UFLC法同時測定梔子厚樸湯中2個黃酮類成分的含量

桑 野，王開鼎，李海鵬，馮 波，關(guān) 皎，朱鶴云 (吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

梔子厚樸湯出自《傷寒論》，由梔子、厚樸、枳實三味藥材組成，具有清熱除煩、寬中消滿的功效[1]。梔子厚樸湯中的化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等，具有抗抑郁、抗炎、抗焦慮、增加冠狀動脈血流量、保肝利膽等多種生物活性，臨床用于抑郁癥、焦慮癥、失眠癥、傳染性肝炎、膽囊炎等疾病的預(yù)防與治療[2]。其中，柚皮苷和新橙皮苷是梔子厚樸湯組成藥材枳實中含有的2個代表性黃酮類成分。藥理學(xué)研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗骨質(zhì)疏松等作用[3-4]，新橙皮苷具有抗抑郁、降低血糖和血脂等作用[5-6]。近年來，超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)技術(shù)，相比于常規(guī)的高效液相色譜分析技術(shù)，具有分離度好、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究[7-8]。本研究采用UFLC技術(shù)同時測定梔子厚樸湯中的柚皮苷和新橙皮苷的含量，為梔子厚樸湯的質(zhì)量控制和新藥開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

超快速液相色譜儀(Prominence)：日本島津公司；冷凍干燥機(Scientz-12SN)：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式高速冷凍離心機(TG16KR)：長沙東旺實驗儀器有限公司；快速混勻器(XK96-A)：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；數(shù)控聲波清洗器(KQ-250DE)：昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)字控溫電熱套(98-1-C)：天津泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-3HB)：瑞士布琪公司；電子天平(CPA 225D)：德國賽多利斯儀器有限公司。

HPLC級乙腈：美國Fisher科技；HPLC級甲醇：美國Fisher科技；HPLC級甲酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；屈臣氏純凈水：屈臣氏集團有限公司；柚皮苷對照品(純度>98%，批號：110722-201815)：中國食品藥品檢定研究院；新橙皮苷對照品(純度>98%，批號：111857-201804)：中國食品藥品檢定研究院。

梔子(產(chǎn)地：江西)、厚樸(產(chǎn)地：四川)和枳實(產(chǎn)地：湖南)藥材購自吉林市吉林大藥房。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備方法及提取條件的選擇

2.1.1 對照品溶液的制備

取柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.3 g/L和0.1 g/L的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化與確定

首先對梔子厚樸湯凍干粉末的處理方法進行了考察，分別采用50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇考察凍干粉樣品中2個黃酮類成分的提取率，結(jié)果100%甲醇提取效果最佳。其次，考察了不同超聲時間對提取效果的影響。實驗中對比了超聲提取20、30、40 min的提取效果，結(jié)果表明，超聲提取30 min提取效果最佳。最終確定供試品溶液的制備方法如下：

稱取梔子(9 g)、厚樸(12 g)和枳實(9 g)，剪碎后加入到圓底燒瓶中，加水300 mL，室溫浸泡30 min，回流提取1 h，待溶液冷卻后，采用5層紗布過濾，得到濾液；向圓底燒瓶中再加入300 mL水，重復(fù)上述提取過程，獲得濾液。合并兩次獲得的濾液，濃縮至50 mL，將濃縮液冷凍干燥24 h，制備梔子厚樸湯凍干粉，干燥器中保存?zhèn)溆?。精密稱取全方凍干粉末樣品0.1 g(相當(dāng)于生藥質(zhì)量0.4 g)，放在50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲處理30 min，離心(13 000 r/min)10 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過濾。取續(xù)濾液0.5 mL，用甲醇定容至25 mL，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備

稱取梔子、厚樸藥材，按“2.1.2”項下的方法處理，即得不含枳實的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化與確定

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗考察了2種不同的流動相體系(甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水)，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，各成分色譜峰峰形和分離度好，并能夠縮短分析時間，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水為最終流動相。此外，考察了3種不同型號的色譜柱(Shimadzu Shim-pack GIST柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；Shimadzu Shim-pack GIST柱，2.1 mm×100 mm，2 μm；Shim-Pack XR-ODS柱，75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，結(jié)果表明，Shim-Pack XR-ODS色譜柱的分離效果最佳。

2.2.2 色譜條件的確定

色譜柱采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm，SHIMADZU)；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫(0～10 min，20%B～30%B)，平衡時間為5 min，流速為0.4 mL/min，柱溫設(shè)置為30 ℃，進樣量為5 μL，檢測波長為265 nm。所得色譜圖如圖1所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，用甲醇配成系列混合對照品溶液(柚皮苷質(zhì)量濃度分別為3、6、15、30、60、150 mg/L；新橙皮苷質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20和50 mg/L)，進樣分析，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品的濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，柚皮苷和新橙皮苷的線性回歸方程分別為：

Y=7.659×103X-1.729×104，r=0.999 3

Y=1.617×104X-1.252×104，r=0.999 7

2.4 精密度實驗

取混合對照品溶液(柚皮苷質(zhì)量濃度：30 mg/L；新橙皮苷質(zhì)量濃度：10 mg/L)5 μL，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，柚皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.58%和0.47%，即儀器的精密度符合要求。

1.柚皮苷；2.新橙皮

2.5 穩(wěn)定性實驗

取同一份梔子厚樸湯凍干粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別于樣品放置0、2、4、8、12、24 h后進行分析，柚皮苷與新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.34%和0.53%，即樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實驗

取同一批梔子厚樸湯凍干粉樣品6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，柚皮苷和新橙皮苷的含量平均值(n=6)分別為10.98%和3.01%，RSD分別為2.4%和2.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率實驗

取梔子厚樸湯凍干粉樣品粉末9份，每份0.1 g，加入相當(dāng)于樣品中柚皮苷和新橙皮苷含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份，按“2.1.2”項下的方法制備供試溶液，按“2.2”項下色譜條件測定。柚皮苷和新橙皮苷的平均回收率分別為98.9%和99.1%，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

精密稱定6批次梔子厚樸湯凍干粉末樣品，依次編號為2019001～2019006。制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算柚皮苷和新橙皮苷的含量(外標(biāo)法)。6批樣品測定結(jié)果見表2。

表 1 梔子厚樸湯凍干粉樣品中柚皮苷、新橙皮苷回收率

表 2 凍干粉樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量(%)

3 討 論

通過對6個批次的梔子厚樸湯中柚皮苷和新橙皮苷的含量進行測定，結(jié)果表明：柚皮苷的含量不低于10.45%，新橙皮苷的含量不低于2.95%。由此可見，柚皮苷的含量要顯著高于新橙皮苷。本研究建立了同時快速測定梔子厚樸湯中2個黃酮類成分(柚皮苷、新橙皮苷)含量的UFLC方法。該方法具有簡單、快速的優(yōu)點。查閱相關(guān)文獻，沈震亞[9]建立了HPLC法同時測定了胃痛丸中柚皮苷和新橙皮苷的含量，分析時長為35 min，本研究所建立的UFLC分析方法能夠在7 min內(nèi)實現(xiàn)柚皮苷和新橙皮苷的快速分離與測定，大大縮短了分析時間，提高了分析效率，將有助于梔子厚樸湯的后續(xù)質(zhì)量控制研究。

本研究選取梔子厚樸湯中的柚皮苷和新橙皮苷作為測定指標(biāo)也有助于梔子厚樸湯的臨床應(yīng)用規(guī)范化和相關(guān)劑型的開發(fā)。隨著現(xiàn)代儀器技術(shù)的不斷提高和發(fā)展，未來UFLC技術(shù)將更多地應(yīng)用到中藥的現(xiàn)代化分析與檢測中，將極大地推進中藥的國際化和現(xiàn)代化發(fā)展。