箭葉橐吾內(nèi)生真菌分離鑒定及組織分布特性研究

唐麗輝， 劉奕伶， 趙文星， 張云昊， 吳可欣， 郭梓豫， 莫重輝， 趙寶玉， 路 浩*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院， 陜西 楊凌 712100；2. 青海大學農(nóng)牧學院， 青海 西寧 810016)

橐吾屬(Ligulariasp.)是菊科(Compositae)千里光族(Sinecioneae)中的一個分支，屬于多年生草本植物[1]。橐吾屬植物大部分生長在溫帶地區(qū)，分布范圍廣[2]。研究表明，該屬植物共有129個種，亞洲都有分布，僅有2個種分布于歐洲[3]。橐吾在中國分布較多，總計112種，主要分布于西部地區(qū)。箭葉橐吾作為橐吾屬植物的一種，在我國主要分布于西藏、青海、寧夏、四川西部、甘肅東部、內(nèi)蒙古西部等地區(qū)[4-5]。箭葉橐吾具有毒性，其主要毒性成分為吡咯里西啶類生物堿，動物采食后，可引起中毒甚至死亡，嚴重影響畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展[5-8]。同時箭葉橐吾也作中藥使用，其根莖具有清熱解毒、潤肺下氣和消腫止痛的功效[9]。此外，馬瑞君等[10]對箭葉橐吾的化感作用研究時發(fā)現(xiàn)，其水溶物對多種優(yōu)良牧草種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，使周邊優(yōu)質(zhì)牧草的更新能力降低。因此，箭葉橐吾的研究在保護草場資源方面具有重要意義。

植物內(nèi)生真菌是指存在于健康的植物組織內(nèi)而不會引起植物各種病害的真菌[11]。內(nèi)生真菌在植物的物種進化過程中具有重要作用，它們可以提高宿主植物的各種抗逆能力，還能增強宿主植物抵抗各種有害昆蟲以及家畜的采食[12-13]。Braun等[14-15]從瘋草中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌并初步認為瘋草毒素-苦馬豆素的存在與其感染棘豆鏈格孢菌(Alternariaoxytropis)有關(guān)。隨后，Gardner等[16]研究表明植物體內(nèi)高水平苦馬豆素與存在內(nèi)生真菌有關(guān)，低水平苦馬豆素與缺失內(nèi)生真菌有關(guān)。此外，國內(nèi)學者也從不同瘋草中分離出棘豆鏈格孢菌[17-20]，并證明棘豆鏈格孢菌可產(chǎn)生苦馬豆素[21-25]，這說明植物毒素是由內(nèi)生真菌合成的。另有研究表明，苦馬豆素具有抗腫瘤、抗病毒和提高機體免疫力的作用[26]。由此可以看出，內(nèi)生真菌在有毒植物的研究中具有重要潛在應用價值。在橐吾屬有毒植物研究中，顏霞等[27]在假橐吾(Ligulariopsisshichuana)中分離到86種內(nèi)生真菌，其中交鏈孢霉屬(Alternariasp.)和絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)為優(yōu)勢菌屬。羅彪[28]利用不同的培養(yǎng)基對黃帚橐吾內(nèi)生真菌進行分離鑒定，最終確定木霉屬(Trichodermasp.)和鐮孢屬(Fusariumsp.)為優(yōu)勢菌屬，而目前尚未見到箭葉橐吾內(nèi)生真菌的研究報道。

本試驗采用植物表面消毒法分離箭葉橐吾內(nèi)生真菌，運用形態(tài)學和分子生物學方法對其進行種屬鑒定，以期闡明箭葉橐吾內(nèi)生真菌的種類多樣性及其在宿主體內(nèi)的分布特點，該研究結(jié)果可進一步豐富橐吾屬有毒植物內(nèi)生真菌的種類及種屬多樣性，為后續(xù)產(chǎn)吡咯里西啶類生物堿內(nèi)生真菌篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 本試驗所用箭葉橐吾于2020年7月采自青海省門源縣皇城鄉(xiāng)(東經(jīng)102°18′30″，北緯37°36′24″，海拔3 446 m)。用鐵鏟隨機挖取處于盛花期的植株5株，采集的組織包含根、莖、葉和花，陰干處理后帶回實驗室備用。

1.1.2培養(yǎng)基 試驗所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium，PDA)，參考劉欣瑜等[29]的方法制備。

1.2 試驗方法

1.2.1箭葉橐吾樣品的表面消毒 將干燥處理過的箭葉橐吾利用二次蒸餾水進行清洗，洗凈后剪成2 cm左右的小段，置于培養(yǎng)皿中用無菌水浸泡2 h左右，使其完全被水浸透。將浸泡好的箭葉橐吾組織塊在超凈工作臺中進行表面消毒。具體消毒過程：75%酒精初次消毒30 s，無菌水漂洗1 min，2% NaClO消毒，無菌水重復漂洗4次，每次漂洗1 min。漂洗完成后將最后一次的漂洗水蘸取少量涂布于PDA培養(yǎng)基上檢驗消毒效果。根據(jù)植物的組織結(jié)構(gòu)的不同，將植物組織在2% NaClO中的消毒時間設置不同的梯度(根：2 min，1 min 50 s；莖：2 min，1 min 50 s，1 min 40 s；葉：2 min，1 min 50 s，1 min 40 s，1 min 30 s；花：50 s，40 s，30 s)。

1.2.2箭葉橐吾內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng) 將已經(jīng)消毒好的箭葉橐吾組織塊剪碎，莖和葉剪成2 mm×2 mm的方塊，根剪成長度約為2 mm的立方塊，花剪成2 mm左右的小段，把剪小的組織塊的新鮮創(chuàng)面插入已鋪好PDA培養(yǎng)基的平板中，用封口膜密封后，置于24℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，每天觀察真菌的生長情況。

1.2.3箭葉橐吾內(nèi)生真菌的純化 培養(yǎng)一段時間后，在培養(yǎng)基中的植物組織周圍若生長有不同特征的真菌菌絲，分別將其挑至新鋪有PDA培養(yǎng)基的平皿中培養(yǎng)，以得到純化的菌株。再將封口標記好的平皿置于24℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4箭葉橐吾內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定 認真觀察內(nèi)生真菌，將已經(jīng)完全純化的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，每個菌株至少兩個培養(yǎng)皿，分為兩組。一組每天觀察其生長情況，并做好記錄。另一組待菌落直徑約為5 mm左右時，用鑷子將滅菌的蓋玻片以45°插入培養(yǎng)基中，封口培養(yǎng)待到菌絲爬滿蓋玻片的2/3時取出制作菌絲玻片。將固定好的菌絲玻片置于顯微鏡下仔細觀察菌絲的形態(tài)及孢子特征等。根據(jù)觀察以及記錄的結(jié)果，參考《真菌鑒定手冊》[30]對菌株類型進行初步鑒定。

1.2.5箭葉橐吾內(nèi)生真菌基因組DNA提取與保真序列擴增 箭葉橐吾內(nèi)生真菌基因組的提取遵循天根生化植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟。植物內(nèi)生真菌DNA提取完成之后，利用PCR擴增技術(shù)對所提取到的箭葉橐吾內(nèi)生真菌DNA保真序列進行擴增，采用20 μL的反應體系：提取內(nèi)生真菌菌株的DNA模板1 μL、引物ITS1和ITS4各1 μL(濃度為10 μmol·L-1)、DNA擴增高保真酶 2×EsTaqMaster Mix 7 μL、洗脫緩沖液TE 10 μL。上述DNA擴增體系完成后，將其置于PCR擴增儀中擴增，反應過程：加溫至94℃預變性5 min；高溫94℃ DNA解鏈變性20 s，溫度降至55℃ 20 s，升溫至72℃延伸1 min，以上3步循環(huán)33次；最后在72℃終延伸10 min；完成后在4℃保溫10 min。

1.2.6核酸序列測定與結(jié)果比對 將擴增的DNA序列經(jīng)電泳檢測，將檢測結(jié)果為單一條帶的擴增產(chǎn)物送至楊凌奧科公司測序，測序結(jié)果與NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫中的序列比對，結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果以確定內(nèi)生真菌的種屬。

1.2.7箭葉橐吾內(nèi)生真菌系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 將得到的所有菌株的5.8S rDNA-ITS序列鑒定結(jié)果編成Word文檔粘貼到MEGA中，運用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對結(jié)果進行分析處理，確定其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 箭葉橐吾內(nèi)生真菌分離結(jié)果

用2%NaClO對箭葉橐吾的不同組織進行表面消毒，消毒時間根據(jù)組織不同設定不同的梯度，并通過PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)以及純化得到表1所示的結(jié)果。結(jié)果表明，花的最佳消毒時間為40 s，葉的最佳消毒時間為1 min 40 s，莖的最佳消毒時間1 min 50 s。此外，花中分離的內(nèi)生真菌菌株最多。

表1 箭葉橐吾不同組織內(nèi)生真菌分離結(jié)果Table 1 Isolation results of endophytic fungi in different tissues of Ligularia sagitta

2.2 箭葉橐吾內(nèi)生真菌菌落與菌絲形態(tài)及孢子特征

對已經(jīng)純化好的內(nèi)生真菌在其生長的過程中進行仔細觀察，描述其菌落的主要形態(tài)特征及菌絲的特點。各個菌落的記錄結(jié)果如表2所示，部分菌落的形態(tài)特征如圖1所示。

表2 箭葉橐吾內(nèi)生真菌菌落與菌絲的主要形態(tài)學特征Table 2 Main morphological characteristics of colonies and hyphae of endophytic fungi from Ligularia sagitta

續(xù)表2

圖1 箭葉橐吾內(nèi)生真菌菌落和菌絲形態(tài)Fig.1 Morpholoqy of colonies and hypha of endophytic fungi from Ligularia sagitta注：A.H1的菌落；a.H1的菌絲；B.Y4的菌落；b.Y4的菌絲Note:A.The colony of H1；a.The hyphae of H1;B.The colony of Y4；b.The hyphae of Y4

2.3 箭葉橐吾內(nèi)生真菌DNA凝膠電泳結(jié)果

箭葉橐吾內(nèi)提取到的DNA用引物ITS1和ITS4進行擴增后的產(chǎn)物經(jīng)電泳跑膠后與標準DNA Marker DL 2000比對檢測后顯示各菌株的基因組序列的大小均在500 bp～750 bp之間。

2.4 箭葉橐吾內(nèi)生真菌種屬鑒定結(jié)果

將提取的箭葉橐吾內(nèi)生真菌DNA的PCR擴增產(chǎn)物序列在NCBI(National Center of Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，結(jié)合菌落菌絲及孢子的形態(tài)學觀察，鑒定結(jié)果如表3所示，發(fā)現(xiàn)分離得到的21株真菌除Fungalsp. (LBF10)外，其余20株分屬于3綱、3目、7科、9屬。

表3 箭葉橐吾內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of endophytic fungi from Ligularia sagitta

2.5 箭葉橐吾內(nèi)生真菌在不同組織中的分布

將植物不同組織中分離得到的內(nèi)生真菌進行分類處理，計算其不同組織的相對分離率以及不同屬的內(nèi)生真菌的相對分離率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，箭葉橐吾花中內(nèi)生真菌的相對分離率最高為42.86%，葉次之,為38.10%，內(nèi)生真菌在莖中的相對分離率為14.29%，根的相對分離率最小，為4.76%。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，柄孢殼菌屬(Podosporasp.)和交鏈孢霉屬(Alternariasp.)的相對分離率最高，其為箭葉橐吾內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種屬，此外箭葉橐吾內(nèi)生真菌的多樣性豐富。

表4 箭葉橐吾內(nèi)生真菌的相對分離率Table 4 Relative frequency of endophytic fungi from Ligularia sagitta

2.6 箭葉橐吾內(nèi)生真菌系統(tǒng)進化分析

將箭葉橐吾內(nèi)生真菌DNA鑒定結(jié)果在MEGA中進行分析，結(jié)果如圖2所示。除了Ustilagostriiformis(HAI 4611)，其余根據(jù)親緣關(guān)系的遠近可分為種群Ⅰ和種群Ⅱ兩個群，自檢支持率分別為56%和100%。種群Ⅰ中，毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)與柄孢殼菌屬的親緣關(guān)系較近；種群Ⅱ中，交鏈孢霉屬與短梗蠕孢霉屬(Trichocladiumsp.)的親緣關(guān)系較近。

圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the program neighbor-joining based on 5.8S rDNA-ITS sequences

3 討論

目前植物內(nèi)生真菌的分離方法是植物的表面消毒法，消毒時間的長短會影響植物內(nèi)生真菌的活性以及數(shù)量，時間過短可能使其表面的細菌或真菌未殺滅而污染培養(yǎng)基，消毒時間過長則會殺滅植物內(nèi)的真菌。本試驗所采用的消毒程序中箭葉橐吾花、葉、莖在2% NaClO中的最佳消毒時間分別為40 s，1 min 40 s和1 min 50 s，而羅彪[28]確定的黃帚橐吾在3%NaClO中最佳消毒時間為葉(30 s)、根(1 min)和莖(1 min)。兩種橐吾屬植物最佳消毒時間除葉比莖組織的消毒時間短之外存在明顯差異，具體原因除了消毒程序中在75%酒精中的漂洗時間不同以及NaClO的消毒濃度不同之外，可能與兩種植物在不同生長階段組織結(jié)構(gòu)的鮮嫩程度不同有關(guān)，另外，分離黃帚橐吾時加入雙抗進行分離培養(yǎng)可能會對消毒時間產(chǎn)生一定的影響。

從箭葉橐吾內(nèi)生真菌的分離結(jié)果可以看出，分離獲得的21株菌株，涵蓋了真菌中的9個屬，通過比較分析，花和葉中所分離的真菌最多，這可能與箭葉橐吾花和葉的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，如箭葉橐吾的花和莖組織結(jié)構(gòu)相對于根莖而言比較疏松，而且花組織中花瓣極薄并且包含大量的細絲狀白色冠毛，這種結(jié)構(gòu)可能增加了真菌對于組織的侵染率。內(nèi)生真菌在不同組織中分布差異較大(內(nèi)生真菌在花、葉、莖、根中的相對分離率依次為42.86%，38.10%，14.29%，4.76%)，原因除了與試驗中用于分離真菌的組織數(shù)目以及組織特性有關(guān)外，還可能與植物內(nèi)生真菌分離的難易程度有關(guān)，比如有些內(nèi)生真菌雖然在植物內(nèi)存在，但其在人工培養(yǎng)條件下難以分離或者可能不適合生長在PDA培養(yǎng)基上而出現(xiàn)特性退化和消失[31]。在箭葉橐吾分離得到的真菌中，交鏈孢霉屬和柄孢殼菌屬是其優(yōu)勢菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)交鏈孢霉屬真菌在有毒植物變異黃芪(Astragalusvariabilis)[19]、莖直黃芪(Astragalusstrictus)[20]、小花棘豆(Achnatheruminebrians)[32]、苦馬豆(Sphaerophysasalsula)[33]、瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)[34]和毛序棘豆(Oxytropistrichosphaera)[35]等中都有分布。據(jù)報道，交鏈孢霉屬是植物中常見的優(yōu)勢屬，能夠增強宿主植物的抗逆性，與其共同進化建立互惠共生的關(guān)系[36]。此外，交鏈孢霉菌與多種植物的病害有關(guān)，其可以產(chǎn)生具有除草活性的多種毒素成分。例如，交鏈孢霉可產(chǎn)生與百草枯效果相似、廣譜而快速除草活性的鏈格孢菌毒素[37]。李雨龍等[38]發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌株LGB100401所產(chǎn)毒素具有較高的選擇性，對飛機草具有較高的除草活性，對馬唐、羽芒菊和賽葵也具有很強的毒性，但其對多數(shù)植物僅有較低的毒性，因此，研究交鏈孢霉屬代謝產(chǎn)物對生物防治很有價值。羅彪[28]為探究黃帚橐吾與其內(nèi)生真菌之間的關(guān)系，對抑菌活性最好的木霉屬菌株TrichodermaasperellumLB-N2發(fā)酵液的乙酸乙酯相進行硅膠柱層析后，用薄層層析法初步鑒定其為生物堿和萜類物質(zhì)兩類活性成分，這說明黃帚橐吾的毒性成分與其感染內(nèi)生真菌有關(guān)。那么箭葉橐吾的毒性成分是否與其共生的內(nèi)生真菌有關(guān)，還需要對其優(yōu)勢菌株次生代謝產(chǎn)物的化學成分及其生物活性進行深入研究，以便為后續(xù)進一步探討箭葉橐吾吡咯里西啶類生物堿在真菌中合成途徑及箭葉橐吾中毒病綜合防控奠定基礎。

4 結(jié)論

通過對箭葉橐吾內(nèi)生真菌分離鑒定，總計得到21株內(nèi)生真菌，除一株未定菌屬外，其余20株分屬于3綱、3目、7科、9屬。在箭葉橐吾不同組織器官中，花中真菌分離率最高且真菌分布的多樣性最豐富，交鏈孢霉屬和柄孢殼菌屬是其優(yōu)勢菌屬。