青海沙地白刺根際解淀粉芽孢桿菌DGL1的牧草促生活性及其基因組分析

楊 雪， 謝永麗*， 陳 蘭， 吳曉暉， 王 添， 青麗婷， 陳海龍

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

極端生境芽孢桿菌資源因具有較高耐逆性、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到了廣泛的關(guān)注[1]，有益芽孢桿菌屬可通過拮抗作用，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病效應(yīng)，通過產(chǎn)生有益代謝物及溶菌作用等途徑發(fā)揮對(duì)植物的防病促生作用，成為了生物防治病害的研究熱點(diǎn)[2-4]。

青海高原位于世界屋脊，地處低溫、缺氧、強(qiáng)紫外線照射的環(huán)境，由于極端環(huán)境的限制，草地生態(tài)環(huán)境相對(duì)脆弱，該地區(qū)牧草具有生長(zhǎng)期短、產(chǎn)草量低等特點(diǎn)。草原超載放牧，病、蟲、鼠害侵襲，進(jìn)一步加劇天然草地退化[5-8]。芽孢桿菌作為新型綠色環(huán)保肥料，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，將其應(yīng)用于退化草地的修復(fù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。吳曉暉等[9]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌KKLW1具有顯著促高原牧草梭羅草(Roegneriathoroldiana)生長(zhǎng)的活性，其種子萌發(fā)率和幼苗根長(zhǎng)分別提高了8%和12%。芽孢桿菌促生機(jī)制是多方面的。部分芽孢桿菌具有固氮活性，能夠固定并為植物供應(yīng)氮素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，改善土壤環(huán)境，提高作物產(chǎn)量。王楠等[10]報(bào)道稱，具有固氮活性的芽孢桿菌BJ-18對(duì)番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗具有顯著的促生作用。芽孢桿菌可以通過非核糖體合成途徑合成脂肽類物質(zhì)泛革素(Fengycin)、表面活性素(Surfactin)和伊枯草菌素(Iturin)[11]，還可通過核糖體途徑合成肽類物質(zhì)枯草菌素[12]，這些抗生素對(duì)水稻條斑病(Xanthomonasoryzae)[13]、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)[14]、黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis)[15]等多種病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。此外，青海作物秸稈資源缺乏充分的利用，造成極大的浪費(fèi)。篩選出適應(yīng)高原生境的、具有降解纖維素活性的芽孢桿菌菌株，應(yīng)用于秸稈還田或牧草微貯，可提高多糖降解[16]及轉(zhuǎn)化率、飼料利用率，促進(jìn)家畜胃腸道消化吸收[17]，抑制有害微生物的生長(zhǎng)[18]，因此篩選具有降解纖維素活性的芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用潛力。

隨著高通量測(cè)序的不斷發(fā)展，微生物基因組技術(shù)可從分子水平了解其基因組的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機(jī)制，為微生物在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)療、衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供新的理論基礎(chǔ)[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)青海省海西州高寒草原、鹽堿地、濕地、荒漠沙地、荒漠、鹽湖等多個(gè)典型生境進(jìn)行采樣，從分離的千余株芽孢桿菌中篩選具有抑菌促生活性的菌株，其中分離自大格勒干旱沙地白刺(N.tangutorum)根圍的解淀粉芽孢桿菌DGL1表現(xiàn)出良好的生物活性。本研究對(duì)菌株DGL1進(jìn)行拮抗活性、降解纖維素活性測(cè)定、固氮活性，及促高原牧草燕麥(Avenasativa)、冷地早熟禾(Poacrymophila)、紫羊茅(Festucarubra)、中華羊茅(Festucasinensis)生長(zhǎng)活性的研究，并利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株DGL1的基因組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其編碼基因進(jìn)行功能注釋，同時(shí)對(duì)菌株的固氮、降解纖維素、抑菌的關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘，以期為揭示菌株DGL1促生抗菌機(jī)制及進(jìn)一步研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：解淀粉芽孢桿菌DGL1分離自青海海西州大格勒干旱沙地白刺根圍(海拔3 010 m，東經(jīng)95°45′，北緯36°45′)。

病原指示菌：瓜類枯萎病菌(F.oxysporum)、銳頂鐮孢病菌(F.acuminatum)、小麥赤霉菌(F.graminearum)由青海大學(xué)高原草地資源與生態(tài)省部共建實(shí)驗(yàn)室保存。

牧草草種：燕麥(A.sativa)、冷地早熟禾(P.crymophila)、紫羊茅(F.rubra)、中華羊茅(F.sinensis)由青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

改良阿須貝無氮液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，K2HP040.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL。

培養(yǎng)基：LB (Luria-bertani)培養(yǎng)基用于芽孢桿菌的活化及培養(yǎng)[20]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基用于病原真菌的培養(yǎng)[21]；改良阿須貝(Ashby)無氮液體培養(yǎng)基用于芽孢桿菌固氮能力檢測(cè)[22]；羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium fluid medium，CMC)培養(yǎng)基用于芽孢桿菌降解纖維素活性檢測(cè)[23]。

1.2 拮抗病原真菌活性能力的測(cè)定

將病原真菌瓜類枯萎病菌、銳頂鐮孢病菌、小麥赤霉菌活化后打菌碟，分別接種于PDA平板上，在平板等距離對(duì)稱的點(diǎn)上，放上直徑4 mm的濾紙片，吸取活化的DGL1菌液5 μL點(diǎn)于濾紙片中央，重復(fù)3次，置于25℃條件下培養(yǎng)5 d后，取出觀測(cè)并記錄抑菌圈直徑[24]。

1.3 降解纖維素活性測(cè)定

在CMC篩選培養(yǎng)基平板上，在平板等距離對(duì)稱的4個(gè)點(diǎn)上，放置直徑4 mm的濾紙片，將菌株DGL1接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃,200 r·min-1過夜培養(yǎng)12 h，取待測(cè)菌液5 μL點(diǎn)于濾紙片中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)2 d后，將Gram碘染液注入平板表面，蓋上皿蓋，靜置4 min后倒去染液，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值A(chǔ)，A越大說明降解纖維素活性越大[25]。

1.4 菌株固氮能力測(cè)定

挑取活化的芽孢桿菌菌株DGL1轉(zhuǎn)接到10 mL改良阿須貝(Ashby)無氮液體培養(yǎng)中，37℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d后，取出菌液與對(duì)照進(jìn)行比較，觀察菌株在無氮培養(yǎng)基中的活化程度[26]。

1.5 芽孢桿菌促牧草植物生活性測(cè)定

1.5.1芽孢桿菌菌懸液制備 用接種環(huán)蘸取少量—80℃保存的菌株DGL1的菌液在LB固體平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，待LB平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種于盛有20 ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)好的菌液離心取菌體，用無菌水懸浮，菌液濃度調(diào)整至106cfu·mL-1，制備成芽孢桿菌菌懸液[27]。

1.5.2菌液DGL1促牧草種子萌發(fā)試驗(yàn) 選擇種皮完好的燕麥、冷地早熟禾、紫羊茅、中華羊茅種子于20%次氯酸鈉溶液中消毒處理后，將4種牧草種子在DGL1菌懸液中浸種(菌懸液濃度為106cfu·mL-1)2 h，無菌水處理作對(duì)照。將浸種后的種子放于無菌培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28℃，光周期16 h/8 h)，每天按時(shí)定量補(bǔ)足水分，培養(yǎng)7 d后測(cè)量燕麥(每一重復(fù)20粒種子),冷地早熟禾(每一重復(fù)50粒種子),紫羊茅(每一重復(fù)50粒種子),中華羊茅(每一重復(fù)50粒種子)種子的萌發(fā)情況、芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)菌株DGL1對(duì)4種牧草種子的促萌發(fā)效果。

1.5.3菌液DGL1促幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn) 選擇種皮完好的燕麥、冷地早熟禾、紫羊茅、中華羊茅種子于20%次氯酸鈉溶液中消毒處理后，將4種牧草種子在DGL1菌懸液(菌液濃度為106cfu·mL-1)處理種子2 h，無菌水處理作對(duì)照。將種子(15株/盆)播于穴盆中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(27℃，光周期16 h/8 h)。定時(shí)定量補(bǔ)足水分，培養(yǎng)20 d后測(cè)量燕麥(30 株·盆-1)、冷地早熟禾(50 株·盆-1)、紫羊茅(50株·盆-1)、中華羊茅(50 株·盆-1)幼苗株高、根長(zhǎng)和鮮重，每個(gè)處理3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)菌株DGL1對(duì)4種牧草幼苗的促生效果。

1.6 菌株DGL1全基因組測(cè)序

1.6.1樣品制備 將芽孢桿菌DGL1進(jìn)行活化后，接種于于盛有20 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)好的菌液離心10 min(10 000 r·min-1)后取菌體，液氮速凍后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.6.2全基因組測(cè)序 收集純化的DGL1基因組DNA，利用Covaris儀將基因組DNA片段化，構(gòu)建合格的基因組測(cè)序文庫(kù)，進(jìn)行橋式PCR后的Illumina Hiseq測(cè)序，將下機(jī)得到的數(shù)據(jù)利用組裝軟件SOAPdenovo2進(jìn)行多個(gè)Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的contigs組裝結(jié)果，然后把reads比對(duì)到contig上，根據(jù)reads的paired-end和overlap關(guān)系，對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化，形成scaffolds，將組裝后的序列進(jìn)行生物學(xué)分析。

1.6.3基因組注釋功能與預(yù)測(cè) 采用GO[27]，KEGG[28]和COG[29]對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行快速注釋，并得到相應(yīng)的注釋信息；采用Prodigal[30]，RNAmmer[31]等工具對(duì)編碼序列、核糖體RNA基因進(jìn)行注釋與預(yù)測(cè)，使用CGView[32]軟件繪制菌株DGL1的基因組環(huán)形圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗病原真菌活性的測(cè)定

以病原真菌銳頂鐮孢菌、瓜類枯萎菌、小麥赤霉菌作為病原指示菌，通過平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株DGL1的抑菌活性，結(jié)果表明：菌株DGL1對(duì)銳頂鐮孢病菌的抑菌圈直徑為29 mm，對(duì)瓜類枯萎病菌抑菌直徑為26 mm，對(duì)小麥赤霉菌的抑菌圈直徑為29 mm，表明DGL1菌株具有顯著拮抗病原真菌活性(圖1)。

圖1 菌株DGL1對(duì)銳頂鐮孢病菌(A)、瓜類枯萎病菌(B)、小麥赤霉菌(C)產(chǎn)生的抑菌圈Fig.1 Bacteriostatic circles of DGL1 strains against F. acuminatum (A)， F.oxysporum (B) and F.graminearum (C)注：中間菌落是病原指示菌，周圍四個(gè)菌落是待測(cè)芽孢桿菌DGL1Note:The middle of the pathogenic bacteria is the indicator bacteria,around the four colonies is tested Bacillus DGL1

2.2 降解纖維素活性測(cè)定

通過CMC法測(cè)定菌株DGL1降解纖維素活性，結(jié)果表明：菌株DGL1在以纖維素為唯一碳源的CMC培養(yǎng)基上產(chǎn)生了降解透明圈，表明菌株DGL1具有降解纖維素的能力，能夠通過代謝作用產(chǎn)生解纖維素酶降解了CMC平板上的纖維素。通過降解透明圈與菌落直徑比值A(chǔ)測(cè)定降解纖維素活性大小，透明圈直徑為17 mm，菌落的直徑為7.1 mm，比值A(chǔ)是2.40，表明DGL1具有一定的降解纖維素活性(圖2)。

圖2 菌株DGL1降解纖維素形成的透明圈Fig.2 Transparent circles produced by DGL1 for cellulose degradation

2.3 固氮活性測(cè)定

檢測(cè)菌株DGL1的固氮活性，結(jié)果表明：芽孢桿菌DGL1經(jīng)改良阿須貝(Ashby)無氮液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后的發(fā)酵液(A)比對(duì)照(B)渾濁，表明菌株DGL1可在無氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，初步推測(cè)其具有一定的固氮能力(圖3)。

圖3 菌株DGL1在無氮液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of strain DGL1 in nitrogen-free liquid medium

2.4 促牧草生長(zhǎng)活性測(cè)定

2.4.1菌液DGL1促牧草種子萌發(fā)試驗(yàn) 與對(duì)照相比，經(jīng)菌懸液處理的燕麥、冷地早熟禾、中華羊茅、紫羊茅草種的發(fā)芽率分別為64.90%，23.80%，76.60%，81.20%，相比清水處理組CK增幅為4.5%，8.0%，44.3%，18.4%；其中，菌液處理對(duì)中華羊茅的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)促生效果最佳，與對(duì)照比分別增幅為186%，213.4%，對(duì)紫羊茅的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)促生效果最弱，與對(duì)照比增幅僅為15.4%，13.0%(圖4，表1)，表明菌株DGL1菌懸液對(duì)燕麥、冷地早熟禾、紫羊茅、中華羊茅草種均有較明顯的促萌發(fā)效果。

圖4 菌株DGL1促牧草種子萌發(fā)(7 d)Fig.4 Effect of plant seedling promoted by DGL1(7 d)注：A，紫羊茅；B，燕麥；C，中華羊茅；D，冷地早熟禾N(yùn)ote:A,Festuca rubra;B,Avena sativa;C,Festuca sinensis;D,Poa crymophila

表1 菌株DGL1對(duì)牧草種子萌發(fā)的影響Table1 Effect on plant seedling promoted by DGL1

2.4.2菌液DGL1促牧草生長(zhǎng)活性測(cè)定 DGL1菌懸液對(duì)燕麥、紫羊茅、中華羊茅幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重均具有顯著性提高。經(jīng)DGL1菌液處理的燕麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重分別達(dá)到26.70 cm，12.60 cm，0.39 g，與對(duì)照組相比增加29.6%，45.3%，69.6%；經(jīng)DGL1處理的冷地早熟禾幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重分別達(dá)到7.54 cm，3.44 cm，0.009 g，與對(duì)照組相比增加17.6%，57.8%，80%；經(jīng)DGL1菌液處理的中華羊茅幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重分別達(dá)到18.98 cm，4.80 cm，0.05 g，與對(duì)照組相比增加112.3%，98.3%，400%；經(jīng)DGL1菌液處理的紫羊茅幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重分別達(dá)到18.71 cm，8.69 cm，0.08 g，與對(duì)照組相比增加24.4%，88.1%，100%；菌株DGL1對(duì)中華羊茅的株高、根長(zhǎng)、鮮重的促生效果最佳，對(duì)冷地早熟禾的株高以及燕麥的鮮重促生效果最弱(圖5，表2)。

圖5 菌株DGL1促牧草幼苗生長(zhǎng)(20 d)Fig.5 Effect of plant seedling promoted by DGL1(20 d)注：A,燕麥;B,紫羊茅;C,中華羊茅;D,冷地早熟禾N(yùn)ote:A,Avena sativa;B,Festuca rubra;C,Festuca sinensis;D,Poa crymophila

表2 菌株DGL1促牧草幼苗生長(zhǎng)Table 2 Effect of plant seedling promoted by DGL1

2.5 菌株DGL1基因組測(cè)序

2.5.1基因組的基本特征 通過SOAPdenovo軟件對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，根據(jù)組裝結(jié)果分析可知，二代測(cè)序Reads總數(shù)為9 802 908條，堿基總數(shù)高達(dá)1 480 239 108 bp；堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比為97.06%；堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比為92.00%，DGL1的染色體是一條長(zhǎng)為3 915 550 bp的環(huán)形結(jié)構(gòu)，GC含量為46.47%，CDS數(shù)量為3 972，有86個(gè)tRNA，27個(gè)rRNA，基因組圈圖見圖6，DGL1基因組序列已上傳NCBI，登錄號(hào)為CP065539。

圖6 菌株DGL1的基因組圈圖Fig.6 Circular map of Bacillus amyloliquefaciens strain DGL1注：圈圖從外到內(nèi)第一圈和第四圈為正鏈、負(fù)鏈上的CDS，不同的顏色表示不同的COG功能分類；第二圈和第三圈分別為正鏈、負(fù)鏈上的CDS、tRNA、rRNA；第五圈為GC含量，向外的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，峰值越高表示與平均GC含量差值越大，向內(nèi)的部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量，峰值越高表示與平均GC含量差值越大；第六圈為GC-Skew值，具體算法為(G-C)/(G+C)，可以輔助判斷前導(dǎo)鏈和后滯鏈，一般前導(dǎo)鏈GC skew>0，后滯鏈GC skew<0，也可以輔助判斷復(fù)制起點(diǎn)(累計(jì)偏移最小值)和終點(diǎn)(累計(jì)偏移最大值)，尤其對(duì)環(huán)狀基因組最為重要；最內(nèi)一圈為基因組大小標(biāo)識(shí)Note：The first and fourth circles from outside to inside are CDS on positive and negative strands,with different colours indicating different COG functional classifications;the second and third circles are CDS,tRNA and rRNA on positive and negative strands,respectively;the fifth circle is GC content,with the outward part indicating that the GC content of the region is higher than the genome-wide average GC content,with a higher peak indicating a greater difference from the average GC content,and the inward.The sixth circle is the GC-Skew value,the specific algorithm is (G-C)/(G+C),which can help to determine the leading strand and lagging strand,generally the leading strand GC skew>0 and the lagging strand GC skew<0,also can help to determine the starting point (cumulative offset minimum) and the ending point (cumulative offset maximum) of replication.) and endpoints (cumulative offset maxima),especially for circular genomes;the innermost circle is the genome size marker

2.5.2基因組功能注釋 將菌株DGL1的基因序列與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行了20個(gè)功能分類，共注釋到2 970個(gè)基因，占總基因的74.77%。其中預(yù)測(cè)到的已知功能中，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝功能預(yù)測(cè)的最多(圖8)。

圖8 GO注釋聚類分析Fig.8 Gene distribution based on GO classification

將菌株DGL1的基因序列與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共注釋到3類2 926個(gè)基因，占總基因的73.67%，其中與細(xì)胞組成(Cellular component)相關(guān)基因數(shù)量有1 555個(gè)，主要與膜的組成部分、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜的形成有關(guān)；與分子功能(Molecular function)相關(guān)的基因數(shù)量2 288個(gè)，主要與ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合過程有關(guān)；與生物過程(Biological process)相關(guān)的基因數(shù)量2 133個(gè)，主要與氧化還原過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板有關(guān)(圖9)。

圖9 KEGG注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.9 Classification statistics of KEGG annotation

通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌DGL1的KEGG途徑分析發(fā)現(xiàn)，共有2 160個(gè)基因參與了功能注釋，155條途徑參與細(xì)胞生命過程，169條途徑參與環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，1 280條途徑參與物質(zhì)新陳代謝過程，其中主要是以氨基酸代謝、碳水化合物代謝途徑最多(圖10)。

圖7 COG注釋聚類分析Fig.7 Gene distribution based on COG classification

2.6 菌株DGL1的相關(guān)功能基因分析

2.6.1降解纖維素活性相關(guān)基因分析 通過基因功能注釋分析表明，芽孢桿菌DGL1基因組存在4個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶基因，這些編碼基因與纖維素酶的合成有關(guān)。通過生物學(xué)活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株DGL1能夠在CMC-Na上產(chǎn)生透明圈，能夠?qū)⒗w維素降解為單糖，并通過KEGG代謝通路發(fā)現(xiàn)2條與降解纖維素有關(guān)的途徑，途徑一是由內(nèi)切葡聚糖酶分解成纖維糊精(cellodextrin)，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖；途徑二是纖維素可以由內(nèi)切葡聚糖酶分解成纖維二糖(cellobiose)，之后再降解成葡萄糖(表3)。

2.6.2拮抗活性相關(guān)基因分析 通過基因功能注釋對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，菌株DGL1具有編碼脂肽類抑菌fengycin蛋白的基因簇，該基因簇包含ppsA，ppsB，ppsC，ppsD，ppsE等基因共49個(gè)，與編碼fengycin基因簇的同源性可達(dá)到100%，也具有編碼脂肽類抑菌Surfactin蛋白的基因簇，該基因簇包含SrfAA，SrfAB，SrfAC等共48個(gè)，與編碼Surfactin基因簇的同源性可達(dá)到91%，據(jù)劉郵洲等[32]報(bào)道，萎縮芽孢桿菌中提取到的泛革素、表面活性素對(duì)草莓枯萎病菌菌絲的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株DGL1能夠明顯抑制瓜類枯萎病菌、銳頂鐮孢病菌、小麥赤霉病菌在PAD平板上生長(zhǎng)，預(yù)測(cè)菌株DGL1可能通過代謝合成泛革素、表面活性素，增加菌株的抑真菌活性(表3)。

2.6.3促生抗逆相關(guān)功能基因分析 通過基因功能注釋分析表明，芽孢桿菌DGL1基因組中存在與生長(zhǎng)激素合成的關(guān)鍵基因yhcX[34]，dhaS[34]，YsnE[35]。菌株DGL1可能合成IAA，促進(jìn)植物組織細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)，大量研究表明，芽孢桿菌屬可以合成吲哚乙酸從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

基因功能注釋分析表明，芽孢桿菌DGL1基因組中存在固氮所必需的基因glnB[36]及在共生固氮過程中起調(diào)控作用的基因NifA[37]，本研究通過改良阿須貝無氮培養(yǎng)基法初步測(cè)定出菌株DGL1具有固氮能力，能夠通過增加植物體內(nèi)氮素的含量從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)注釋到編碼合成增強(qiáng)植物抗逆性物質(zhì)2，3-丁二醇的關(guān)鍵基因alsR[38]，從而增強(qiáng)芽孢桿菌在逆境環(huán)境的生存生長(zhǎng)(表3)。

表3 菌株DGL1相關(guān)基因分析Table 3 Related gene analysis of DGL1

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)分離自青海大格勒干旱沙地白刺(N.tangutorum)根圍的解淀粉芽孢桿菌DGL1進(jìn)行拮抗病原真菌活性分析發(fā)現(xiàn)，菌株DGL1對(duì)病原真菌瓜類枯萎病菌、銳頂鐮孢病菌、小麥赤霉病菌均具有良好的拮抗活性。據(jù)報(bào)道，拮抗菌在代謝過程中可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，包括脂肽類、多肽類、抑菌蛋白，其中脂肽類抗生素在生防制劑中占據(jù)主導(dǎo)地位[39]。陳華等報(bào)道[40]，枯草芽孢桿菌JA產(chǎn)生的脂肽類化合物對(duì)絲狀真菌具有較好的抑菌活性；錢常娣等報(bào)道[41]枯草芽孢桿菌菌株BAB-1產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠顯著抑制番茄灰霉菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子的萌發(fā)。本研究通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DGL1基因組中存在與脂肽類化合物合成有關(guān)的編碼基因簇Surfactin，fengycin，預(yù)測(cè)DGL1具有的拮抗病原真菌活性與脂肽類化合物Surfactin，fengycin有關(guān)。

蔣加拉等[42]報(bào)道，芽孢桿菌能夠抑制胃、腸道致病菌的入侵，調(diào)節(jié)免疫，提高食物利用率和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等生物學(xué)功能，在飼料加工及秸稈還田方面具有一定的應(yīng)用潛力。本研究測(cè)定分析表明菌株DGL1具有降解纖維素的能力，同時(shí)通過基因注釋發(fā)現(xiàn)DGL1基因組存在與降解纖維素基因有關(guān)的β-葡聚糖酶基因，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋到與降解纖維素有關(guān)的代謝途徑。目前，芽孢桿菌作為生物菌肥，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，王美琴等[43]報(bào)道枯草芽孢桿菌對(duì)番茄種子的萌發(fā)具有很強(qiáng)的促生作用，渠露露等[44]報(bào)道類芽孢桿菌能夠明顯增加了水稻幼苗的根長(zhǎng)、根數(shù)和苗高。本研究分離篩選的解淀粉芽孢桿菌DGL1菌懸液對(duì)燕麥、冷地早熟禾、紫羊茅、中華羊茅草種均有較明顯的促萌發(fā)效果，同時(shí)對(duì)4種牧草幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重具有明顯的促生增產(chǎn)作用。芽孢桿菌通過多種途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng)，如通過固定空氣中的氮元素供給植物生長(zhǎng)，合成植物生長(zhǎng)激素促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，合成鐵載體吸收土壤中的鐵元素供給植物利用[45]。本研究經(jīng)過阿須貝無氮培養(yǎng)基法測(cè)定發(fā)現(xiàn)菌株DGL1具有固氮能力，同時(shí)基因注釋到DGL1基因組中存在固氮所必需的基因glnB，在共生固氮過程中起調(diào)控作用的基因NifA，以及IAA合成必要的基因yhcX，dhaS，YsnE。本研究對(duì)菌株DGL1進(jìn)行全基因組測(cè)序，探究菌株DGL1的生防機(jī)制。測(cè)序分析表明菌株DGL1的染色體是一條長(zhǎng)為4 248 134 bp的環(huán)形結(jié)構(gòu)，GC含量為43.57%，CDS數(shù)量為4 465，有85個(gè)tRNA，30個(gè)rRNA，通過與COG，GO，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分別注釋到2 970，2 926，2 160個(gè)功能基因。

菌株DGL1具有良好的抑制病原真菌、降解纖維素和固氮活性，能夠明顯促進(jìn)高原牧草燕麥、冷地早熟禾、紫羊茅、中華羊茅植物的生長(zhǎng)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)病害的防御過程中起著重要的作用，在退化草地生態(tài)恢復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛能。本研究通過生物學(xué)活性檢測(cè)與基因組測(cè)序結(jié)合分析，揭示了菌株DGL1促牧草生長(zhǎng)的作用效應(yīng)，展現(xiàn)了DGL1具有微生物制劑的研發(fā)潛能。