呼倫貝爾草原不同利用方式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

曲 艷， 宋 倩， 楊合龍， 趙 坤， 趙 敏， 劉玉玲， 王德平， 戎郁萍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193； 2.中國(guó)草學(xué)會(huì)， 北京 100193;3.包頭市園林綠化事業(yè)發(fā)展中心， 內(nèi)蒙古 包頭 014030)

土壤微生物數(shù)量龐大，種類(lèi)繁多，是土壤生物的重要組成部分[1]。土壤微生物占有機(jī)質(zhì)比例較小，但直接或間接參與幾乎所有的土壤過(guò)程[2]。土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生微小的變化，表征土壤生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境的變化[3-4]。

放牧和割草是草地資源的主要利用方式，通過(guò)移除植物地上部分，改變草地植物群落及其生長(zhǎng)環(huán)境，影響土壤微生物群落。此外，草地放牧還通過(guò)家畜排泄物的返還以及踐踏作用，直接改變土壤微生物生存環(huán)境，進(jìn)而影響土壤微生物群落[5]。長(zhǎng)期不合理或過(guò)度利用使草地植被退化，土壤環(huán)境惡化[6]，影響土壤微生物群落組成及功能。關(guān)于草地利用方式對(duì)土壤微生物的影響是近年的研究熱點(diǎn)之一，李玉潔等研究表明，刈割處理下內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原的土壤微生物磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acids，PLFA)總量顯著高于圍封與放牧草地，且刈割明顯提高了土壤細(xì)菌含量，但對(duì)真菌含量無(wú)顯著影響[7]；邵玉琴等[8]研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物數(shù)量隨割草頻率的增加而降低，但長(zhǎng)期圍封降低微生物在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用；張立朝指出叢枝菌根真菌在羊草被刈割后的補(bǔ)償生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用[9]。近些年關(guān)于不同利用方式對(duì)呼倫貝為草原影響的研究雖較多，但尚不完善。

本文通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原在封育、割草、連續(xù)放牧、不同時(shí)間休牧處理下土壤微生物群落的研究，系統(tǒng)地探討土壤微生物各類(lèi)群組成及比值對(duì)草地利用方式的響應(yīng)特征，厘清不同的草地利用方式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及關(guān)鍵土壤環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，準(zhǔn)確評(píng)估土壤生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，對(duì)呼倫貝爾地區(qū)合理利用草地資源具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)區(qū)位于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市陳巴爾虎旗中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站(49°20′～49°26′ N，119°55′～120°09′ E，海拔628～649 m)；屬半干旱大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫—1.2℃，年均降水量約355 mm，多集中在7—8月份；土壤類(lèi)型為黑鈣土或暗栗鈣土，土壤(0～10 cm)有機(jī)碳含量為36.7 g·kg-1，全氮含量為3.7 g·kg-1，全磷含量為0.5 g·kg-1[10]。該地草地類(lèi)型為溫性草甸草原，建群種為羊草(Leymuschinensis)，主要植物種包括：貝加爾針茅(Stipabaicalensis)、無(wú)芒雀麥(Bromusinermis)、草地早熟禾(Poapratensis)、糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)等。

2016—2019年，設(shè)圍封、割草、連續(xù)放牧，生長(zhǎng)季早期休牧、中期休牧及晚期休牧6個(gè)草地利用方式處理，每個(gè)處理6次重復(fù)，采用拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共36個(gè)小區(qū)。每小區(qū)面積20 m2(4 m×5 m)，小區(qū)間設(shè)2 m的隔離帶。草地圍封處理(EN)全年不利用；割草地處理(CP)每年8月中旬刈割，留茬高度8 cm；放牧樣地采用模擬放牧處理，留茬高度6 cm，其中連續(xù)放牧處理(CG)每年6月中旬—9月中旬連續(xù)利用；生長(zhǎng)季早期休牧處理(GR1)于每年6月中旬—7月中旬不放牧；生長(zhǎng)季中期休牧處理(GR2)每年7月中旬—8月中旬不放牧；生長(zhǎng)季晚期休牧處理(GR3)每年8月中旬—9月中旬不放牧。放牧小區(qū)除進(jìn)行地上部分的留茬處理外，還進(jìn)行踐踏和撒施糞便處理，體重約55 kg的成年人穿釘有羊蹄的鞋子在小區(qū)內(nèi)走動(dòng)，直至均勻踏遍，每次走動(dòng)可在土壤表面施加約92 kPa的壓力，符合羊在實(shí)際踐踏中產(chǎn)生的壓強(qiáng)值[11]；放牧小區(qū)均撒施羊糞100 g·m-2干物質(zhì)，其中連續(xù)放牧小區(qū)分3次施入，生長(zhǎng)季不同時(shí)間休牧小區(qū)分2次施入[12]。

1.2 樣品采集與處理

2019年8月底，用內(nèi)徑5 cm的土鉆在各小區(qū)四角及中間方位區(qū)域各隨機(jī)取10 cm土壤樣品，充分混合后，取出約500 g裝入自封袋，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品過(guò)2 mm篩子后均分2份，一份室內(nèi)風(fēng)干，用于土壤理化指標(biāo)測(cè)定，另一份放入—80℃冰箱中保存，用于測(cè)定土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮，微生物量碳、氮及土壤微生物磷脂脂肪酸含量等。

1.3 土壤指標(biāo)測(cè)定

1.3.1土壤理化指標(biāo) 土壤容重測(cè)定采用環(huán)刀法；土壤pH值測(cè)定采用酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠，上海)；土壤電導(dǎo)率測(cè)定采用電導(dǎo)儀(上海雷磁儀器廠，上海)；土壤全碳和全氮含量測(cè)定采用元素分析儀(Elementar Vario EL C/N analyzer,Germany)；土壤全磷和速效磷含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定[13]；土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量測(cè)定采用流動(dòng)分析儀(AutoAnalyser 3,Seal Analytical,Norderstedt,Germany)。

1.3.2土壤微生物量碳、氮含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取40 g新鮮土樣放入燒杯中，調(diào)節(jié)土壤含水量(田間持水量的40%)后放入底部有少量水的保鮮盒中密封，于25℃下預(yù)培養(yǎng)7 d。每個(gè)預(yù)處理后的樣品取20 g，均分為2份，一份在真空干燥器中用無(wú)水三氯甲烷熏蒸處理，一份為不熏蒸的對(duì)照樣品。兩份樣品均加40 ml的K2SO4溶液(0.5 mol·L-1)，振蕩過(guò)濾后，用總有機(jī)碳氮分析儀(Multi N/C 3100，Analyticjena，Germany)測(cè)定濾液中的有機(jī)碳、氮的含量[14]。

1.3.3土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的測(cè)定與分析 參考孫建[15]的方法，采用Agilent 6890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)與微生物辨別軟件(MIDI Inc.，Newark，NJ)分析磷脂脂肪酸種類(lèi)。含量以PLFA 19∶0作為內(nèi)標(biāo)來(lái)進(jìn)行定量計(jì)算，其公式如下：

式中，A為19∶0的峰值，B為目標(biāo)PLFA的峰值?？偽⑸锷锪坑酶鱌LFA含量加和表示。

根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)中特定磷酸脂肪酸(PLFA)標(biāo)記[16]，對(duì)土壤微生物群落類(lèi)群進(jìn)行表征。其中將14∶00，15∶00，16∶00，17∶00，18∶1ω7c，18∶00，20∶00表征為一般性細(xì)菌；13∶0 iso，14∶0 iso，15∶0anteiso，15∶0 iso，16∶0 iso，17∶0 iso，17∶0 anteiso，18∶0 iso表征為革蘭氏陽(yáng)性菌；6∶1ω9c，16∶1ω7c，17∶0 cycloω7c，18∶1ω5c，19∶0 cycloω7c表征為革蘭氏陰性菌；18∶3ω6c，18∶2ω6c，18∶1ω9c表征為真菌；16∶1ω5表征為菌根真菌；16∶0 10-methyl，20∶0 10-methyl表征為放線(xiàn)菌。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整合，利用SAS 9.4軟件對(duì)不同草地利用方式間的土壤理化性質(zhì)與各類(lèi)群土壤微生物含量作單因素方差分析(One-way ANOVA)，差異顯著性水平為P<0.05，并借助Canoco 5軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行RDA冗余分析。利用Sigmaplot14.0將數(shù)據(jù)可視化處理，采用箱式圖展示土壤微生物量碳、氮數(shù)據(jù)位置及分散等信息。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地不同利用方式下土壤理化性質(zhì)分析

草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤理化性質(zhì)的影響不同(表1)。土壤pH值、土壤容重和全磷含量在各個(gè)草地利用方式下均無(wú)顯著性差異。而CG，GR2，GR3處理下土壤電導(dǎo)率顯著高于CP處理(P<0.05)，分別提高了17.69%，10.47%，19.79%。土壤全碳和全氮含量在各處理下的變化趨勢(shì)一致，均在CG處理下達(dá)到最高值，顯著高于CP處理，且與其他處理無(wú)顯著差異。EN處理下的土壤有效氮和速效磷含量均最高，其中土壤硝態(tài)氮含量較CP，GR處理顯著升高，并分別提高了58.55%，40.57%，28.24%，23.28%；土壤銨態(tài)氮含量顯著高于CG，GR2處理下，分別提高了26.41%，23.73%；而土壤速效磷含量則顯著高于CP處理，提高了39.95%。

表1 草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 The influence of grassland utilization on the physical and chemical properties of Hulunbuir grassland soil

2.2 草地不同利用方式對(duì)土壤微生物量碳、氮的影響

不同的草地利用方式下(EN，CP，CG)土壤微生物量碳、氮含量均表現(xiàn)為CP>CG>EN；隨著生長(zhǎng)季休牧?xí)r期的延后，土壤微生物量碳含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，而土壤微生物量氮含量卻呈逐漸下降的趨勢(shì)(圖1)。草地利用方式對(duì)土壤微生物量碳/氮的影響無(wú)顯著差異(圖2)。

圖1 不同草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤微生物量碳、氮含量的影響Fig.1 The effect of different grassland utilization methods on soil microbial biomass carbon and nitrogen content in Hulunbuir grassland

圖2 不同草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤微生物量碳/氮比值的影響Fig.2 The influence of different grassland utilization methods on the soil microbial biomass carbon/nitrogen ratio in Hulunbuir grassland

2.3 草地不同利用方式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物PLFA總濃度及各類(lèi)群濃度在不同的草地利用方式下存在一定的差異(表2)。CP處理下微生物PLFA總濃度低于其他處理，且顯著低于GR3處理(P<0.05)，降低37.60%，休牧處理(GR1，GR2，GR3)下PLFA總濃度均高于EN，CP，CG處理，且隨著休牧?xí)r間的推后，PLFA總濃度呈升高趨勢(shì)；各微生物類(lèi)群含量與PLFA總量在各處理下變化情況大體一致，但值得一提的是，真菌與革蘭氏陰性菌PLFA含量在休牧放牧下有所改變，真菌PLFA含量在GR2處理下最低，而革蘭氏陰性菌則在GR2處理下濃度最高。

表2 不同草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤微生物菌群PLFA含量的影響Table 2 Effects of different grassland utilization methods on the PLFA content of soil microbial flora in Hulunbuir grassland

土壤微生物PLFA比值變化(表3)結(jié)果顯示，細(xì)菌/真菌PLFA濃度比在各處理下均無(wú)顯著性差異，GR2與GR3處理下變異系數(shù)同時(shí)達(dá)到最大，CP處理下最?。粚?duì)革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌(G+/G-)PLFA濃度比而言，CG處理下比值最高，顯著高于GR2處理(P<0.05)，但與其他處理差異不顯著。EN，CP與CG處理下G+/G-整體上高于休牧處理(GR1，GR2，GR3)。從比值變異程度來(lái)看，CG處理下的G+/G-比值變異系數(shù)最大，而GR2處理最小，與細(xì)菌/真菌相反。

表3 草地利用方式對(duì)呼倫貝爾草原土壤微生物PLFA比值的影響Table 3 The influence of grassland utilization on the ratio of soil microbial PLFA in Hulunbuir grassland

2.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

對(duì)土壤理化性質(zhì)指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系進(jìn)行冗余分析(圖3)，結(jié)果表明，土壤pH值、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量等變量可以解釋69.2%的微生物群落變異，擬合效果較可靠。其中細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、放線(xiàn)菌及總磷酸脂肪酸含量與土壤電導(dǎo)率、銨態(tài)氮含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，且真菌與硝態(tài)氮含量具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系；細(xì)菌/真菌與土壤硝態(tài)氮含量、電導(dǎo)率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與土壤銨態(tài)氮含量幾乎無(wú)關(guān)；革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌與土壤硝態(tài)氮含量、pH值呈正相關(guān)關(guān)系，與電導(dǎo)率和銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、放線(xiàn)菌及總磷酸脂肪酸含量的正相關(guān)性極強(qiáng)；土壤電導(dǎo)率與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量呈正相關(guān)關(guān)系，與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量卻呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖3 呼倫貝爾草原區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil microbial community structure and soil physical and chemical properties in Hulunbuir grassland area注：銨態(tài)氮；硝態(tài)氮；pH，pH值；Ec，電導(dǎo)率；bacteria，細(xì)菌；G+，革蘭氏陽(yáng)性菌；G-，革蘭氏陰性菌；fungi，真菌；actinomycetes，放線(xiàn)菌；Total PLFA，總磷脂脂肪酸；bacteria/ fungi，細(xì)菌/真菌；G+/G-，革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌Note:N nitrogen；pH,pH value；Ec,conductivity；bacteria,bacteria;G+,Gram-positive bacteria；G-,Gram-negative bacteria；Fungi,fungi;actinomycetes,actinomycetes;Total PLFA,total phospholipid fatty acids；Bacteria/fungi，bacteria/ fungi；G+/G-,Gram-positive bacteria/Gram-negative bacteria

3 討論

土壤微生物對(duì)土壤元素和養(yǎng)分的循環(huán)及轉(zhuǎn)化具有關(guān)鍵的作用。此外，土壤微生物作為周?chē)h(huán)境變化的指示因子，能夠敏感且快速做出甄別性反應(yīng)[7,17]。草地利用方式的差異通常會(huì)導(dǎo)致土壤環(huán)境因子(包括土壤物理及化學(xué)特征)出現(xiàn)強(qiáng)烈變化，進(jìn)而影響土壤微生物群落的數(shù)量及結(jié)構(gòu)[18-20]。對(duì)圍欄禁牧、連續(xù)放牧和休牧(早期休牧、中期休牧、晚期休牧)3種草地利用方式下土壤的理化性質(zhì)指標(biāo)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)禁牧處理下土壤總PLFA量最高，可見(jiàn)禁牧有助于土壤肥力的恢復(fù)，斯貴才等[21]也曾指出圍封利于土壤微生物生長(zhǎng)繁衍。在放牧形式下，隨著休牧?xí)r間推后，各類(lèi)群PLFA含量總和呈增高趨勢(shì)，這可能與植物體生長(zhǎng)發(fā)育程度有關(guān)，當(dāng)植物進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育的成熟階段，對(duì)土壤養(yǎng)分的需求更大，并促進(jìn)土壤中微生物的活動(dòng)，使土壤微生物PLFA含量升高；從微生物類(lèi)群比值角度看，革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌對(duì)養(yǎng)分的吸收能力強(qiáng)，更能適應(yīng)不良的環(huán)境條件[22]，二者比值可反映土壤底物即有機(jī)質(zhì)供應(yīng)水平，底物養(yǎng)分有機(jī)氮與其比值(G+/G-)呈負(fù)向關(guān)系，即前者越多，比值便越小，進(jìn)而對(duì)微生物的營(yíng)養(yǎng)脅迫越高[23]；表3結(jié)果顯示連續(xù)放牧(CG)下G+/G-最高，說(shuō)明連續(xù)放牧下草地土壤底物供給碳、氮等養(yǎng)分的能力最低，造成了微生物的營(yíng)養(yǎng)脅迫。當(dāng)草地連續(xù)放牧利用時(shí)，地上、地下生物量均降低，凋落物量減少，養(yǎng)分循環(huán)減緩[24]。而中期休牧處理下的G+/G-最低，可見(jiàn)生長(zhǎng)季中期休牧使微生物得到很好的營(yíng)養(yǎng)供給，有助于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)運(yùn)行。此外細(xì)菌/真菌比值可表征兩個(gè)微生物類(lèi)群的相對(duì)豐度及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，比值越低說(shuō)明生態(tài)系統(tǒng)的緩沖性和抗干擾能力越強(qiáng)[23]，表3結(jié)果顯示各草地利用方式下細(xì)菌/真菌均無(wú)顯著性差異，表明不同草地利用方式對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的緩沖性能和抗干擾能力無(wú)明顯影響。但這僅為單一特征的指向，不足以說(shuō)明生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜的功能特性，因此關(guān)于生態(tài)系統(tǒng)的抵抗性和緩沖性對(duì)草地利用方式的響應(yīng)機(jī)制還需更多的指標(biāo)進(jìn)行全面的研究。

土壤微生物群落的數(shù)量和組成等特征可快速的反映土壤質(zhì)量情況[25-26]，土壤理化性質(zhì)的改變便成為了致使微生物代謝特征發(fā)生變化的關(guān)鍵原因[27]。草地利用方式的不同，土壤物理性狀及養(yǎng)分含量會(huì)出現(xiàn)較大的差異[28]，進(jìn)一步土壤微生物結(jié)構(gòu)功能受到顯著影響[29]。根據(jù)對(duì)土壤理化性質(zhì)指標(biāo)及土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行約束排序，權(quán)衡模型的可靠性，僅篩選出土壤電導(dǎo)率、pH值、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮4種土壤環(huán)境因子來(lái)分析與微生物間的相互關(guān)系，可見(jiàn)土壤環(huán)境因子雖眾多，但不一定均可直接作用于微生物。冗余分析(RDA)結(jié)果顯示總磷酸脂肪酸及各微生物類(lèi)群均與土壤電導(dǎo)率和銨態(tài)氮呈極強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，卻與pH值呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤電導(dǎo)率的升高可在一定程度上加強(qiáng)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，改變其存在狀態(tài)及有效性，且土壤底物氮的數(shù)量對(duì)于微生物數(shù)量及功能存在直接的影響。偏堿性土壤會(huì)為微生物各類(lèi)群提供更利的生存環(huán)境，這與馬大龍等[30]在大興安嶺多年凍土區(qū)及韓世忠等[31]在中亞熱帶地區(qū)米櫧天然林對(duì)土壤微生物進(jìn)行的研究結(jié)果相悖，可見(jiàn)氣候因子中的氣溫及降水等對(duì)此過(guò)程產(chǎn)生的復(fù)雜調(diào)控是不可忽視的。土壤pH值、電導(dǎo)率不僅對(duì)微生物群落數(shù)量、組成及結(jié)構(gòu)存在一定的影響作用，還積極調(diào)控著微生物功能走向，由此推斷土壤鹽堿度與pH值可作為呼倫貝爾地區(qū)草原區(qū)域微生物的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)草地利用方式的響應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)休牧處理下土壤微生物數(shù)量高于其他的草地利用方式，且休牧期推后更利于土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖；此外生長(zhǎng)季中期休牧?xí)岣咄寥赖孜锕┙o微生物養(yǎng)分的能力；冗余分析顯示電導(dǎo)率高且偏堿性土壤會(huì)為微生物提供更有利的生存環(huán)境。因此，將土壤鹽堿度和pH值作為呼倫貝爾草原區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)。