不同季節(jié)高寒草甸牧草瘤胃發(fā)酵特性和體外消化率分析

姚喜喜， 才 華， 劉皓棟， 李長慧*

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2. 青海省澤曲林場， 青海 黃南 811400；3. 甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 武威 733006)

生育時(shí)期是影響牧草營養(yǎng)品質(zhì)的一個(gè)重要因素，天然草原缺乏人為管理，如施肥、灌溉、除雜草、防病蟲鼠害等，所以生育時(shí)期對(duì)天然牧草的影響顯得尤為關(guān)鍵[1]。隨著牧草的生長發(fā)育，牧草的養(yǎng)分含量和消化率也會(huì)出現(xiàn)不同程度的變化。對(duì)青藏高原高寒牧區(qū)牧草而言，因其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境條件，夏季牧草營養(yǎng)價(jià)值顯著高于冬季和春季[1]，據(jù)報(bào)道，夏季牧草表現(xiàn)出粗蛋白質(zhì)和瘤胃消化率較高，而粗纖維含量較低的現(xiàn)象[2-3]。郝力壯等[4]和林莉等[5]分別研究了青海三江源區(qū)不同草地、不同生育時(shí)期牧草綜合營養(yǎng)品質(zhì)和草地合理載畜量，當(dāng)生育時(shí)期處于枯草期時(shí)，牧草中的磷和粗蛋白含量較少，因此能為家畜提供的營養(yǎng)物質(zhì)有限。有研究對(duì)青海牦牛冬季飼喂粗飼料和5種天然牧草進(jìn)行組合來探究體外發(fā)酵變化，發(fā)現(xiàn)體外發(fā)酵參數(shù)與底物營養(yǎng)成分具有相關(guān)性[6]，理想狀態(tài)下，氣體產(chǎn)量與CP成正比，與ADF，NDF成反比；乙酸、丙酸的含量以及CH4含量都與粗蛋白成正比，其中CH4含量也與酸性、中性洗滌纖維成正比。樊金富和金海[7]運(yùn)用飽和鏈烷烴法，檢測了牧草在3個(gè)不同時(shí)期時(shí)，奶牛DMI和DMD以及牧草營養(yǎng)成分含量，發(fā)現(xiàn)幼嫩期牧草CP含量最高，旺盛期GE含量最高，枯黃期NDF，Ca和P最高，牧草幼嫩期與旺盛期的干物質(zhì)采食量和消化率都優(yōu)于枯黃期。Niwinska等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)紫花苜蓿(MedicagosativaL.)營養(yǎng)成分不同是因?yàn)椴煌竟?jié)下紫花苜蓿的營養(yǎng)物質(zhì)化學(xué)組分和結(jié)構(gòu)及其消化過程均存在差異。青藏高原牧草在5—10月份正值生長期，土壤中的養(yǎng)分也因?yàn)榧竟?jié)的不同呈現(xiàn)出不同變化[9]。牧草的生長發(fā)育會(huì)表現(xiàn)出由返青期到枯黃期的季節(jié)性變化規(guī)律，返青過程中牧草的營養(yǎng)含量最高，生長期結(jié)束后，牧草的成熟和木質(zhì)化進(jìn)程開始，營養(yǎng)價(jià)值開始下降[10]。

溫室效應(yīng)最大的影響因素就是二氧化碳的排放量，然而CH4排放引起的溫室效應(yīng)同樣不容小覷。雖然CH4的排放量比二氧化碳少，然而其造成的溫室效應(yīng)卻遠(yuǎn)高于二氧化碳，全球由CH4排放造成的溫室效應(yīng)占到了20%[11]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，反芻動(dòng)物每年排放的CH4占全球人類活動(dòng)CH4排放總量的6%[12]。CH4氣體過多排放會(huì)對(duì)大氣和生態(tài)環(huán)境造成威脅，CH4是能量的載體物質(zhì)，減少其排放，不僅能夠提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率和減少溫室效應(yīng)，還能提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[13]。本研究則是基于青藏高原瑪曲縣高寒草甸為研究對(duì)象，通過采集不同生育時(shí)期的牧草進(jìn)行牦牛瘤胃體外發(fā)酵試驗(yàn)，測定其瘤胃內(nèi)CH4產(chǎn)量，為準(zhǔn)確評(píng)估放牧牦牛CH4排放提供研究基礎(chǔ)。

自20世紀(jì)80年代青藏高原草原資源科考以來[14]，對(duì)天然草地自然生長牧草的營養(yǎng)價(jià)值動(dòng)態(tài)變化的研究較少，而且研究多集中于國外，目前國內(nèi)對(duì)天然草地牧草相關(guān)方面的研究主要集中在甘肅、西藏和內(nèi)蒙古等地區(qū)，對(duì)青海海北州祁連縣相關(guān)方面的研究較少。鑒于上述，本試驗(yàn)通過系統(tǒng)研究青藏高原高寒草甸草原不同生育時(shí)期天然牧草品質(zhì)、牦牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)及CH4排放動(dòng)態(tài)，以期為高寒牧區(qū)牦牛合理放牧和減緩CH4排放，減少溫室氣體排放，實(shí)現(xiàn)高寒草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐。

1 材料及方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地區(qū)位于青海省海北藏族自治州祁連縣(100°55′E,37°57′N)，屬典型的高原大陸性氣候，溫差較大，冬春季長而寒冷，夏秋季短，平均海拔3 169 m，年平均降水量420 mm，約85%的降雨量主要集中在牧草生長季的5—10月份，平均氣溫在1℃，其中最高溫度與最低溫度分別為8℃和-3℃。草地類型屬高寒草甸，以矮生嵩草(Kobresiahumilis)、針茅(StipacapillataLinn.)、早熟禾(PoaannuaL.)和披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)為優(yōu)勢種牧草，土壤為亞高山草甸土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以10頭3歲牦牛全年放牧的輕度退化高寒草甸(面積24 hm2)為研究對(duì)象，放牧強(qiáng)度為輕度放牧(2.0個(gè)羊單位·hm-2)，分別在牧草返青期(2020年5月12日)、青草期(2020年8月8日)和枯草期(2020年12月5日)3個(gè)生育時(shí)期選擇代表性樣地，利用標(biāo)準(zhǔn)草地調(diào)查樣方(0.5 m × 0.5 m)隨機(jī)選取15個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行草地調(diào)查，3個(gè)不同的牧草生育時(shí)期草地調(diào)查信息如表1所示。牧草樣品留茬高度為2～3 cm，收集樣方內(nèi)全部牧草，篩選出可食用和無毒的牧草放置于陰涼處，再裝袋帶回實(shí)驗(yàn)室，在105℃烘箱中恒溫殺青0.3～0.5 h，后將所有樣品在65℃烘箱中恒溫烘24 h至恒重，開始進(jìn)行粉碎工藝，過40目篩選，之后裝于6號(hào)自封袋，進(jìn)行密封保存。

表1 草地植被組成Table 1 Composition of grassland vegetation

1.3 瘤胃液樣品采集與體外發(fā)酵設(shè)計(jì)

在10頭牦牛晨飼前，運(yùn)用口腔導(dǎo)管法采集瘤胃液樣品，每頭約采集200～300 mL，共采集瘤胃液2 000～3 000 mL，將采集好的瘤胃液通過四層紗布過濾后，保存到事先已通入過量CO2且經(jīng)(39±0.5)℃預(yù)熱的暖瓶中，整個(gè)操作在30 min內(nèi)完成。將采集好的瘤胃液迅速轉(zhuǎn)移帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

人工緩沖液的配制參照Menke和Steingass的方法，分別由微量元素A溶液、緩沖液B溶液、常量元素C溶液、指示劑D溶液和還原劑E溶液按474 mL蒸餾水+0.12 mL溶液A+237 mL溶液B+237 mL溶液C+1.22 mL溶液D+50 mL溶液E配置而成。微量元素A溶液由13.2 g CaCl2·2H2O，10.0 g MnCl2·4H2O，1.0 g CoCl2·6H2O和8.0 g FeCl3·6H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。緩沖液B溶液由4.0 g NH4HCO3和35.0 g NaHCO3加蒸餾水定容至500.00 mL組成。常量元素C溶液由5.7 g Na2HPO4，6.2 g KH2PO4和0.6 g MgSO4·7H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。指示劑D溶液由100 mg C12H7NO4和100 mg刃天青加蒸餾水定容至50.00 mL組成。還原劑E溶液由4 mL 1 mol·L-1NaOH和0.625 g Na2S·9H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。將配置好的人工緩沖液混合后水浴加熱至39℃，通入CO2使混合營養(yǎng)液由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色直至無色，最后將混合營養(yǎng)液與瘤胃液以2∶1體積比混合，即為培養(yǎng)液[15]。

體外產(chǎn)氣裝置采用美國ANKOM RFS型全自動(dòng)體外產(chǎn)氣記錄儀。每個(gè)牧草樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)準(zhǔn)確稱取樣品0.500 0 g，精確到0.000 1 g，裝入相對(duì)應(yīng)編號(hào)的體外發(fā)酵瓶底部，先在恒溫水浴搖床中預(yù)熱至39℃，通入一定量的二氧化碳來排除氧氣，再加入120 mL預(yù)熱(39℃)的培養(yǎng)液，再次排出O2，將容器放置于水浴搖床中，恒溫39℃，維持2 d，期間，記錄各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)(6，12，24，48 h)的產(chǎn)氣壓力，隨后進(jìn)行CH4產(chǎn)量測定(密封氣體進(jìn)樣針采集5 ml發(fā)酵瓶上部氣)，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出對(duì)應(yīng)發(fā)酵瓶，立即放入事先準(zhǔn)備好的冰水中，目的是終止其發(fā)酵，將發(fā)酵瓶中的液體進(jìn)行瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定，收集殘?jiān)糜隗w外消化率測定。

1.4 測定指標(biāo)及方法

采用氧彈式熱量計(jì)來測定牧草GE；DM和EE分別采用烘干法和索氏抽提法測定[16]；采用全自動(dòng)凱氏定氮儀(Foss Kheltec 8400)測定粗蛋白含量[17]；使用全自動(dòng)纖維分析儀(ANKOM 2000 Fiber Analyzer)，采用Van soest纖維分析法測定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)[18]；粗灰分(Ash)采用灰化法[16]；礦質(zhì)元素鈣(Ca)采用高錳酸鉀法[16]；礦質(zhì)元素磷(P)采用釩-鉬黃比色法[16]。

對(duì)于體外消化率測定：準(zhǔn)確稱取樣品(1.000 0 g)放入已知重量的尼龍袋中(400目；3.0 cm×5.5 cm)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將裝有樣品的尼龍袋放入發(fā)酵罐中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)苜蓿組來消除系統(tǒng)誤差，將各發(fā)酵罐放入體外培養(yǎng)箱中預(yù)熱至39℃，取出后通入二氧化碳，每個(gè)發(fā)酵罐裝入1 600 mL預(yù)熱(39℃)的培養(yǎng)液(無色狀態(tài))，通入二氧化碳排出氧氣再放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(39℃)，培養(yǎng)48 h后取出尼龍袋，立即放入冷水中，終止其發(fā)酵，然后用39℃溫水對(duì)其進(jìn)行細(xì)流沖洗，直到尼龍袋表面干凈為止，將其放于瓷盤中進(jìn)行烘干至恒重，差減法計(jì)算樣品干物質(zhì)消化率(Dry matter digestibility，DMD)，將3個(gè)重復(fù)樣品粉碎混合均勻，用常規(guī)營養(yǎng)分析方法進(jìn)行測定酸性洗滌纖維消化率(Acid detergent fiber digestibility，ADFD)、粗蛋白消化率(Crude protein digestibility，CPD)、中性洗滌纖維消化率(Neutral detergent fiber digestibility，NDFD)、有機(jī)物消化率(Organic matter digestibility,OMD)[17-18]。本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)苜蓿作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測得標(biāo)準(zhǔn)苜蓿的消化率后計(jì)算校正系數(shù)(F)，如DMD計(jì)算公式如下。

DMDS—所有試驗(yàn)批次標(biāo)準(zhǔn)苜蓿樣品干物質(zhì)消化率的平均數(shù)(%)；

DMDX—每次測試中標(biāo)準(zhǔn)苜蓿樣品干物質(zhì)消化率(%)；

DMD(%)=100×(發(fā)酵底物重×DM%-發(fā)酵殘?jiān)腄M量)/(發(fā)酵底物重×DM%)；

OMD(%)=100×(發(fā)酵底物重×OM%-發(fā)酵殘?jiān)腛M量)/(發(fā)酵底物重×OM%)；

CPD(%)=100×(發(fā)酵底物重×CP%-發(fā)酵殘?jiān)腃P量)/(發(fā)酵底物重×CP%)；

NDFD(%)=100×(發(fā)酵底物重×NDF%-發(fā)酵殘?jiān)腘DF量)/(發(fā)酵底物重×NDF%)；

ADFD(%)=100×(發(fā)酵底物重×ADF%-發(fā)酵殘?jiān)腁DF量)/(發(fā)酵底物重×ADF%)。

發(fā)酵參數(shù)、總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量測定：氨態(tài)氮參照Broderick和Kang提出改進(jìn)的比色法進(jìn)行測定[19]；氣相色譜儀(日本島津GC-2010 Plus)測定揮發(fā)性脂肪酸和CH4產(chǎn)量[20]；累計(jì)產(chǎn)氣量計(jì)算公式為：

Vx=VjPpsi×0.068004084

式中：Vx為產(chǎn)氣總體積(mL)；Vj為發(fā)酵瓶頂部空間體積(mL)；Ppsi為氣體測量系統(tǒng)自動(dòng)記錄的壓力(kPa)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3個(gè)牧草生育時(shí)期的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)和生物量、牧草體外消化率、瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)、體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育時(shí)期高寒草甸牧草生物量和主要營養(yǎng)物質(zhì)

由表2可知，草地地上生物量在青草期最高(P<0.05)，草地生物量表現(xiàn)出隨牧草返青期-青草期-枯草期先增加后下降的趨勢，且在青草期地上生物量達(dá)到最高。生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草主要營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)育規(guī)律表現(xiàn)出：牧草GE，CP和EE在青草期處于最高水平(P<0.05)，而DM，NDF和ADF含量在青草期最低(P<0.05)，牧草Ca和P含量在枯黃達(dá)到最高(P<0.05)。

表2 高寒草甸牧草主要營養(yǎng)物質(zhì)的變化Table 2 Seasonal dynamics of general nutrients content of herbage in alpine meadow

2.2 不同生育時(shí)期高寒草甸牧草體外消化率

高寒草甸不同生育時(shí)期牧草各營養(yǎng)成分的體外消化率，在體外發(fā)酵不同時(shí)間均有一定程度的變化，但總體來說，高寒草甸牧草各營養(yǎng)成分在體外發(fā)酵不同時(shí)間均表現(xiàn)出青草期高于返青期和枯草期(表3)。青草期DMD，CPD和OMD在發(fā)酵不同時(shí)間均顯著高于返青期和枯草期(P<0.05)。

表3 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草體外消化率的影響Table 3 Effects of growth stages on the vitro digestibility of alpine meadow

2.3 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由圖1可知，生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草體外發(fā)酵參數(shù)影響顯著(P<0.05)。高寒草甸青草期牧草在體外發(fā)酵12，24和48 h時(shí)間點(diǎn)的NH3-N含量顯著高于枯草期(P<0.05)；青草期發(fā)酵在48 h乙酸和丙酸含量處于最高水平(P<0.05)；青草期發(fā)酵的12，24和48 h，戊酸、異戊酸和乙酸/丙酸顯著高于枯草期(P<0.05)。

圖1 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草體外發(fā)酵參數(shù)的影響Fig.1 Effects of growth stages on the parameters of herbage in vitro fermentation in alpine meadow注：同一發(fā)酵時(shí)間不同生育時(shí)期標(biāo)注的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.4 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響

由圖2可知，瘤胃體外總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，呈增加趨勢。生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草牦牛瘤胃體外不同發(fā)酵時(shí)間(6，12，24，48 h)總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量均產(chǎn)生顯著變化(P<0.05)，瘤胃體外發(fā)酵48 h總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量顯著處于最高水平(P<0.05)，體外發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量顯著高于發(fā)酵6，12 h總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量(P<0.05)，體外發(fā)酵12 h總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量顯著高于發(fā)酵6 h總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量(P<0.05)。3個(gè)時(shí)期牧草不同發(fā)酵時(shí)間(6，12，24，48 h)總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的變化規(guī)律為返青期>青草期>枯草期(P<0.05)。

圖2 生育時(shí)期對(duì)牧草體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of growth stages on forage total gas production and CH4 production in vitro fermentation注：同一發(fā)酵時(shí)間不同生育時(shí)期標(biāo)注的不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level

3 討論

3.1 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草營養(yǎng)品質(zhì)的影響

青藏高原因其獨(dú)特的高寒低溫氣候特點(diǎn)，天然草原牧草生長發(fā)育也表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化，即“春生，夏長，秋冬枯”。4—6月初，高寒草甸牧草由萌芽期進(jìn)入返青期，6—8月快速生長，隨營養(yǎng)物質(zhì)的積累出現(xiàn)旺盛期，自9月上旬開始，牧草開始進(jìn)入枯黃期，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸流失，地上生物量不再增加，直至次年牧草再次返青，進(jìn)入第二個(gè)生育期，周而復(fù)始。

本研究中牧草CP，EE，ADF和NDF含量存在明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化特征，5月份返青牧草因含有較多的立枯物而表現(xiàn)出CP和EE含量顯著低于青草期，至9月份青草期CP和EE含量達(dá)到最大值，之后隨生育期推移，從青草期至枯草期逐漸下降，在枯草期12月份降到最低值，而牧草ADF和NDF含量的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化趨勢則與牧草CP和EE含量變化趨勢相反，即自5月份牧草返青時(shí)開始下降，至9月份青草期，其含量呈現(xiàn)最低值，而后由于牧草生育時(shí)期的延遲，從青草期至枯草期逐漸升高，在枯黃期12月份出現(xiàn)最高值，這與前人在典型草原、荒漠草原和高寒草原的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)返青期和青草期牧草DM，NDF和ADF含量較低，而CP和EE含量則與之相反，與本研究結(jié)論一致[3,22-24]。牧草的呼吸能力由氣溫控制，氣溫高則呼吸快，由于牧草可進(jìn)行光合作用，光合作用在消耗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的同時(shí)，使得牧草中DM含量得以增加，進(jìn)而導(dǎo)致牧草中結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量增加，造成牧草CP和EE含量顯著下降[3,27]。

研究發(fā)現(xiàn)牧草消化率表現(xiàn)出明顯的隨生育時(shí)期變化特征[25-26]。本研究中牧草營養(yǎng)物質(zhì)消化率受到生長季節(jié)的影響比較大，總體上先升高后下降，高寒草甸返青期、青草期和枯黃期牧草DMD，CPD和OMD在體外發(fā)酵不同時(shí)間均表現(xiàn)出青草期顯著高于返青期和枯草期，NDFD和ADFD體外發(fā)酵不同時(shí)間均表現(xiàn)出青草期顯著低于返青期和枯草期。這與和海秀[21]在新疆沙爾套山牧草體外消化率四季變化規(guī)律一致，發(fā)現(xiàn)青草期牧草消化率最高。與梁建勇等[3]研究瑪曲高寒牧草干物質(zhì)瘤胃降解率動(dòng)態(tài)變化一致，發(fā)現(xiàn)6—7月青草期牧草體外發(fā)酵48 h降解率最高，8—9月枯草期牧草體外發(fā)酵48 h降解率最低。與范小紅等[27]的研究結(jié)果一致，DMD，OMD以及CPD的含量因牧草停止生長而減少，與此同時(shí)，牧草的NDF和ADF含量均增加，對(duì)應(yīng)牧草成長時(shí)，DMD，CPD和OMD增加，而NDFD和ADFD下降。反芻動(dòng)物瘤胃對(duì)鮮嫩多汁牧草的消化能力比多纖維干枯牧草的消化能力高，牧草中干物質(zhì)和纖維含量決定了瘤胃消化率的高低。丁玲玲等[28-29]研究表明，土壤微生物對(duì)牧草營養(yǎng)物質(zhì)的積累有顯著的影響，而微生物的數(shù)量受到時(shí)間的影響，一般在5月份時(shí)微生物數(shù)量最多，牧草處于青草期時(shí)，營養(yǎng)價(jià)值最高，隨著牧草生長，其營養(yǎng)價(jià)值因?yàn)槟敛莅l(fā)生木質(zhì)化過程而降低，證實(shí)了上述試驗(yàn)中，在冬季牧草枯草期時(shí)，營養(yǎng)價(jià)值降低的結(jié)果。

3.2 生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草瘤胃發(fā)酵參數(shù)和CH4產(chǎn)量的影響

氮元素是家畜自身最重要的營養(yǎng)元素之一，在家畜體內(nèi)有著非常重要的生物學(xué)功能。對(duì)家畜而言，飼糧是最主要的氮素來源，采食是最重要的獲取氮素的方式之一。因此飼糧所含氮素的多少和可利用性(消化率)，決定了家畜能獲得多少氮素。這也為瘤胃微生物提供氮源有著重要的意義，瘤胃可作為基體，容納飼料中大部分蛋白質(zhì)(70%)在此吸收與消化。反芻家畜的瘤胃中存在著眾多的微生物載體，例如細(xì)菌等，會(huì)使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生游離氨基酸等分解產(chǎn)物，而這些分解產(chǎn)物，可促進(jìn)瘤胃中微生物發(fā)生變化，進(jìn)一步形成微生物蛋白質(zhì)[30]。而反芻家畜瘤胃中NH3-N和MCP的濃度是間接反映出瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的因素之一，Suwanlee等[31]通過分析，得到影響反應(yīng)時(shí)NH3-N濃度，最合適時(shí)為0.8～56.1 mg·mL-1，在本試驗(yàn)中，所有組體外發(fā)酵液NH3-N濃度范圍為6.84～12.67 mg·mL-1，均在最佳濃度范圍內(nèi)，且青草期NH3-N濃度最高，這可能是因?yàn)榍嗖萜诖值鞍缀恳沧罡叩脑驅(qū)е?，與張盼盼等[33]研究內(nèi)蒙東蘇旗不同季節(jié)牧草對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響結(jié)果一致，NH3-N濃度隨牧草生育時(shí)期延長逐漸降低，與海存秀等[21]研究青海高寒牧草營養(yǎng)動(dòng)態(tài)結(jié)果一致，6—7月青草期NH3-N含量達(dá)到峰值，然后逐漸降低。

反芻家畜瘤胃在碳水化合物發(fā)酵過程中，會(huì)生成較多的揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)，包括乙酸、丁酸、異丁酸等，其含量占到了總VFA的95%[33]，在瘤胃發(fā)酵中扮演著及其重要的作用。反芻動(dòng)物會(huì)將其采食的飼料在瘤胃內(nèi)轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸、微生物蛋白和氨等營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)腸道上皮吸收，為其提供能量。而有機(jī)酸中乙酸和丙酸分別是進(jìn)行氧化代謝和糖異生的重要媒介,所有代謝反應(yīng)[34]均有丙酸參與。本研究中，青草期有機(jī)酸含量要高于返青期和枯草期，這可能是青草期碳水化合物含量最高的原因造成的，可促進(jìn)發(fā)酵快速進(jìn)行，而CP含量一般在春冬季比較低，可提供氮含量少，纖維降解菌可利用氮源少[32-33]。本試驗(yàn)中，青草期牧草發(fā)酵48 h時(shí)，體外培養(yǎng)液的乙酸、丙酸和丁酸濃度顯著高于返青期和枯黃期，這表明非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量在青草期較多，牧草的使用價(jià)值提高，制造微生物蛋白質(zhì)的能力提高，這與張盼盼等[32]對(duì)內(nèi)蒙東蘇旗不同季節(jié)牧草瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響研究結(jié)果一致，在6—8月，綿羊瘤胃中乙酸等物質(zhì)的濃度都高于12月，夏秋兩季差異不顯著。

總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的高低反映了牧草在瘤胃中的可發(fā)酵程度和瘤胃微生物的活性強(qiáng)弱[35]。目前，有關(guān)生育時(shí)期對(duì)反芻家畜瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量影響的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本試驗(yàn)中，返青期牧草在瘤胃中的可發(fā)酵程度顯著高于青草期和枯草期，瘤胃微生物活性明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為返青期牧草不同發(fā)酵時(shí)間(6，12，24，48 h)總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量顯著高于青草期和枯黃期，且隨著牧草體外發(fā)酵時(shí)間的延長，瘤胃體外總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量整體均呈現(xiàn)增加趨勢。這可能是牧草中碳水化合物含量在青草期較高，在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，可快速進(jìn)行，而返青期和枯草期牧草CP含量低，纖維降解菌可利用氮源不足，瘤胃的發(fā)酵速度因?yàn)槠鋵?duì)應(yīng)微生物的數(shù)量以及活性的降低而減慢，進(jìn)一步影響CH4以及氣體總含量。劉樹軍[36]在其研究中表明：飼草的品質(zhì)與其產(chǎn)生CH4的多少成反比關(guān)系，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，發(fā)酵水平高的飼草，因?yàn)楫a(chǎn)生的CH4少，可有效控制溫室效應(yīng)加劇，飼料的使用價(jià)值也更高。張畢陽等[37]研究指出：瘤胃產(chǎn)生的氣體含量與自身優(yōu)劣成負(fù)相關(guān)；與體內(nèi)消化速度成正比，證實(shí)了造成瘤胃的發(fā)酵模式與CH4含量變化原因的相同結(jié)論。

4 結(jié)論

生育時(shí)期對(duì)高寒草甸牧草總能、粗蛋白、粗脂肪、干物質(zhì)含量、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維等主要營養(yǎng)物質(zhì)含量，牧草干物質(zhì)體外消化率、粗蛋白體外消化率、有機(jī)物質(zhì)體外消化率、中性洗滌纖維體外消化率和酸性洗滌纖維體外消化率，牧草瘤胃中乙酸、丁酸、異戊酸濃度、氨氮、甲烷排放量等發(fā)酵參數(shù)均有顯著影響，綜合考慮，青草期牧草生物量、營養(yǎng)品質(zhì)和體外消化率最高，瘤胃發(fā)酵特性最佳，甲烷排放量最低。