經典型甲狀腺乳頭狀癌中CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1的表達及臨床意義

秦燕子，吳晨辰，蔡兆根，馮振中，柴大敏，馬 莉

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，大部分患者預后良好，10年生存率可達80%～90%，病死率較低[1]，但其易較早出現轉移和復發(fā)，因此需盡早治療。經典型是最常見的PTC類型，具有特征性的乳頭狀結構和典型的PTC核特征，即核內假包涵體、核溝、毛玻璃樣和砂粒體等[2]。殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase 3-like 1, CHI3L1)又稱人軟骨糖蛋白39(YKL-40)，屬于糖苷水解酶18基因家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白[3]。CHI3L1在人體多種細胞中均有表達，具有參與炎癥、介導巨噬細胞浸潤、分化和成熟以及促進血管形成等作用[4]。研究表明CHI3L1與腫瘤的發(fā)生密切相關，在胃癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]等多種腫瘤中均高表達，且提示患者預后不良。目前有關CHI3L1促進腫瘤形成的機制尚未明了。本實驗采用免疫組化法檢測CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1在經典型PTC中的表達，探討三者在經典型PTC發(fā)生中的可能作用機制，旨在為經典型PTC診斷、治療及評估預后提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1～12月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的具有完整臨床和病理資料的經典型PTC標本114例，隨機抽取癌旁正常組織60例及結節(jié)性甲狀腺腫組織60例。114例經典型PTC中，男性23例，女性91例；≤45歲者52例，>45歲者62例；腫瘤直徑：直徑≤2 cm者65例，>2 cm且≤4 cm者27例，>4 cm者22例；腫瘤發(fā)生數：71例單發(fā)，43例多發(fā)；57例有淋巴結轉移，57例無淋巴結轉移；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期100例，Ⅲ+Ⅳ期14例。所有患者均于確診前未行放、化療等任何治療。病理診斷由兩名經驗豐富的病理醫(yī)師共同閱片。

1.2 免疫組化所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，抗原修復，滴加一抗(CHI3L1或β-catenin或Cyclin D1)，滴加二抗，DAB顯色3～5 min，蘇木精復染，中性樹膠封固。陰性對照以PBS代替一抗。以上實驗方法按照EliVision plus法進行。兔多克隆抗體CHI3L1購自美國Abcam公司(ab77528，稀釋比1 ∶1 000)，即用型單克隆抗體β-catenin(MX043)及單克隆抗體Cyclin D1(SP4)、EliVision plus試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 結果判定CHI3L1陽性主要定位于細胞質，即在細胞質內出現棕黃色或褐色顆粒。Cyclin D1陽性為細胞核內出現棕黃色或褐色顆粒。CHI3L1、Cyclin D1免疫組化結果判定均采用半定量積分法，包括染色強度和染色范圍兩部分。按陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項得分結果相乘：>3分為陽性，≤3分為陰性。β-catenin結果判定參考Maruyama等[8]的標準。β-catenin正常表達為細胞膜陽性率>70%，其異常表達包括兩種情況：表達減弱或缺失為細胞膜陽性率<70%，異位表達為細胞質和(或)細胞核陽性率>10%。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。χ2檢驗分析CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1與臨床病理特征的關系，Spearman相關分析檢測CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1蛋白表達水平的相關性，采用Kaplan-Meier法進行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中CHI3L1的表達正常甲狀腺組織中CHI3L1的陽性率為33.3%(20/60)，結節(jié)性甲狀腺腫組織中CHI3L1陽性率為38.3%(23/60)，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經典型PTC組織中CHI3L1陽性率(61.1%，70/114)高于正常甲狀腺和結節(jié)性甲狀腺腫組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1A～C)。在經典型PTC組織中，CHI3L1表達與瘤體大小、瘤體數目、有無淋巴結轉移、臨床pTNM分期密切相關(P<0.05，表1)。腫瘤瘤體越大、發(fā)生數目越多、發(fā)生淋巴結轉移或pTNM分期越晚者CHI3L1陽性率越高。

2.2 經典型PTC組織中β-catenin的異位表達在經典型PTC組織中β-catenin異位陽性率(50.9%，58/114)高于正常甲狀腺組織(9.1%，5/60)和結節(jié)性甲狀腺腫組織(10.0%，6/60)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1D～F)。腫瘤數目越多，β-catenin的異位陽性率越高(P<0.05)；有淋巴結轉移組β-catenin異位陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；腫瘤分期越高，β-catenin異位陽性率越高(P<0.05)。β-catenin表達與患者年齡、性別、瘤體大小無相關性(表1)。

2.3 不同甲狀腺組織中Cyclin D1的表達Cyclin D1在經典型PTC、結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的陽性率分別為58.8%(67/114)、16.7%(10/60)、13.3%(8/60)。經典型PTC中Cyclin D1陽性率高于結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1G～I)。腫瘤數目越多、有淋巴結轉移、pTNM分期越晚，Cyclin D1蛋白陽性率越高；Cyclin D1蛋白表達與患者年齡、性別、瘤體大小無相關性(表1)。

圖1 A～C.CHI3L1依次在PTC、結節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達,EliVision plus法；D～F.β-catenin依次在PTC、結節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達，EliVision plus法；G～I.Cyclin D1依次在PTC、結節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達，EliVision plus法

2.4 經典型PTC組織中CHI3L1、β-catenin與Cyclin D1表達的相關性Spearman相關性分析結果顯示，CHI3L1表達與β-catenin、Cyclin D1表達均呈正相關(rs=0.735，rs=0.597，P均<0.05)，提示在經典型PTC中CHI3L1蛋白高表達與β-catenin蛋白異位高表達或Cyclin D1蛋白高表達可以共同促進。同時，在經典型PTC中β-catenin蛋白異位高表達與Cyclin D1蛋白高表達呈正相關(rs=0.817，P<0.05，表2)，提示兩者可互相協同、共同促進。

表2 經典型PTC中CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1表達的相關性

2.5 生存分析Kaplan-Meier生存分析顯示，經典型PTC患者的5年生存率達93.9%(107/114)，腫瘤數目(Log-rank=7.656，P=0.006)、有淋巴結轉移(Log-rank=6.611，P=0.010)，pTNM分期(Log-rank=31.975，P<0.001)、CHI3L1蛋白水平(Log-rank=4.717，P=0.030)、β-catenin蛋白異位表達(Log-rank=7.654，P=0.006)、Cyclin D1蛋白水平(Log-rank=4.976，P=0.026)與患者預后有相關性(P<0.05，圖2)，患者年齡、性別、腫瘤大小與患者預后無相關性(P>0.05)。

圖2 Kaplan-Meier法分析經典型PTC患者預后相關因素：A.CHI3L1；B.β-catenin；C.Cyclin D1；D.腫瘤單發(fā)/多發(fā)；E.淋巴結轉移；F.pTNM分期

3 討論

CHI3L1是一種幾丁質酶樣蛋白，由中性粒細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞等產生[3]。Cheng等[9]的實驗結果證實CHI3L1蛋白在良性甲狀腺腫瘤中低表達或不表達，在不同分化惡性甲狀腺腫瘤中高表達，同時，CHI3L1蛋白表達水平越高提示患者年齡越大、甲狀腺組織外浸潤和淋巴結轉移的可能性越高、pTNM分期越晚、復發(fā)風險越高，BRAF V600E突變頻率更高。本實驗結果亦證實了在經典型PTC中CHI3L1蛋白表達水平顯著上調。Luo等[10]指出在PTC中CHI3L1蛋白高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤發(fā)生侵襲密切相關。本實驗結果發(fā)現，隨著經典型PTC瘤體的增大和淋巴結發(fā)生轉移，CHI3L1蛋白表達水平越高，與文獻報道結論一致[9-10]。同時，本實驗結果發(fā)現，隨著腫瘤數目的增多，CHI3L1蛋白陽性率增高，目前尚未見相關報道。有學者指出CHI3L1在腫瘤中表達上調可能與免疫應答、細胞因子、信號通路、氧化應激或腫瘤微環(huán)境等相關[11-12]。Cheng等[9]首次通過實驗發(fā)現，通過CYR61沉默或重組CYR61治療，可以逆轉CHI3L1調節(jié)的腫瘤細胞特性的改變，提示CYR61可能參與CHI3L1介導的腫瘤進展，但具體機制仍需進一步探討。

β-catenin基因編碼β-連環(huán)蛋白，正常情況下定位于細胞膜，與鈣黏蛋白(E-cadherin)結合，共同維持細胞的完整性，參與細胞間的黏附[12-14]。本實驗發(fā)現，β-catenin在經典型PTC組織中異位高表達，且與腫瘤分期較晚及淋巴結轉移密切相關，提示β-catenin的差異表達可促使經典型PTC的發(fā)生、發(fā)展，可能因β-catenin在細胞膜的表達缺失造成腫瘤細胞間黏附性降低，腫瘤更易發(fā)生轉移，患者預后更差。在肝癌和子宮頸癌中的實驗亦證實了β-catenin蛋白異位高表達可促進癌細胞的侵襲、轉移及增殖[15-16]。Salim等[17]指出Wnt信號通路異常激活后，β-catenin無法被降解，導致其在細胞質中顯著聚集，甚至進入細胞核，從而啟動或抑制下游因子，促使腫瘤細胞發(fā)生侵襲、轉移。

Cyclin D1是細胞周期核蛋白家族成員之一，在正常情況下易被降解，在細胞內一旦聚集，易造成細胞癌變，其參與多種腫瘤的發(fā)生[18]。由于其在癌組織中表達差異顯著，目前在臨床病理診斷鑒別中得到廣泛應用，尤其在甲狀腺中聯合檢測Cyclin D1、CK19、CD56等可協助PTC的病理診斷。本實驗結果顯示，Cyclin D1在經典型PTC中高表達，其參與了腫瘤淋巴結轉移，促進腫瘤進展，與文獻報道結論一致[19-20]。

據文獻報道，β-catenin與E-cadherin之間通過某些機制相互作用，可以促進Cyclin D1的表達上調，在細胞增殖分化中起重要作用[21]。本實驗結果發(fā)現，CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達水平呈正相關，提示三者相互作用，共同促進經典型PTC的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現，CHI3L1可以誘導細胞凋亡、癌變[22]。Scully等[23]的研究發(fā)現，在乳腺癌中通過過表達CHI3L1可以增加細胞的能動性，下調E-cadherin的表達，使E-cadherin表達減弱，從而加速腫瘤的進展。結合本實驗結果，作者推測CHI3L1表達上調可能通過降低E-cadherin的表達，導致β-catenin在細胞膜中的穩(wěn)定性下降，從而出現異位表達，Wnt信號通路異常激活，作用于下游靶基因Cyclin D1，促使Cyclin D1異常高表達，導致經典型PTC的發(fā)生。

本組Kaplan-Meier生存分析顯示，經典型PTC患者5年生存率高達93.9%(107/114)，但仍有少數患者死亡，死亡患者體內CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平明顯上調，提示CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白高表達與患者預后相關。研究指出[9]CHI3L1過表達增加了甲狀腺癌復發(fā)的風險性。β-catenin在許多惡性腫瘤，如乳腺癌、子宮頸癌中表達上調，且亦與患者不良預后相關[24-27]。本實驗結果與文獻報道結論基本一致[9,24-27]。

綜上所述，本實驗發(fā)現高表達的CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1可能相互作用，參與甲狀腺組織的癌變，促進經典型PTC的發(fā)生。因此聯合檢測CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平，可能會為經典型PTC早期診斷及預后評價提供良好的候選基因。