琥珀酸黃桿菌促生機(jī)理及其對多年生黑麥草生長和抗逆性的生理調(diào)控作用

張新飛， 佘木子， 李晗玉， 敬 松， 姜惠娜， 高 浩， 朱延曉， 付娟娟

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

植物根際促生細(xì)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是生存于植物根際范圍內(nèi)的一類有益細(xì)菌的統(tǒng)稱。近年來許多研究表明，它不僅可以促進(jìn)植物生長、防治病害、增加作物產(chǎn)量，而且還能提高植物的干旱、鹽、重金屬等多種非生物脅迫抗性，提高植物在各種環(huán)境脅迫中的適應(yīng)能力[1-2]。然而，目前從根際土壤中篩選植物促生菌，并應(yīng)用于草坪草抗逆性的研究鮮有報(bào)道。

多年生黑麥草(Loliumperenne)是城市綠化以及運(yùn)動(dòng)場草坪建植中常用的冷季型草種，因其具有草坪質(zhì)量優(yōu)、成坪快和綠期長等優(yōu)點(diǎn)，常常作為草坪建植的先鋒草種。同時(shí)，由于其產(chǎn)量高、飼用價(jià)值高，也是重要的牧草植物[3-4]。然而，多年生黑麥草的耐旱、耐寒和耐鹽性均較差，干旱、低溫和鹽脅迫均會(huì)對多年生黑麥草的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。研究如何提高多年生黑麥草的耐旱、耐寒和耐鹽性將有利于增加其在草坪和農(nóng)牧業(yè)中的應(yīng)用。

本研究基于前期16S rRNA測序結(jié)果，從麥冬(Ophiopogonjaponicus)根際土中分離篩選到琥珀酸黃桿菌(Flavobacteriumsuccinicans)DSM4002菌株[5]。然而，關(guān)于琥珀酸黃桿菌調(diào)控草坪草干旱、低溫和鹽脅迫應(yīng)答的機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)分析了琥珀酸黃桿菌的生物學(xué)特性，采用盆栽法研究根際接種琥珀酸黃桿菌對多年生黑麥草幼苗生長及干旱、低溫和鹽脅迫的影響，為進(jìn)一步解析琥珀酸黃桿菌與植物互作應(yīng)答干旱、低溫和鹽脅迫的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為今后利用PGPR提高多年生黑麥草及其他草坪草在非生物脅迫下的適應(yīng)能力提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的琥珀酸黃桿菌株(DSM4002)分離自西北農(nóng)林科技大學(xué)麥冬草坪根際土[5]，菌種現(xiàn)保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。供試的多年生黑麥草種子購買于北京正道草業(yè)有限公司，品種為‘博士’(‘ph.D’)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1琥珀酸黃桿菌的特性研究 菌株分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)能力測定采用Salkowski比色液法[6]；溶磷能力采用鉬銻抗比色法培養(yǎng)2 d后測定[7]；鐵載體能力測定采用嗜鐵素(Chrome azurol sulphonate,CAS)檢測液法[8]。

1.2.2種子消毒與幼苗培養(yǎng) 多年生黑麥草種子經(jīng)1% NaClO溶液消毒5 min后，無菌水清洗3次，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗條件下萌發(fā)至2 cm左右時(shí)，選取健康的幼苗轉(zhuǎn)移至裝有已滅菌的石英砂的10 cm塑料盆中，每盆10株，置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光通量密度為12 000 lx，濕度65%，光期/暗期為16 h/8 h(25℃/20℃)。每3 d澆一次滅菌的Hoagland營養(yǎng)液。

1.2.3多年生黑麥草接種處理 參考本實(shí)驗(yàn)室前期方法培養(yǎng)并制備琥珀酸黃桿菌(DSM4002)菌懸液[9]。幼苗培養(yǎng)21 d后，每盆取10 mL DSM4002菌懸液注射到多年生黑麥草根系周圍，每隔3 d接種一次，共接種3次。

1.2.4根際定殖試驗(yàn) 采用水培法培養(yǎng)多年生黑麥草幼苗，取1 mL用綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記的DSM4002菌懸液注射到生長14 d的多年生黑麥草幼苗根系上，水平置于濾紙上孵育1 h后，重新將根系放回水培盒中，每隔1 d接種一次，共接種3次，接種1周后，用體視熒光顯微鏡觀察熒光。

1.2.5多年生黑麥草干旱、低溫和鹽處理 多年生黑麥草幼苗接種20 d后分別進(jìn)行低溫(4℃)處理3 d和7 d；干旱脅迫參考Tan等[10]的方法，采用稱重法每天補(bǔ)充相應(yīng)水分來維持對照土壤水分含量維持(2.2±1.0) g水/g干土，干旱處理維持土壤含水量為(0.7±0.3 g)水/g干土，處理7 d和14 d；鹽脅迫參考Li等[11]方法用150 mM NaCl處理5 d和10 d，以不進(jìn)行脅迫處理為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理后收集葉片和根系樣品，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.6多年生黑麥草相關(guān)指標(biāo)測定 選取各個(gè)處理的6株植株，分別測量株高及根長，并稱量地上部和根的鮮重；植株置于烘箱中105℃殺青15 min，80℃烘干至恒重，稱量地上部和根的干重。采用電導(dǎo)儀(上海雷磁DDS-307)測定葉片的相對電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸法測定葉片中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量[12]；采用氮藍(lán)四唑(Nitroblue tetrazo-lium，NBT)法測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性[13]；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性[14]；紫外分光光度法測定過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性[15]；參考Yoshiyuki和Kozi[16]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)活性；采用磺基水楊酸法和蒽酮比色法測定樣品脯氨酸含量和可溶性總糖含量。

1998年1月1日起試行的《高等學(xué)校會(huì)計(jì)制度（試行）》文件明確規(guī)定，高校會(huì)計(jì)核算一般采用收付實(shí)現(xiàn)制，對固定資產(chǎn)不計(jì)提折舊，僅反映固定資產(chǎn)原值的增減變動(dòng)情況。這種不計(jì)提折舊的管理制度，無法真實(shí)反映固定資產(chǎn)的實(shí)際價(jià)值，也不能真實(shí)體現(xiàn)高校教育成本，在實(shí)際操作過程中顯示出了諸多弊端，如固定資產(chǎn)賬面價(jià)值與實(shí)際價(jià)格不符、無法補(bǔ)償固定資產(chǎn)的損耗等。2013年1月1日起施行新的《高等學(xué)校會(huì)計(jì)制度》（財(cái)教〔2012〕488號），該文件明確規(guī)定，要求高等學(xué)校按月計(jì)提固定資產(chǎn)折舊，并做了相應(yīng)的規(guī)定，這為固定資產(chǎn)折舊工作提供了文件依據(jù)，固定資產(chǎn)的會(huì)計(jì)核算也必須根據(jù)組織環(huán)境的變化而改變。

1.2.7數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行二因素方差分析，若有顯著差異，應(yīng)用Duncan’s法對平均值進(jìn)行多重比較(P<0.05)。使用Excel 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株促生特性分析

利用比色法對供試菌株分泌IAA及溶無機(jī)磷的能力進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，琥珀酸黃桿菌具有分泌IAA及溶無機(jī)磷的能力，在含0.5 mg·mL-1色氨酸的培養(yǎng)基產(chǎn)IAA量為14.12 μg·mL-1，且溶磷量達(dá)201.60 μg·mL-1(表1)。

采用CAS平板檢測法對琥珀酸黃桿菌產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行了定性與定量檢測。菌落周圍能夠形成橙色光圈，且對菌株的鐵載體暈圈直徑D和菌落直徑d的測定結(jié)果顯示，3次重復(fù)R值均大于1.5，說明琥珀酸黃桿菌產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)。定量分析顯示，鐵載體濃度與A/Ar值呈線性關(guān)系，該菌株產(chǎn)鐵載體等級為“+++++”，屬于高產(chǎn)鐵載體菌株(表1)。

表1 菌株IAA分泌、溶無機(jī)磷和產(chǎn)鐵載體能力Table 1 Concentration of IAA secrete from the strain and the ability of dissolving inorganic phosphorus and crrier capacity of iron production

2.2 菌株抗生素抗性及根系定殖情況分析

菌株DSM4002在含壯觀霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、鏈霉素和四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基均能夠正常生長，而在含有氯霉素的培養(yǎng)基中生長受到抑制，表明DSM4002對氯霉素敏感。將DSM4002在含不同濃度氯霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株生長情況與液體培養(yǎng)基中結(jié)果一致(圖1A)，驗(yàn)證了DSM4002對卡那霉素具有抗性，對氯霉素敏感的結(jié)果。在熒光顯微鏡下觀察到根系有綠色熒光，說明菌株定殖成功(圖1B)。

圖1 DSM4002菌株抗性分析(A)和定殖情況(B)Fig.1 Antibiotic resistance (A) and root colonization (B) of DSM4002

2.3 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對多年生黑麥草生長的影響

干旱、低溫和鹽脅迫均抑制多年生黑麥草的生長，而接種DSM4002能夠促進(jìn)脅迫0 d即正常生長(CK)、低溫、干旱和鹽脅迫下多年生黑麥草的生長(圖2A，B)。與未接種DSM4002處理相比，接種DSM4002導(dǎo)致干旱14 d、低溫3 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草株高分別提高了37.84%，90.88%，33.41%和45.83%(P< 0.05)；接種DSM4002也促進(jìn)干旱14 d、鹽10 d脅迫下多年生黑麥草根的生長，分別較未接種處理提高了33.88%，33.80%(P<0.05)。

與未接種的植株相比，接種DSM4002導(dǎo)致CK、干旱7 d、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草地上部鮮重分別提高了57.84%，25.58%，141.38%，103.08%，78.85%，39.81%，164.91%；此外，在CK、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d和鹽10 d處理下，接種DSM4002使得根鮮重分別提高了27.27%，86.96%，48.28%，111.11%和91.67%(P< 0.05)(圖2C，D)；地上和根系干重也表現(xiàn)出類似的響應(yīng)(P<0.05)(圖2E，F(xiàn))。

2.4 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對多年生黑麥草細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，與CK相比，干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草葉片電導(dǎo)率顯著升高，分別增加了171.93%，126.00%，226.03%，66.00%和118.01%；而接種DSM4002處理能夠顯著降低電導(dǎo)率，分別降低了76.32%，54.82%，59.79%，42.25%和45.03%(P<0.05)。而且，接種DSM4002也能夠顯著降低干旱7 d、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理中多年生黑麥草葉片中丙二醛積累，與未接種相比分別降低了16.63%，39.76%，27.38%，35.92%，21.25%和31.37%(P<0.05)。

圖3 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對多年生黑麥草葉片中相對電導(dǎo)率(A)和丙二醛(B)的影響Fig.3 Effects of inoculation with DSM4002 on relative electric conductance (A) and MDA content (B) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

2.5 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對多年生黑麥草抗氧化酶活性的影響

圖4 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對多年生黑麥草SOD(A)，CAT(B)，POD(C)，APX(D)和GR(E)活性的影響Fig.4 Effects of inoculation with DSM4002 on the activities of SOD (A),CAT (B),POD (C),APX (D)and GR (E) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

2.6 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)能力的影響

接種DSM4002能夠提高對照及干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中可溶性糖和脯氨酸的積累(圖5)。與未接種相比，接種DSM4002導(dǎo)致CK、干旱7 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理中可溶性糖含量和脯氨酸含量分別提高了40.91%，152.09%，27.98%，17.44%，50.19%，17.07%和 48.23%，54.04%，45.25%，21.83%，29.93%，20.14%，而干旱14 d處理下二者含量沒有顯著變化(P<0.05)。

圖5 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對多年生黑麥草可溶性糖(A)和脯氨酸(B)含量的影響Fig.5 inoculation with DSM4002 on the content of soluble sugar (A) and proline(B) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

3 討論

3.1 琥珀酸黃桿菌具有多功能特性

植物根際促生菌(PGPR)的促進(jìn)植物生長作用與其具有分泌植物激素、溶磷、溶鐵、解鉀等能力密切相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)許多根際促生菌具有分泌IAA的能力[18]。本研究中供試菌株DSM4002的IAA產(chǎn)量為14.11 μg·mL-1，與前人的研究結(jié)果基本一致[19]。此外，一些植物促生菌能分泌有機(jī)酸，降低植物根圍土壤的pH值，將不溶性的磷轉(zhuǎn)變成可溶性的磷，使磷有效的被溶解與吸收，從而促進(jìn)植物生物量的增加[20]。本研究篩選的琥珀酸黃桿菌DSM4002菌株溶磷量為201.2 μg·mL-1，與雷海英等[21]與楊婉秋等[22]篩選出的菌株(溶磷量分別為1.908 μg·mL-1，8.91～90.27 μg·mL-1)相比，具有更強(qiáng)的溶磷能力。

鐵載體與金屬結(jié)合能夠增加可溶性金屬元素的濃度，可以促進(jìn)植物對鐵元素的吸收，也有利于緩解土壤中高濃度重金屬對植物的毒害[23]。對供試菌株DSM4002產(chǎn)鐵載體性能的測定結(jié)果表明，DSM4002菌株產(chǎn)生鐵載體相對含量的A/Ar值為0.098，比楊鴻儒[24]和張盼[25]篩選出的菌株產(chǎn)鐵載體能力更高。kadmiri等人的研究[26]與本研究結(jié)果相似，當(dāng)小麥?zhǔn)艿禁}脅迫后接種具有溶磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA的桿菌SBP-6后，與未接種的植株相比，生物量得到明顯提高。

3.2 琥珀酸黃桿菌促進(jìn)了多年生黑麥草的生長

PGPR能夠通過各種機(jī)制直接或間接地提高植物對非生物脅迫的抗性以促進(jìn)植物生長[27]。干旱脅迫下接種巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)BOFC15顯著提高了擬南芥(Arabidopsisthaliana)的耐旱性，增加了植株地上部和根系的鮮重和干重[28]。Abdelaziz等人[29]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下接種梨形孢子菌(Piriformosporaindica)到番茄上，植株鮮重和干重分別增加了26%和33%，并緩解了鹽脅迫對植株分枝以及地上部和根系生長的抑制作用。本研究結(jié)果也表明，接種琥珀酸黃桿菌不僅可以提高正常生長條件下多年生黑麥草幼苗的生長，還能有效緩解干旱、低溫和鹽脅迫對多年生黑麥草的生長抑制作用并促進(jìn)植株生長。

3.3 琥珀酸黃桿菌維持了干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草質(zhì)膜的相對完整性

在正常生長條件下，植物細(xì)胞膜對于物質(zhì)具有選擇透性的能力，在植物受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞膜的完整性受到破壞[30]。植物相對電導(dǎo)率和MDA含量能夠反映植物的細(xì)胞膜損傷程度[31]。Han等人[32]研究表明接種解淀粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)降低了鹽脅迫下白三葉的MDA含量和相對電導(dǎo)率。與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)接種琥珀酸黃桿菌DSM4002能夠顯著地降低干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中相對電導(dǎo)率和MDA含量，減輕葉片細(xì)胞膜的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱、低溫和鹽脅迫均會(huì)不同程度地改變多年生黑麥草葉片中SOD，CAT，POD，APX和GR的活性，接種DSM4002能夠進(jìn)一步提高這些抗氧化酶的活性，這表明DSM4002能夠通過激活抗氧化酶系統(tǒng)活性提高活性氧清除能力，從而維持了植物體內(nèi)的氧化還原平衡，減輕多年生黑麥草受干旱、低溫和鹽脅迫產(chǎn)生的氧化損傷，增強(qiáng)了多年生黑麥草的脅迫抗性。相似地研究也表明，在250 mM鹽脅迫下，接種根內(nèi)生真菌梨形孢子菌(Piriformosporaindica)提高了紫花苜蓿的抗氧化酶活性，與未接種處理相比，POD，SOD和CAT活性分別提高44%，40.5%和38%[33]。

3.4 琥珀酸黃桿菌增強(qiáng)了干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草的滲透調(diào)節(jié)能力

可溶性糖和脯氨酸是環(huán)境脅迫中植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于維持滲透平衡和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，清除活性氧，以提高植物的適應(yīng)能力[34]。

以前研究表明，干旱脅迫下接種PGPR菌劑BBS導(dǎo)致玉米幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著提高[35]。接種P.extremorientalisTSAU20處理使得鹽脅迫下番茄葉中脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加[36]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)接種DSM4002能夠顯著提高干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中可溶性糖和脯氨酸的含量，能夠幫助多年生黑麥草積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高抵御干旱、低溫和鹽脅迫的能力。

4 結(jié)論

琥珀酸黃桿菌菌株DSM4002促進(jìn)多年生黑麥草的生長可能與其自身能夠產(chǎn)鐵載體、分泌植物激素和具有溶磷能力有關(guān)；接種DSM4002不僅能夠促進(jìn)正常生長條件多年生黑麥草地上部和根系的生長，而且可以提高干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力，降低相對質(zhì)膜透性和丙二醛積累量，緩解環(huán)境脅迫引起的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物的抗旱、抗寒和抗鹽能力。