二甲四氯植物內(nèi)生降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究

封國(guó)君 杜良偉 龍迪 曾東強(qiáng) 王彥輝

摘要：【目的】篩選可降解二甲四氯除草劑的內(nèi)生真菌，研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)二甲四氯的降解特性和途徑，為除草劑污染的微生物治理提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎闷桨迮囵B(yǎng)法從被二甲四氯嚴(yán)重污染的飛機(jī)草中篩選可降解二甲四氯除草劑的內(nèi)生真菌;采用形態(tài)學(xué)方法觀(guān)察內(nèi)生真菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)，結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)內(nèi)生真菌的ITS、TUB和LUS序列進(jìn)行克隆和測(cè)序，對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定;通過(guò)單因素法優(yōu)化內(nèi)生真菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)二甲四氯的降解條件（溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)源）;并采用液相色譜標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）鑒定內(nèi)生真菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中降解二甲四氯的產(chǎn)物。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別添加內(nèi)生真菌到不滅菌土壤和滅菌土壤中，同時(shí)設(shè)不添加內(nèi)生真菌的土壤為對(duì)照組，測(cè)定二甲四氯在土壤中的降解速率。【結(jié)果】從飛機(jī)草中初篩發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌可很好地降解二甲四氯，編號(hào)為E68，結(jié)合形態(tài)學(xué)和基因序列分析可將E68鑒定為樹(shù)狀炭角菌（Xylaria arbuscula）。在二甲四氯初始濃度為50.0 mg/L條件下，E68降解二甲四氯的最優(yōu)條件是pH 5.0、溫度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖，7 d后其降解率為97.03%。E68在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯。在含有2.5 mg/kg二甲四氯的土壤中添加E68，可明顯提高二甲四氯在土壤中的降解率;與不添加E68的土壤相比，在不滅菌和滅菌土壤中分別接入E68后，二甲四氯的降解半衰期分別提高2.8和2.5倍 ?！窘Y(jié)論】從飛機(jī)草中分離出的內(nèi)生真菌E68在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修復(fù)環(huán)境中二甲四氯污染的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 二甲四氯;生物降解;內(nèi)生真菌;樹(shù)狀炭角菌;降解特性

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1263-10

Abstract：【Objective】This experiment aimed to screen and identify 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid （MCPA）-degrading endophytic fungi from plants and studied the degradation characteristics and pathway of the isolated endophytic fungi to MCPA. The study provided atheoretical basis for the bioremediation of herbicide-contaminated environment. 【Method】Used plating method， endophytic fungus for degradation of MCPA were isolated from MCPA-contaminated Eupatorium odoratum. The isolated endophytic fungus was identified through morphological feature observed on the medium， combined with molecular biology method， cloning and sequencing of ITS， TUB and LUS sequences were conducted. The degradation conditions including temperature， pH， nutrition source were also optimized in the mineral salt medium by single-factor test.? The degradation product of MPCA by endophytic fungi was identified in the mineral salt medium using high performance liquid chromatography（HPLC）， gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）.? In constant temperature incubator（30 ℃）， endophytic fungi were added into non-sterile soil and sterile soil， and soil adding no endophytic fungi was as control group， and degradation rate of MCPA in soil were detected. 【Result】An endophytic fungus strain （numbered E68）， screened from E. odoratum， could effectively degrade MCPA.The E68 was identified as Xylaria arbuscula according to the analysis of its phenotypic feature and gene sequence. When the initial concentration of MCPA was 50.0 mg/L， the optimum degradation condition of MCPA was pH 5.0， temperature 28 °C and adding 0.5% glucose，the degradation rate was 97.03% after 7 d. The main production of strain E68 degrading MCPA was 4-chloro-2-methylphenol. Adding E68 into soil with 2.5 mg/kg MCPA could increase the degradation rate of MCPA in soil. Compared with soil without E68， the half-lives of MCPA increased 2.8 times in non-sterilized soil adding strain E68 and increased 2.5 times in sterilized soil adding strain E68. 【Conclusion】The endophytic fungus E68 isolated from E. odoratum can effectively degrade MCPA in inorganic salt media and soils， and has potential value for the bioremediation of MCPA-contaminated environment.

Key words： 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid; biodegradation; endophytic fungus; Xylaria arbuscula; degradation characteristics

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）; National Natural Science Foundation of China（31660524）; Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198140）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2018YM23）

0 引言

【研究意義】二甲四氯（2-甲基-4-氯苯氧乙酸） 是苯氧羧酸類(lèi)除草劑的一種，是廣西甘蔗生產(chǎn)使用最多的一種激素類(lèi)除草劑，主要用于防控闊葉雜草和莎草等。二甲四氯主要加工成鹽制劑使用，其在水中的溶解度高，易隨著雨水淋溶而污染地下水（Matamoros et al.，2012;Loos et al.，2017）。研究證實(shí)，二甲四氯在土壤中殘留期相對(duì)較長(zhǎng)，尤其在酸性土壤中殘留期更長(zhǎng)（López-Pi?eiro et al.，2013），對(duì)生態(tài)環(huán)境有潛在風(fēng)險(xiǎn)。廣西蔗田主要為酸性土壤，且間套種多種作物，二甲四氯易對(duì)間套種作物和后茬敏感作物產(chǎn)生藥害。微生物降解是二甲四氯在土壤環(huán)境中最主要的降解方式之一。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌與植物互惠共生，對(duì)去除環(huán)境中農(nóng)藥等有機(jī)污染物及生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)具有顯著效果（馮發(fā)運(yùn)等，2015;Tétard-Jones and Edwards，2015;Trognitz et al.，2016）。因此，篩選具有降解二甲四氯能力的植物內(nèi)生菌并對(duì)其降解特性進(jìn)行研究，對(duì)修復(fù)受二甲四氯污染的土壤和水體具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】物理和化學(xué)方法是去除土壤和水體有機(jī)物污染的高效手段（Chair et al.，2017a，2017b），但對(duì)農(nóng)業(yè)來(lái)說(shuō)成本較高。自然環(huán)境中微生物資源豐富，存在大量可有效降解有機(jī)物的微生物（Ellegaard-Jensen et al.，2017;Sam et al.，2017）。研究發(fā)現(xiàn)土壤或淤泥中存在多種可降解苯氧羧酸類(lèi)除草劑的細(xì)菌，Wu等（2017）分離出的Cupriavidus gilardii T-1可快速降解苯氧羧酸類(lèi)除草劑2，4-D、2，4-D丁酯、二甲四氯和二甲四氯丁酯等，但對(duì)二甲四氯丁酯的降解效率遠(yuǎn)低于二甲四氯;Xia等（2017）分離出的無(wú)色桿菌（Achromobacter sp.）可降解2，4-D最終生成3-氧代己二酸二乙酯，進(jìn)入TCA循環(huán)，還可降解二甲四氯。細(xì)菌降解苯氧羧酸類(lèi)除草劑2，4-D的機(jī)制研究已較清楚，主要涉及tfd基因編碼的酶催化2，4-D（Wu et al.，2017;Xia et al.，2017）。目前已分離出可降解2，4-D和二甲四氯除草劑的多種細(xì)菌，同時(shí)對(duì)2，4-D的降解機(jī)制研究較深入，但針對(duì)二甲四氯降解機(jī)制的研究較少。內(nèi)生菌是一種重要的微生物資源，既可有效降解有機(jī)物，又能與植物聯(lián)合進(jìn)行生態(tài)修復(fù)，還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)等（傅婉秋等，2017;陶佳雨等，2019）。Liu等（2014）從煙草中分離出1株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），其對(duì)二氯喹啉酸的降解率高達(dá)93%;馮發(fā)運(yùn)等（2015）從小飛蓬中分離出的阪崎克羅諾桿菌屬（Cronobacter sp.）可高效降解毒死蜱，尤其是添加外源營(yíng)養(yǎng)源可明顯提高其對(duì)毒死蜱的降解率;Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）分離出的2株內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis sp.）可降解阿魏酸、肉桂酸和芥子酸等有機(jī)物，并對(duì)其降解機(jī)制進(jìn)行深入研究;Wang等（2017）從甘蔗中分離出的間型脈孢菌（Neurospora intermedia）可有效降解敵草隆，鑒定代謝產(chǎn)物證明該菌通過(guò)連續(xù)脫烷基方式降解敵草隆。目前，降解二甲四氯的真菌，尤其是植物內(nèi)生真菌鮮有報(bào)道，對(duì)其降解二甲四氯的機(jī)制或途徑尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人主要從污染的土壤和水體中分離二甲四氯降解菌，對(duì)植物內(nèi)生真菌降解二甲四氯的研究較少，對(duì)二甲四氯的降解途徑和微生物修復(fù)土壤中二甲四氯污染的研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從被二甲四氯嚴(yán)重污染的植物中分離對(duì)二甲四氯有降解效果的內(nèi)生真菌，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定;采用單因素法優(yōu)化內(nèi)生菌降解二甲四氯的條件;運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）等手段鑒定降解產(chǎn)物;在室內(nèi)可控條件下，將分離獲得的內(nèi)生菌接種到土壤中進(jìn)行土壤修復(fù)研究，以期為微生物治理除草劑殘留污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試植物：飛機(jī)草，來(lái)源于生產(chǎn)二甲四氯的農(nóng)藥廠(chǎng)及其附近。供試除草劑：98.0%二甲四氯鈉原藥（廣西田園生化股份有限公司提供）。主要試劑：胰蛋白胨和酵母提取物（英國(guó)Oxoid公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，真菌DNA提取試劑盒（Omega Biotek公司）;Taq PCR StarMax試劑（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：安捷倫高效液相色譜儀（HPLC）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）;光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;恒溫振蕩搖床（常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）;高速離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司）;PCR儀（杭州柏恒科技有限公司）等。

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MM）：K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，NH4NO3 1.00 g，NaCl 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1000.0 mL，pH 7.0;無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基（MMA）：MM培養(yǎng)基中加15.00 g瓊脂粉。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 內(nèi)生降解菌分離 參照Khan等（2014）的平板培養(yǎng)法分離內(nèi)生菌并略有改進(jìn)。選取健康的植物組織，在超凈工作臺(tái)中用剪刀剪成約2 cm長(zhǎng)，以75.0%酒精浸泡消毒2 min，再用2.0%次氯酸浸泡2 min，無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～5次，在滅菌研缽中快速將組織磨碎，取100 μL磨碎的樣品溶液涂布于含二甲四氯的MMA培養(yǎng)基表面，28 ℃下培養(yǎng)7 d。用最后一次洗脫的無(wú)菌水涂布于LB和PDA培養(yǎng)基上，驗(yàn)證表面滅菌效果。

在MMA培養(yǎng)基上挑取不同形態(tài)的真菌，在含二甲四氯的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，直至菌落單一后進(jìn)行編號(hào)保存，以備后續(xù)進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證降解效果。

1. 2. 2 二甲四氯降解菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將純化好的內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀(guān)察其形態(tài)，以尺子測(cè)量其直徑，采用不同方式誘導(dǎo)并觀(guān)察其產(chǎn)生孢子情況。

分子生物學(xué)鑒定：按照DNA抽提試劑盒說(shuō)明提取真菌總DNA。采用3對(duì)引物[委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成]對(duì)內(nèi)生真菌的ITS、TUB和LSU進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×PCR StarMix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。按照表1文獻(xiàn)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果與GenBank已公布的核酸序列進(jìn)行同源比對(duì)。

1. 2. 3 內(nèi)生菌降解二甲四氯特性分析 單因素法優(yōu)化降解條件：分別研究不同溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)源對(duì)分離所得的內(nèi)生真菌降解二甲四氯效果的影響。二甲四氯的起始濃度均為50.0 mg/L，當(dāng)pH 7.0時(shí)分別設(shè)5個(gè)不同溫度：20、25、30、35和40 ℃，測(cè)定內(nèi)生菌在5個(gè)不同溫度下對(duì)二甲四氯的降解效果，確定最佳溫度;固定培養(yǎng)溫度為30 ℃，分別采用1.0 mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，研究pH對(duì)內(nèi)生菌降解二甲四氯的影響;在溫度為30 ℃、pH 7.0時(shí)，分別加入0.5%的淀粉、葡萄糖、蔗糖、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)源，測(cè)定添加不同外源營(yíng)養(yǎng)源時(shí)內(nèi)生菌降解二甲四氯的效果。以二甲四氯在不添加內(nèi)生菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的自然降解為空白對(duì)照。

1. 2. 4 降解產(chǎn)物鑒定 按照優(yōu)化的降解條件進(jìn)行降解產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定，分別在降解5、7和14 d進(jìn)行取樣，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。代謝產(chǎn)物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，LC-MS和GC-MS確證，HPLC法測(cè)定降解產(chǎn)物的變化規(guī)律。

1. 2. 5 土壤修復(fù)試驗(yàn) 添加回收試驗(yàn)：稱(chēng)取空白土壤樣品20 g，土壤二甲四氯添加水平分別為0.50、1.25和2.50 mg/kg，并設(shè)空白對(duì)照，在25 ℃下放置4 h。將上述土壤轉(zhuǎn)用40 mL乙腈振蕩提取1.5 h，加入5 g NaCl，4000 r/min離心5 min，吸取上清液30 mL，經(jīng)3 g無(wú)水MgSO4吸水后4000 r/min離心5 min，取上清液20 mL用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下旋蒸至干，用2 mL乙腈定容后過(guò)有機(jī)相膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待測(cè)（程靜等，2010）。

土壤修復(fù)試驗(yàn)：設(shè)滅菌土壤、滅菌土壤+內(nèi)生真菌、不滅菌土壤和不滅菌土壤+內(nèi)生真菌4個(gè)處理，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱(chēng)取陰干粉碎的土壤20 g放入三角瓶中，滅菌土壤在121 ℃下20 min滅菌后添加菌液，非滅菌土壤直接添加菌液進(jìn)行土壤修復(fù)試驗(yàn)。土壤中二甲四氯含量為2.5 mg/kg，接入10.0 mL在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的真菌培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)PDB培養(yǎng)基作對(duì)照，分別于培養(yǎng)0、3、5、7、10和14 d取樣，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)過(guò)程中在無(wú)菌環(huán)境下接入無(wú)菌水以防止土壤干燥（Chen et al.，2011a，2011b）。

1. 3 儀器條件

高效液相色譜儀1260 HPLC-UV，其色譜柱為安捷倫XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水（含0.2%乙酸）=70∶30等度洗脫，UV波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，二甲四氯和產(chǎn)物4-氯-2-甲基苯酚在液相色譜的保留時(shí)間分別為6.3和7.6 min（簡(jiǎn)秋等，2015）。

液質(zhì)聯(lián)用儀TSQ Endura（賽默飛世爾科技公司）條件參照程靜等（2010）的方法。色譜柱：Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm 1.9 Micron）;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL;柱溫：35 ℃;APCI離子源，正負(fù)離子模式;霧化氣：氮?dú)?離子傳輸管溫度：320 ℃;噴針溫度：400 ℃;流動(dòng)相為甲醇和水，采用梯度洗脫。

氣質(zhì)聯(lián)用儀為7890A-5975C（安捷倫科技有限公司），色譜柱DB-1701MS;氦氣流速1 mL/min;采用不分流進(jìn)樣量模式，進(jìn)樣量1 μL;柱溫箱采用程序升溫：初始溫度40 ℃保持3 min，8 ℃/min升至230 ℃，保持20 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;接口溫度280 ℃;EI離子源。

1. 4 數(shù)據(jù)處理分析

二甲四氯降解率（η，%）按公式（1）計(jì)算：

式中，C0為空白對(duì)照中二甲四氯總濃度（mg/L），Ct為t 時(shí)間樣品培養(yǎng)液中二甲四氯殘留濃度（mg/L）。

二甲四氯降解動(dòng)力學(xué)方程采用指數(shù)回歸方程（2）計(jì)算：

Ct=C0e-kt? ? ? ? ? ?（2）

式中，C0為二甲四氯初始濃度（mg/L）;Ct為t 時(shí)間二甲四氯殘留濃度（mg/L）;k為降解速率常數(shù);t為二甲四氯與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的時(shí)間。

半衰期按照公式（3）計(jì)算：

t0.5=[Ln2k]

式中，t0.5為二甲四氯的降解半衰期。

2 結(jié)果與分析

2. 1 二甲四氯降解菌鑒定結(jié)果

初篩發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌對(duì)二甲四氯具有較好的降解效果，編號(hào)為E68，選取E68為研究對(duì)象，提交至菌種保藏中心，編號(hào)為GDMCC No.60162。

2. 1. 1 E68形態(tài)學(xué)鑒定 將E68接種至含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中于28 ℃下培養(yǎng)，結(jié)果顯示，E68的生長(zhǎng)速度為4.5 mm/d，菌絲白色，輻射匍匐狀，菌落中心與邊緣厚度基本一致，菌落邊緣呈雪花狀，培養(yǎng)30 d后，表面長(zhǎng)出黑色斑塊（圖1）。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，E68菌株的菌絲透明、有隔（圖2）。采用環(huán)境脅迫、紫外照射和紫羅蘭培養(yǎng)等多種方式培養(yǎng)，均未觀(guān)察到該菌產(chǎn)孢現(xiàn)象。

2. 1. 2 序列分析 對(duì)E68的ITS、TUB和LSU進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序長(zhǎng)度分別為547、412和911 bp，將序列提交至NCBI，ITS、TUB和LSU的序列號(hào)分別為KY797679.1、MW380415.1和MW520950.1。3個(gè)序列經(jīng)NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)E68與NCBI已公布的炭角菌屬（Xylaria sp.）同源性高達(dá)99%。根據(jù)Wendt等（2018）的方法，基于ITS和TUB序列串聯(lián)分析，使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示其與Xylaria arbuscula的相似度最高;LSU序列與3株X. arbuscula（MN611207.1、KY610463.1和MN611203.1）菌株的相似性均高于99%，因此鑒定E68為樹(shù)狀炭角菌（X. arbuscula）。

2. 2 降解特性鑒定結(jié)果

2. 2. 1 降解pH優(yōu)化 為評(píng)估pH對(duì)E68降解二甲四氯效果的影響，將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在30 ℃、150 r/min的搖床上連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖4）顯示，在pH 5.0時(shí)對(duì)二甲四氯的降解率最高，為95.93%;其次在pH 4.0時(shí)降解率為94.38%;pH 6.0～pH 9.0時(shí)降解率隨著pH的升高而降低。所有空白對(duì)照的降解率均小于5.00%。因此，確定E68在酸性條件下降解二甲四氯的效果優(yōu)于中性和堿性，最優(yōu)pH為5.0。

2. 2. 2 降解溫度優(yōu)化 為研究溫度效應(yīng)，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基設(shè)為pH 7.0，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將搖床設(shè)為5個(gè)不同溫度，于150 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)溫度為25 ℃時(shí)對(duì)二甲四氯的降解效率最高，為51.49%;隨著溫度升高或降低，E68對(duì)二甲四氯的降解效率均呈下降趨勢(shì)，其在20、30、35和40 ℃時(shí)的降解率分別為45.61%、50.97%、23.98%和7.30%。空白對(duì)照的降解率小于5.00%。因此，確定E68最佳降解溫度范圍為25～30 ℃，后續(xù)試驗(yàn)選擇28 ℃作為最優(yōu)溫度。

2. 2. 3 外源營(yíng)養(yǎng)源優(yōu)化 研究E68在分別添加葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、淀粉、酵母提取物和蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)源的MM培養(yǎng)基中降解二甲四氯的效果，以二甲四氯為唯一碳源作對(duì)照（CK），不添加E68的MM培養(yǎng)基為空白對(duì)照，在28 ℃、150 r/min的搖床上連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖6）表明，添加淀粉、葡萄糖和蔗糖等營(yíng)養(yǎng)源時(shí)，E68對(duì)二甲四氯的降解率明顯高于二甲四氯作為唯一碳源的降解率，但添加牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨時(shí)降解率明顯降低，可能是改變了該內(nèi)生菌的代謝途徑。因此，后續(xù)降解動(dòng)力學(xué)研究中加入葡萄糖作為碳源。

2. 2. 4 E68降解二甲四氯動(dòng)力學(xué) 在二甲四氯初始濃度為50.0 mg/L條件下，E68降解二甲四氯的最優(yōu)條件為pH 5.0、溫度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖。在優(yōu)化后的條件下，測(cè)定E68在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)二甲四氯的降解動(dòng)力學(xué)。分別于培養(yǎng)1、3、5、7、10和14 d后采樣，結(jié)果顯示，培養(yǎng)1 d后降解率高達(dá)88.46%，隨時(shí)間降解率逐漸增高，分別為94.04%、95.20%、97.03%、97.71%和98.46%，其降解動(dòng)力學(xué)方程為y=11.71e-0.233x，半衰期為3.0 d。

2. 3 降解產(chǎn)物鑒定結(jié)果

3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品甲基對(duì)苯醌、二甲四氯和4-氯-2-甲基苯酚在液相色譜上的保留時(shí)間分別為4.1、6.3和7.6 min，經(jīng)時(shí)間比對(duì)4.1和7.6 min出現(xiàn)相同的峰（圖7-A和圖7-B）。液質(zhì)聯(lián)用儀上4-氯-2-甲基苯酚的保留時(shí)間為2.87 min，分子量m/z 141.0特征離子碎片為m/z 105.1和35.5（圖7-C和圖7-D）;雖然液相色譜上出現(xiàn)與甲基對(duì)苯醌保留時(shí)間一致的色譜峰，但在液質(zhì)聯(lián)用儀上未鑒定到甲基對(duì)苯醌。經(jīng)氣質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該代謝產(chǎn)物在氣質(zhì)聯(lián)用儀上保留時(shí)間為15.5 min，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)該產(chǎn)物確定為4-氯-2-甲基苯酚（4-Chloro-2-methylphenol）（圖7-E和圖7-F）。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品、氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用最終鑒定出內(nèi)生菌E68降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯酚。該降解產(chǎn)物培養(yǎng)第5 d時(shí)在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的含量為1.41±0.15 mg/L，隨著時(shí)間延長(zhǎng)含量緩慢下降，在培養(yǎng)7和14 d時(shí)的含量分別為1.26±0.09和1.09±0.17 mg/L。

2. 4 土壤修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2. 4. 1 土壤添加回收試驗(yàn) 當(dāng)土壤中二甲四氯添加水平分別為0.50、1.25和2.50 mg/kg時(shí)，按1.2.5的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果（表2）顯示，3個(gè)添加水平的平均回收率分別為100.07%、96.26%和98.71%，滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則要求，證明該方法可有效提取土壤中殘留的二甲四氯。

2. 4. 2 E68降解土壤中二甲四氯的效果 在滅菌和不滅菌土壤中分別加入E68，培養(yǎng)14 d后二甲四氯在滅菌土壤、滅菌土壤+E68、不滅菌土壤和不滅菌土壤+E68處理的降解率分別31.6%、57.5%、51.7%和85.5%，其降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，二甲四氯在滅菌土壤中的降解率明顯低于不滅菌土壤，可能與不滅菌土壤中含有豐富的微生物有關(guān);與不添加E68的土壤相比，在滅菌和不滅菌土壤中分別接入內(nèi)生菌E68后，二甲四氯的降解半衰期分別提高2.5和2.8倍。說(shuō)明在土壤中添加E68可明顯提高二甲四氯在土壤中的降解率。

3 討論

內(nèi)生菌廣泛分布于植物體內(nèi)，因具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和對(duì)污染物生物修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注（傅婉秋等，2017;Deng and Cao，2017;劉劍金等，2019）。目前已分離出多個(gè)屬的內(nèi)生真菌可降解農(nóng)藥、塑化劑和環(huán)烴類(lèi)污染物等，一些內(nèi)生菌還具有緩解重金屬對(duì)植物毒害等特點(diǎn)（Deng and Cao，2017;傅婉秋等，2017;韓飛等，2020）。田林雙等（2007）、Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）研究證實(shí)擬莖點(diǎn)酶屬（Phomopsis sp.）內(nèi)生真菌對(duì)多種有機(jī)物有較好的降解效果。封國(guó)君（2017）從農(nóng)藥廠(chǎng)附近的植物中分離出多株可降解二甲四氯的內(nèi)生真菌，并證實(shí)其具有很好的生物修復(fù)效果。Wang等（2017）也從甘蔗中分離出可降解敵草隆的內(nèi)生真菌間型脈孢菌（Neurospora intermedia）。本研究在植物中分離出的炭角菌可有效降解二甲四氯，在土壤中也有明顯的修復(fù)效果，豐富了降解有機(jī)物的內(nèi)生菌資源。

環(huán)境因素（溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)源）明顯影響微生物降解有機(jī)物的效果，不同的內(nèi)生菌只有在最優(yōu)的條件下才能發(fā)揮其最佳降解效果（Stumpe and Marschner，2009）。Maqbool等（2016）報(bào)道認(rèn)為真菌降解農(nóng)藥取決于環(huán)境的溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)源等。Wu等（2017）報(bào)道C. gilardii T-1在25～37 ℃時(shí)對(duì)苯氧羧酸類(lèi)除草劑2，4-D具有較好的降解效果，30 ℃時(shí)效果最佳，當(dāng)達(dá)42 ℃時(shí)降解被抑制;該菌在pH 5～8時(shí)對(duì)2，4-D有較好的降解效果;還發(fā)現(xiàn)菌株C. gilardii T-1在30 ℃的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)二甲四氯7 d的降解率高達(dá)99.7%。Xia等（2017）也發(fā)現(xiàn)溫度和pH等顯著影響降解菌對(duì)苯氧羧酸類(lèi)除草劑的效果，額外添加營(yíng)養(yǎng)源雖然可增加降解菌的生長(zhǎng)，但對(duì)二甲四氯的降解效率無(wú)影響。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變溫度可明顯影響E68對(duì)二甲四氯的降解率，溫度在25～30 ℃時(shí)有較好的降解效果，可能是溫度影響該菌的活性，從而導(dǎo)致對(duì)二甲四氯的代謝率下降。E68在酸性條件（pH 4.0～5.0）下對(duì)二甲四氯的降解效果更優(yōu)，可能是由于分離獲得的菌生活環(huán)境不同所致。添加牛肉膏、蛋白胨和酵母提取物明顯降低E68對(duì)二甲四氯的降解率，推測(cè)這些營(yíng)養(yǎng)源抑制降解二甲四氯酶的活性;添加葡萄糖、蔗糖和淀粉后明顯提高該菌對(duì)二甲四氯的降解率，可能該菌以共代謝的方式降解二甲四氯（Mai et al.，2004）。內(nèi)生菌存活于植物體內(nèi)，通過(guò)攝取植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，同時(shí)在外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用下誘導(dǎo)內(nèi)生菌產(chǎn)生可降解有機(jī)污染物的酶，在酶的作用下可有效降解有機(jī)物。Urbaniak等（2019）、Nowak等（2020）研究表明，在土壤中添加外源物質(zhì)可提高微生物的豐度和誘導(dǎo)產(chǎn)生多種降解二甲四氯的基因，提高微生物對(duì)二甲四氯的降解效果。

目前對(duì)于內(nèi)生菌降解二甲四氯的機(jī)制尚不明晰。本研究通過(guò)標(biāo)品和質(zhì)譜等手段鑒定出E68降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯酚，但該降解產(chǎn)物的含量較低，可能是一些產(chǎn)物的中間體，也可能是該菌產(chǎn)生酶催化二甲四氯生成4-氯-2-甲基苯酚，但其具體的酶學(xué)機(jī)制尚未清楚。Li等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，炭角菌能有效降解西維因的機(jī)制可能與漆酶、細(xì)胞色素P450酶以及酯酶有關(guān)。因此，需進(jìn)一步深入研究E68對(duì)二甲四氯的酶學(xué)降解機(jī)制。

近年來(lái)，利用植物內(nèi)生菌定殖于植物體內(nèi)對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行生物修復(fù)已成為研究熱點(diǎn)（傅婉秋等，2017）。但微生物修復(fù)環(huán)境污染物在實(shí)際應(yīng)用中也存在諸多問(wèn)題（Maqbool et al.，2016;Deng and Cao，2017;Kumar and Sharma，2019），如內(nèi)生菌是如何定殖到植物中，以及如何與植物聯(lián)合降解有機(jī)污染物尚不清楚，微生物投放到環(huán)境中的影響和生態(tài)學(xué)效應(yīng)的研究也不夠深入。本研究將分離獲得的E68接種至土壤中能有效降低二甲四氯的含量，但試驗(yàn)是在室內(nèi)條件下進(jìn)行，對(duì)田間修復(fù)效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。內(nèi)生菌與植物聯(lián)合降解二甲四氯的研究尚未開(kāi)展，其降解機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

從飛機(jī)草中分離出的內(nèi)生真菌E68在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修復(fù)環(huán)境中二甲四氯污染的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）