揮發(fā)性物質(zhì)的分泌是不受群體感應（quorumsensing，簡稱QS）機制調(diào)控的[14]。

2 雙向伯克霍爾德氏菌的促生作用

雙向伯克霍爾德氏菌除了能抑制植物病源真菌，也能促進植物生長、生成促生代謝物。從大麥根際細菌中篩選出1株同時具有拮抗病源真菌和促進植物生長功效的菌株T16，經(jīng)過分子生物學鑒定為B. ambifaria，該菌株還能夠代謝產(chǎn)生鐵載體（siderophore）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，簡稱IAA）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC），該菌也具有形成生物膜（biofilm）、溶解態(tài)有機磷（dissolved organic phosphorus）等特性，并在大田試驗中能夠使大麥增產(chǎn)8%[15]。氮是植物生長不可或缺的營養(yǎng)元素，是合成蛋白質(zhì)的主要來源。固氮菌可以把空氣中植物無法吸收的氮氣轉化為氨，為植物提供可直接利用的氮源。固氮菌主要有根瘤菌屬（Rhizobium）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）和一些藍細菌。除此之外，伯克菌屬的多個種屬也具有這一能力，其中也包括雙向伯克霍爾德氏菌。在利用5種不同的根際細菌對籽粒莧（Amaranthus cruentus）進行促生增產(chǎn)研究時，發(fā)現(xiàn)B. ambifaria Mex-5能顯著促進籽粒莧的增產(chǎn)，深入研究發(fā)現(xiàn)促生增產(chǎn)主要是該菌能夠協(xié)助植物攝入空氣中的氮元素[16]。此外，B. ambifaria MCI 7菌株能協(xié)助玉米攝入氮元素[17]。

3 雙向伯克霍爾德氏菌的生防、促生機制

雙向伯克霍爾德氏菌除了能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及促生物質(zhì)外，還具有一些生防機制（環(huán)境定殖特性、植物互作特性、群體效應特性等），這可能與其擁有不同尋常的大基因組（3～9 Mb）有關，這些基因組中包含1～3個染色體和多達5個質(zhì)粒[11]。雙向伯克霍爾德氏菌可在多種植物體內(nèi)定殖，它首先定殖于根表，然后通過細胞內(nèi)膜間隙、次生根節(jié)點、表皮的傷口區(qū)域等滲透到細胞內(nèi)[18]。伯克霍爾德氏菌可耐受植物根部的分泌物，從而有利于其在根部定殖，同時，還能生成抗細菌物質(zhì)，使得它和其他的土壤細菌競爭時更具有優(yōu)勢。此外，伯克霍爾德氏菌的定殖也能夠促進植物互作，提高植物防御體系，這些防御體系包括活性氧（ROS）、植物激素的產(chǎn)生，絲裂原活化蛋白激酶的激活及胼胝質(zhì)沉積等[19-20]。

群體感應是一種基于微環(huán)境中信號分子釋放的細菌細胞間的通信系統(tǒng)。當細菌數(shù)量增加時，信號分子濃度增加，達到一個閾值從而觸發(fā)目標基因的調(diào)節(jié)[21]。QS系統(tǒng)最初是在費氏弧菌（Vibrio fischeri）中發(fā)現(xiàn)的[22]，后來才認識到它在細菌中普遍存在，被認為是細菌感知微環(huán)境并與之相互作用的一種手段。在革蘭氏陰性菌中，N-?；呓z氨酸內(nèi)脂（AHLs）是最常用的信號分子，通常由LuxI蛋白家族的自誘導合成酶產(chǎn)生，并被LuxR家族的轉錄調(diào)節(jié)因子感知，CepR則作為轉錄調(diào)節(jié)因子，這個CepI/R系統(tǒng)可調(diào)節(jié)多種胞外物質(zhì)，除了生成毒力因子外，還具有生成鐵載體、提高蛋白酶活性、形成生物膜等功能[23]。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析顯示，在B. ambifaria HSJ1菌株中C8-HSL是主要的信號分子，含量可達3 mg/L。利用表型研究和全基因組轉座子誘變篩選的方法來識別該菌株受QS調(diào)控的基因及功能時發(fā)現(xiàn)，在雙向伯克霍爾德氏菌B. ambifaria HSJ1中鐵載體含量、蛋白酶活性、膽固醇氧化酶活性、溶血活性、病原真菌抑菌活性、毒力、菌落形態(tài)都是受CepI調(diào)節(jié)的，即這些都是受QS調(diào)控的。此外，雙向伯克霍爾德氏菌的幾種抗真菌化合物Burkholdines、Enacyloxins和硝吡咯菌素的產(chǎn)生也已經(jīng)被證明均受QS控制[13]。此外，QS系統(tǒng)在根際定殖，與植物、多種微生物菌群落的相互作用中都起著至關重要的作用。

4 雙向伯克霍爾德氏菌的其他作用

4.1 脂肪酶生產(chǎn)

除了生防和促生作用之外，雙向伯克霍爾德氏菌也被報道能夠產(chǎn)生脂肪酶。從1株耐有機溶劑的雙向伯克霍爾德氏菌YCJ01中通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離出分子量為 34 ku 的脂肪酶，該酶在一定范圍內(nèi)的溫度、pH值、溶劑體系下活性穩(wěn)定，在有機催化及制藥領域具有一定的開發(fā)價值[24]。

4.2 相關疫苗開發(fā)

雙向伯克霍爾德氏菌同洋蔥伯克霍爾德氏菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌一樣，都屬于條件性致病菌，可誘發(fā)易感人群（如肺部囊性纖維化患者或慢性肉芽腫病患者）產(chǎn)生不可控的壞死性肺炎和敗血癥[25]。

目前，還沒有針對伯克霍爾德氏菌的有效疫苗。雖然減毒活疫苗和熱滅活細菌疫苗都已被證明，作為各種細菌性病原體的候選疫苗是高度有效的，但是，這類針對伯克菌的疫苗對小鼠的疾病和死亡幾乎沒有任何保護作用。另一種可能見效的疫苗類型是傳統(tǒng)的結合疫苗，原理是細菌表面多糖通過化學方法與載體蛋白結合。這類疫苗已被證明是非常有效的，如b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）結合疫苗，它幾乎消除了世界上大部分地區(qū)的感染。然而，制造這些結合疫苗需要復雜的化學合成技術將多糖附著在蛋白質(zhì)載體上[26]。

細菌脂多糖由脂質(zhì)、核心寡糖和O-抗原組成，是細菌和宿主細胞進行交流的重要因子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，可以作為一種理想的抗原靶標。而Bcc脂多糖上的O-抗原是抗體識別必不可少的部分，與細菌的入侵和毒力有關。它不僅可以激發(fā)細胞因子促進IL-1β的產(chǎn)生，還有調(diào)節(jié)巨噬細胞吞噬的作用和干擾支氣管上皮細胞的細菌黏附作用[27]。Castro等成功地對B. ambifaria 19182的O-抗原進行了分離和結構鑒定，獲得該菌含有O-抗原的2種結構多糖OPS-1和OPS-2，其中首次在Bcc菌屬中發(fā)現(xiàn)OPS-2重復單元結構中含有一分子的6-脫氧阿卓糖[28]。近年來隨著化學合成技術的進步，純度更高且結構更明確的寡糖分子（包括O-抗原）被合成并用于設計、開發(fā)預防Bcc感染的糖綴合物疫苗。Wang等基于 OPS-2 抗原的二糖重復單元設計并合成得到了3個目標化合物，同時還在目標分子還原端的糖基碳元素上引入含有游離氨基的丙基鏈，以利于它們與具有活性的載體蛋白或者載體分子鏈接形成糖綴合物，用于后續(xù)B. ambifaria致病菌的臨床診斷以及生物疫苗研究[29]。

5 展望

目前，芽孢桿菌（Bacillus）和假單胞菌（Pseudomonas）已經(jīng)被廣泛用做農(nóng)用生物菌劑，在生物防治和促生方面具有顯著的效果。然而，在實際應用過程中，土壤中的農(nóng)藥殘留以及植物致病菌產(chǎn)生的有害代謝物可能會抑制生防、促生菌的定殖，進而限制微生物菌劑的效果。伯克霍爾德氏菌具有一定的藥物耐受性，同時具有降解多種有害物質(zhì)的特性。基于一些致病性鐮刀菌（fusarium）感染作物過程中會在土壤中釋放出有害代謝物鐮刀菌酸（fusaric acid），破壞作物根際微生態(tài)環(huán)境，而普通生防菌容易被鐮刀菌酸抑制不能定殖發(fā)揮作用的問題，有學者從環(huán)境中分離獲得一株同時具有降解鐮刀菌酸和抑制大麥致病性鐮刀菌（Fusarium）的B. ambifaria T16[15]。因此，系統(tǒng)調(diào)查目標作物土壤的物化特性，篩選能夠適應目標作物土壤物化環(huán)境且能夠改善現(xiàn)有作物土壤微生態(tài)及理化特性的多功能雙向伯克霍爾德氏菌菌株是未來研究的發(fā)展趨勢。

伯克霍爾德氏菌在20世紀曾經(jīng)被開發(fā)成生物農(nóng)藥商品并上市，如在美國注冊的有Blue Circle、Type Wisconsin、Deny、Intercepty、MBI-206 EP等。然而，在20世紀90年代，伯克霍爾德氏菌被證明與囊性纖維化（CF）患者的嚴重肺部感染有關，因此人們擔心它們的生物安全性，最終這些微生物殺菌/蟲劑撤出市場。采用類似生產(chǎn)活疫苗的基因工程技術，利用基因編輯技術刪除雙向伯克霍爾德氏菌中與致病性相關的基因簇，獲得伯克霍爾德氏菌突變株，該菌株在植物盆栽試驗中展示出良好的生物防治特性，而在小鼠肺部感染模型中未引起感染[11]。生防菌在植物體中的定殖與互作是直接影響生防菌生防效果的關鍵因素。針對一株具有促生功效的B. tropica strain MTo-293構建熒光蛋白標記菌株，通過熒光示蹤試驗表明，該菌株能夠在番茄根部有效地定殖且能夠蔓延到植物各個組織，有效地定殖使得接種該促生菌的西紅柿產(chǎn)量顯著提高[30]。因此，隨著分子生物技術的快速發(fā)展，利用高通量測序、基因編輯、熒光標記示蹤等技術開發(fā)安全、有效的基于雙向伯克霍爾德氏菌的生防菌亦是未來的發(fā)展趨勢。

伯克霍爾德氏菌基因組中聚酮合酶和非核糖體多肽基因簇數(shù)量僅次于放線菌，能夠產(chǎn)生大量活性次級代謝產(chǎn)物，是一類重要的天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌。然而，全基因組測序發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌基因組中仍然含有大量的隱秘生物合成基因簇尚未開發(fā)。隨著測序技術的快速發(fā)展和測序價格的降低，完整的微生物全基因組序列有助于通過基因挖掘技術發(fā)現(xiàn)更多有價值的信息。利用基因組挖掘技術從雙向伯克霍爾德氏菌AMMD菌株中發(fā)現(xiàn)了抗菌物質(zhì)cepaciachelin和鳥氨酸（ornibactin）合成基因簇[31];基于基因組數(shù)據(jù)挖掘，從B. ambifaria中發(fā)現(xiàn)了Dioxygenase合成基因簇并進行異源表達[32];對來源于B. ambifaria AMMD 中的Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶[Fe（Ⅱ）/α-ketoglutarate-dependent dioxygenase]基因進行大腸桿菌的異源表達，純化獲得的該酶能夠高效催化N-取代-L-亮氨酸（N-substituted L-amino acids）轉化為N-取代-L-蘇式-羥基亮氨酸（N-succinyl L-threo-hydroxyleucine）[33];山東大學張友明教授團隊建立了伯克氏菌中以Red/ET DNA重組工程技術為核心的基因組編輯和隱秘生物合成途徑的原位激活平臺，基于該技術實現(xiàn)了3株伯克氏菌的基因組發(fā)掘，激活和鑒定出多個隱秘基因簇，并對2類新型的脂肽類化合物glidopeptins和rhizomides的結構和生物活性進行了系統(tǒng)研究[34]。因此，通過生物信息學分析及基因編輯等技術，基于雙向伯克霍爾德氏菌開展同源細胞工廠構建或未知基因簇異源表達體系挖掘新結構、新活性天然產(chǎn)物也是未來的發(fā)展方向。

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