祛寒逐風顆粒對骨性關節(jié)炎大鼠炎癥反應的影響

馬曉程 趙亞君 毛世剛△

祛寒逐風顆粒主要由黑順片、制川烏、秦艽、威靈仙、細辛、花椒、麩炒白術、澤瀉、制龜甲、制鱉甲和川芎組成，具有溫經活絡、除濕消腫、活血止痛和益腎強筋之效[1]。最早是由武威漢代醫(yī)簡“傷寒逐風方”結合基礎臨床應用加減形成的藥方，臨床主要用來治療風濕性關節(jié)炎、骨性關節(jié)炎、強直性脊椎炎、肩周炎等風寒痹癥[2]。但是祛寒逐風顆粒對膝骨性關節(jié)炎的作用機制依然不太清晰，因此，本研究探討祛寒逐風顆粒對膝骨性關節(jié)炎(KOA)大鼠炎癥反應和NF-κB介導NLRP3炎性小體活化的作用，為臨床使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級別SD大鼠48只，雌性，體質量200～250 g，購買于山東大學動物實驗中心(許可證號為SCXK(魯)2019-0001)，隨機分為假手術組、模型組、祛寒逐風顆粒3 g/kg(低劑量組)、祛寒逐風顆粒6 g/kg(中劑量組)、祛寒逐風顆粒9 g/kg(高劑量組)、陽性對照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，各8只。

1.2 主要試劑

雙氯芬酸鈉腸溶片(北京諾華制藥有限公司，國藥準字H11021640)，IL-1β(貨號1910122)、TNF-α(貨號1917202)和IL-6(貨號1910602)大鼠ELISA試劑盒(達科為，北京)，p-p65(3033號)、p65(8242號)、p-IκBα(8219號)、NLRP3(15101號)、Caspase-1 p20(4199號)、IL-1β p17(12703號)抗體均購自CST(美國)。

1.3 KOA模型建立

如前所述，采用前交叉韌帶橫斷(ACLT)外科手術建立大鼠模型[3]。異氟烷-氧氣麻醉大鼠，固定于實驗操作臺，用電動剪刀將左后肢的前部刮毛并用乙醇清洗。沿膝蓋骨內側邊界垂直切開膝蓋骨周圍的皮膚。將膝蓋骨橫向移位，露出前交叉韌帶。隨后，用手術剪刀將前交叉韌帶切開，不損傷脛骨軟骨。然后將膝蓋骨放回原處，并用縫合線閉合筋膜和皮膚。手術后肌肉注射4 d氨芐青霉素(4 × 104U/d)，假手術組在沒有其他任何處理的情況下縫合傷口。

1.4 藥物干預處理

根據體表面積法將人體劑量折算為大鼠劑量，同時根據之前文獻描述給藥[4]，祛寒逐風顆粒3 g/kg(低劑量組)、祛寒逐風顆粒6 g/kg(中劑量組)、祛寒逐風顆粒9 g/kg(高劑量組)灌胃給予相對應的藥物劑量，陽性藥組給予雙氯芬酸鈉腸溶片4 mg/kg，假手術組和模型組均給予等體積生理鹽水。

1.5 機械性痛閾值測量

機械止痛儀(BME-404，天津)評估后爪縮回的機械性異常性疼痛，簡要如下：將大鼠放在金屬網地板的籠子里，通過不銹鋼絲(直徑0.6 mm)線性增加施加力，以機械刺激后爪，施加50 g質量的臨界值以防止組織損傷，重復3次，取平均值。

1.6 膝關節(jié)直徑測量

游標卡尺用于評估大鼠膝關節(jié)直徑，簡要如下：將大鼠固定，使用游標卡尺測量大鼠的膝關節(jié)直徑，連續(xù)測量3次，取平均值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測

大鼠腹主動脈取血，收集于1.5 mL EP管，室溫靜置30 min，然后于1 000g離心5 min，收集上清，根據制造商說明檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量。

1.8 實時PCR檢測

稱取10 mg關節(jié)軟骨，根據制造商的說明用總RNA提取試劑(Vazyme，中國)提取組織RNA。使用Gene Quant Prospectrophotometer(Amersham Biosciences，美國)的分光光度法測量RNA的濃度。通過HiScriptTMQ-RT Super Mix(Fcmacs，中國)將RNA(1 μg)反轉錄為cDNA。qRT-PCR由SYBRs Green Master Mix (Fcmacs，中國)在iCycleriQTM5多色實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)進行，引物序列見表1。

表1 實時PCR引物序列

1.9 病理學檢查

采用蘇木精-伊紅(HE)染色和阿爾新藍染色檢測軟骨損傷。將大鼠離體的膝蓋關節(jié)在含福爾馬林的磷酸鹽緩沖液中固定7 d，然后在10%EDTA脫鈣液中脫鈣1周，用自動組織處理裝置將組織脫水，染色，顯微鏡拍照觀察。

1.10蛋白免疫印跡法

稱取10 mg關節(jié)軟骨，采用蛋白提取分離試劑盒提取組織總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。使用SDS PAGE凝膠分離蛋白質(上樣量20 μg)，并轉移至硝酸纖維素(PVDF)膜。在室溫下，將膜密封在5%脫脂牛奶中2 h，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：p-p65、p65、p-IκBα、NLRP3、Caspase-1 p20、IL-1β p17和β-actin(稀釋比例1∶1 000)。第2天，將硝酸纖維素膜洗滌3次，并與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶200 000)室溫孵育2 h，使用增強型化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，β-actin作為蛋白內參，通過ImageJ Software 7.0進行光密度分析。

1.11統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠機械性痛閾值和腫脹的影響

與假手術組比較，模型組大鼠的機械性痛閾值明顯減小，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠的機械性痛閾值較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(見圖1a)。與假手術組比較，模型組大鼠的膝關節(jié)直徑明顯增加，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠的膝關節(jié)直徑明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義(見圖1b)。

圖1 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠機械性痛閾值和膝關節(jié)直徑的影響

2.2 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠血清中炎癥因子的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著增加，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2(a，b)。

圖2 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠血清中炎癥因子的影響

2.3 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠組織中炎癥因子的影響

與假手術組比較，模型組大鼠組織中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平顯著上調，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠組織中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平顯著下調(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3(a，b)。

圖3 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠組織中炎癥因子的影響

2.4 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠病理學變化的影響

病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)假手術組大鼠膝關節(jié)軟骨組織正常，模型組大鼠膝關節(jié)出現(xiàn)嚴重變性，并伴有嚴重的軟骨損傷和大規(guī)模的軟骨纖維化，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠的軟骨損傷和軟骨纖維化緩解，見圖4。

圖4 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠病理學變化的影響(黃色三角形表示基質損傷；紅色三角形表示軟骨變性)

2.5 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠軟骨組織中NLRP3炎性小體活化的影響

與假手術組比較，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-1 p20、IL-1β p17和NLRP3含量顯著增加，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中Caspase-1 p20、IL-1β p17和NLRP3含量顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖5 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠軟骨組織中NLRP3炎性小體活化的影響

2.6 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠滑膜組織中NF-κB信號活化的影響

與假手術組比較，模型組大鼠軟骨組織中p-p65和p-IκBα含量顯著增加，祛寒逐風顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中p-p65和p-IκBα含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖6。

圖6 祛寒逐風顆粒對KOA大鼠軟骨組織中NF-κB信號活化的影響

3 討論

骨關節(jié)炎屬中醫(yī)學“骨痹”“筋痹”范疇，發(fā)病與腎虛關系密切，本病病機為本虛標實，肝腎虧虛為其本，風寒濕痹阻經脈為其標，加之本病遷延難愈，日久成瘀，故中醫(yī)臨床多從補益肝腎、祛風除濕、散寒止痛、活血化瘀等方面治療[5]。祛寒逐風顆粒以黑順片、制川烏、秦艽、威靈仙、細辛、花椒、麩炒白術、澤瀉、制龜甲、制鱉甲和川芎為處方，主要以黑順片和制川烏為君藥，兩藥同用，通十二經，走里達表，黑順片具有逐風寒濕邪之功效，制川烏祛風除濕，溫經止痛，秦艽祛風濕，退虛熱，舒筋止疼，威靈仙祛風除濕，通絡止痛，細辛和花椒祛風散寒，麩炒白術和澤瀉具有除濕之功效，再加具有補腎和化瘀之效的制龜甲、制鱉甲和川芎，故祛寒逐風顆粒具有溫經活絡、除濕消腫、活血止痛和益腎強筋之效[6]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風顆粒對骨關節(jié)炎具有治療作用，并且能夠抑制KOA大鼠的炎癥反應和NF-κB介導的NLRP3炎性小體活化。

炎癥反應和軟骨損傷是骨關節(jié)炎的典型病理特征，盡管KOA病因尚不清楚，但炎癥與骨關節(jié)炎病理發(fā)展密切相關[7-9]。關節(jié)發(fā)炎可直接導致KOA疼痛發(fā)作，加劇軟骨損傷，并可能導致持續(xù)的疼痛敏感性，最終演變?yōu)槁蕴弁碵10]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風顆粒能夠緩解KOA大鼠的膝關節(jié)腫脹和疼痛，并且抑制炎癥因子的釋放。中藥黑順片具有抗炎活性，制川烏對小鼠慢性炎癥性疼痛具有緩解作用，秦艽對多種動物炎癥模型均表現(xiàn)良好的抗炎活性。除此之外，秦艽的主要活性成分龍膽苦苷對早期炎癥反應具有緩解作用，同時還具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝及抗腫瘤等多種活性，威靈仙所含活性成分齊墩果酸具有抗炎活性，綜合考慮，祛寒逐風顆粒處方具有普遍的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，最后對骨關節(jié)炎起到治療作用[11-13]。

研究人員發(fā)現(xiàn)在KOA的早期階段，靶向炎癥反應可以延遲或預防膝關節(jié)軟骨損傷和骨贅形成[14]?；そM織中的滑膜成纖維細胞是滑膜炎的效應細胞，并且是人體組織和器官中的特定駐留細胞，主要功能是在傷口愈合期間維持細胞外基質(ECM)并促進恢復和健康[15]。IL-1β是與KOA發(fā)病有關的關鍵炎癥因子。關于IL-1β的抗炎研究非常廣泛，可以獨立誘導與多種信號傳導機制相關的炎癥反應和分解代謝作用，同時IL-1β與KOA疼痛高度相關[16]。例如，IL-1β阻止軟骨細胞合成ECM，并干擾Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成。IL-1β通過自分泌途徑直接影響關節(jié)的滑膜細胞和軟骨細胞，并增加一系列細胞因子和酶(例如PGE2和IL-6)的產生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風顆粒能夠抑制KOA大鼠炎癥反應，降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，病理學發(fā)現(xiàn)祛寒逐風顆粒能夠緩解大鼠膝關節(jié)軟骨損傷和纖維化。

近年NLRP3炎性小體在炎癥中的作用引起了人們的關注，并且對自身免疫性疾病、神經退行性疾病、代謝性疾病進行了大量研究[17]。研究證實NLRP3介導的慢性無菌性炎癥研究正變得越來越普遍，并且KOA中也發(fā)現(xiàn)了NLRP3活化[18]。NLRP3炎性小體與KOA的發(fā)病機理密切相關，NLRP3炎性小體對于IL-1β的調節(jié)和釋放起著至關重要的作用，并涉及KOA的軟骨破壞和炎癥反應[19]。NLRP3激活的兩個信號模型調控，包括第一步轉錄水平的激活信號和第二步裝配的激活信號[20]。最終，NLRP3，ASC和Caspase-1結合形成炎性小體，pro-Caspase-1轉換為Caspase-1 p20，后者將pro-IL-1β轉換為成熟的活性形式(IL-1β)。在關節(jié)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Caspase-1是骨關節(jié)炎和軟骨加速破壞的危險因素之一[21]。核因子-κB(NF-κB)信號是體內重要的NLRP3炎性小體激活的調節(jié)通路，細胞正常情況下，NF-κB和抑制蛋白IκBα在細胞質中以無活性復合物的形式存在，外源性刺激、活性氧的積累或有毒代謝產物可促進IκBα磷酸化和泛素化，從而導致NF-κB磷酸化并轉運至細胞核[22]。NF-κB途徑的激活可能觸發(fā)NLRP3的表達和NLRP3炎性小體的組裝[23]。同時，NF-κB信號活化也能夠調節(jié)促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，參與KOA的病理形成和發(fā)展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風顆粒能夠抑制KOA大鼠軟骨組織中NF-κB信號通路活化，同時也能夠抑制NLRP3炎性小體活化。

綜上所述，本研究發(fā)祛寒逐風顆?？赡芡ㄟ^抑制NF-κB介導的NLRP3炎性小體活化顯著改善KOA大鼠的炎癥反應并緩解疼痛，對骨關節(jié)炎發(fā)揮治療作用。但是祛寒逐風顆粒含有多種中藥材，其成分復雜以及靶點較多，仍需進一步探索。