胃癌組織中miR-107、AXIN2的表達及與預后的相關性

張肖麗，張月曉，李 萍，李炳慶，陳 健

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。其治療首選手術切除，部分患者預后差，易復發(fā)轉移，病死率高[1]，因此，研究胃癌發(fā)生、發(fā)展機制及與預后的相關因素，具有重要意義。微小RNA-107(microRNA-107, miR-107)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。鄒德勝等[2]的研究結果表明，miR-107在結直腸癌患者血清中的表達水平升高，且與結直腸癌的TNM分期相關。趙軻等[3]的研究結果表明，非小細胞肺癌組織中miR-107呈高表達，且與病理分化、腫瘤大小、淋巴結轉移以及TNM分期呈正相關。軸抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, AXIN2)是Wnt/β-catenin信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡以及腫瘤的發(fā)生等生物學功能[4]。AXIN2在乳腺癌等多種腫瘤中均有表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[5]。目前，關于miR-107與AXIN2同時在胃癌中的研究報道不多。本文采用免疫組化SP法檢測miR-107和AXIN2在胃癌組織中的表達，探討miR-107和AXIN2表達與胃癌患預后的關系，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年5月在我院就診并行手術治療的65例胃癌患者的組織標本，同時取相應癌旁正常胃黏膜組織標本(距癌灶邊緣至少5 cm)作為對照。所有入組病例經(jīng)病理學診斷，并排除其他系統(tǒng)的惡性腫瘤，術前均未行任何抗腫瘤治療，每份標本的臨床和病理資料均完整。65例患者：TNM分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期26例；高分化12例，中分化28例，低分化25例；有淋巴結轉移者31例，無淋巴結轉移者34例；侵及漿膜27例，未侵及漿膜38例。術后對所有患者進行電話或門診隨訪，隨訪日期截至2020年5月。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購自大連TAKARA公司。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin序列設計引物，由上海生物工程公司合成。AXIN2兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司，SP、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1樣品采集及保存 胃癌及正常胃黏膜組織標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。

1.3.2qRT-PCR法檢測胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達 取收集的組織標本100 mg，研缽研碎后加TRIzol液，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用qRT-PCR法檢測miR-107的表達。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin，引物序列見表1。PCR反應條件：95 ℃，75 s；95 ℃，15 s；60 ℃，35 s；95 ℃，15 s；合計38個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔。反應結束后，miR-107和AXIN2 mRNA表達水平采用2-△△CT分析法進行計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用SP法，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。石蠟切片二甲苯脫蠟，加熱誘導抗原修復，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉后，加入AXIN2兔抗人多克隆抗體(稀釋比1 ∶100)，于4 ℃過夜，DAB顯色后蘇木精復染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.3.4結果判斷 顯微鏡下觀察，每例標本隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算每個視野陽性細胞所占百分比。按陽性細胞數(shù)評分：<10%為0分，11%～30%為1分，31%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按細胞染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為2分。將兩項評分結果相乘：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性()，6分以上為強陽性()。將(+～)視為陽性。

2 結果

2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中miR-107與AXIN2 mRNA的表達本組實驗結果顯示，miR-107在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常胃黏膜組織，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，AXIN2 mRNA在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁正常胃黏膜組織，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達水平

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達本組實驗結果顯示，AXIN2蛋白表達定位于細胞質(zhì)或細胞膜(圖1)，胃癌組織中AXIN2蛋白陽性率顯著低于癌旁正常胃黏膜組織(P<0.05，表3)。

圖1 A.AXIN2蛋白在胃癌組織中呈陰性，SP法；B.AXIN2蛋白在癌旁正常胃黏膜組織中呈陽性，SP法

表3 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達

2.3 胃癌中miR-107和AXIN2表達與臨床病理特征的關系本組以胃癌組織中miR-107表達的平均數(shù)，將胃癌患者分為高表達組(≥1.65)和低表達組(<1.65)，以AXIN2蛋白免疫組化染色結果，將胃癌患者分為AXIN2高表達組(染色結果為陽性)和AXIN2低表達組(染色結果為陰性)。結果發(fā)現(xiàn)miR-107、AXIN2表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期及浸潤深度有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小和病變部位無關(P>0.05，表4)。

表4 胃癌中miR-107和AXIN2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 miR-107和AXIN2表達與胃癌患者預后的關系隨訪截至2020年5月31日，術后隨訪6～36個月，無失訪病例，隨訪期間死于胃腺癌者24例，Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-107高表達者總生存率為24.07%，低表達者總生存率為64.48%，miR-107高表達組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達組患者(χ2=8.486，P<0.05，圖2A)。AXIN2高表達者總生存率為64.39%，低表達者總生存率為28.73%，AXIN2高表達組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達組患者(χ2=5.729，P<0.05，圖2B)。

圖2 Kaplan-Meier生存分析：A.miR-107表達與患者預后的關系；B.AXIN2表達與患者預后的關系

2.5 胃癌患者預后影響因素分析Cox單因素分析結果顯示，低分化、淋巴結轉移、TNM分期、miR-107高表達、AXIN2低表達是影響胃癌患者不良預后的危險因素(P<0.05)。性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度與胃癌患者預后無關(P>0.05)；多因素分析結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、miR-107高表達、AXIN2低表達是影響胃癌患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05，表5)。

2.6 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達的相關性胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.607，P<0.001，圖3)。

圖3 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達的相關性

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，隨著醫(yī)療水平的提高，胃癌的診治水平有不同程度地提高，但部分患者的預后情況和生活質(zhì)量卻未得到有效改善，因此早期預判胃癌患者的預后，尋找胃癌有效的生物學靶點具有重要意義[6-7]。

miR-107在細胞的生長、分化、增殖、發(fā)育、凋亡和代謝等多種過程中發(fā)揮重要作用，其表達失衡與胃癌的發(fā)生密切相關，可作為疾病診斷的分子標志物[8-9]。余南榮等[10]的研究結果表明，miR-107在胃癌細胞中的表達上調(diào)，可通過靶向Notch2促進MMP-9的表達，促進胃癌細胞的遷移和侵襲。于志紅等[11]的研究結果表明，miR-107在胃癌組織中高表達，miR-107可通過負向調(diào)控PCDH17促進上皮-間質(zhì)轉化，進而增強胃癌細胞的遷移及侵襲能力。本實驗結果顯示，在胃癌組織中miR-107表達水平高于癌旁正常胃黏膜組織，其表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期及浸潤深度有關，提示miR-107在胃癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、侵襲的作用，進一步分析結果顯示，miR-107高表達組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達組患者，提示miR-107高表達可能增強胃癌細胞遷移及侵襲能力，調(diào)控腫瘤發(fā)展進而影響患者預后情況。

AXIN2作為一種信號調(diào)控因子，與多種腫瘤，如肝癌、結腸癌、肺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關[12]。張濤等[13]的研究結果表明，胰腺癌細胞株中AXIN2的表達與正常胰腺細胞相比表達下調(diào)，在侵襲能力越高的癌細胞株中表達越低，提示起抑癌基因作用。本實驗結果顯示，胃癌組織中AXIN2蛋白陽性率顯著低于正常胃黏膜組織，進一步分析結果顯示，低分化胃癌組織中AXIN2表達水平顯著低于中+高分化者，有淋巴結轉移者的AXIN2表達水平顯著低于無淋巴結轉移者，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者的AXIN2表達水平顯著低于Ⅰ+Ⅱ期者，侵及漿膜者的AXIN2表達水平顯著低于未侵及漿膜者，提示AXIN2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關。生存分析顯示，AXIN2高表達組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達組患者，提示AXIN2表達缺失的患者腫瘤分化差、預后差，易發(fā)生浸潤和轉移，AXIN2可能通過調(diào)控腫瘤發(fā)展影響患者預后。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結轉移、TNM分期、miR-107高表達、AXIN2陰性是影響胃癌患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-107、AXIN2可能作為評估胃癌患者不良預后的生物標志物。然而兩者在胃癌中的表達關系及具體作用機制尚不清楚，Zhang等[14]研究結果表明，miR-107在肝癌組織和細胞系中顯著上調(diào)，AXIN2的表達受miR-107負調(diào)控，miR-107可以通過靶向AXIN2促進肝癌細胞增殖。本實驗結果顯示，胃癌組織中miR-107與AXIN2表達水平呈負相關，因此本實驗推測miR-107可能靶向作用于AXIN2促進胃癌細胞增殖，共同參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織中miR-107高表達，AXIN2低表達，且與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、浸潤深度和患者預后有關，可能作為胃癌患者預后評估的分子標志物。但兩者在胃癌中的具體作用機制仍需擴大樣本量深入探討。