miR-7-5p和miR-152-3p聯(lián)合調控Wnt/β-catenin通路對乳腺癌細胞上皮-間質轉化及化療耐藥的影響

李 娜，張哲瑩，朱會芳，賀國洋，韓正華，原志慶，王凡平，王明永

文獻報道顯示，乳腺癌耐藥形成過程是一個多元而復雜的過程，除了與基因的調控有關外，還與信號通路的調控密切相關[1]。本課題組前期實驗結果證實，miR-7-5p和miR-152-3p可通過協(xié)同抑制乳腺癌耐藥細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進程，降低乳腺癌紫杉醇耐藥性，但其具體的分子機制尚不清楚。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的核心因子，游離的β-catenin進入細胞核可與兔抗人T細胞因子4(T cell factor 4, TCF4)結合形成復合物，進而影響下游靶基因的異常轉錄，促進腫瘤的發(fā)生[2]。本實驗通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p和miR-152-3p均與TCF4 3′UTR區(qū)域存在互補的結合位點，猜測miR-7-5p和miR-152-3p可能通過共同靶向TCF4介導Wnt/β-catenin信號通路參與乳腺癌細胞紫杉醇耐藥的形成。因此，進一步探討miR-7-5p和miR-152-3p協(xié)同抑制乳腺癌細胞EMT進程及紫杉醇耐藥的分子機制是否與共同調控Wnt/β-catenin信號通路有關，以揭示miR-7-5p和miR-152-3p調控乳腺癌紫杉醇耐藥形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl購于天津市光復精細化工研究所。兔抗人TCF4單克隆抗體購于上海煊翎生物公司。兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司，熒光素酶活性檢測試劑盒購于美國Promega公司，乳腺癌MCF-7細胞株由本實驗室保存，MCF-7/TAX細胞株購于上海和序生物公司。

1.2 方法

1.2.1細胞轉染及處理 將對數(shù)生長期的MCF-7/TAX細胞以每孔106個接種至6孔細胞板上，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將細胞分為NC組(轉染陰性對照)、miR-7-5p組(轉染miR-7-5p mimics)、miR-152-3p組(轉染miR-152-3p mimics)和miR-7-5p/152-3p組(共轉染miR-7-5p和miR-152-3p)。根據(jù)上述分組進行轉染，轉染48 h后，采用Western blot法檢測各組細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin和TCF4的表達情況。將長勢良好處于對數(shù)生長期的miR-7-5p組、miR-152-3p組、miR-7-5p/152-3p組細胞分別接種至2個96孔細胞板上，一板細胞未做處理，另一板細胞分別給予20 mmol/L LiCl處理，并分別記為miR-7-5p+LiCl組、miR-152-3p+LiCl組、miR-7-5p/152-3p+LiCl組，采用Western blot法檢測細胞中β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移，MTT實驗檢測乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性。

1.2.2雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4的靶向關系 將對數(shù)生長期的MCF-7/TAX細胞以每孔2×104個接種至6孔細胞板上后，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞達75%左右匯合度時，參照脂質體2000說明書步驟將miR-7-5p mimics、miR-152-3p mimics及陰性對照分別與TCF4-WT、TCF4突變型(TCF4-MUT)共轉染至MCF-7/TAX細胞中。轉染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.3Western blot法檢測MCF-7/TAX細胞中β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達 各組細胞的總蛋白按試劑盒要求進行提取，總蛋白用BCA法進行定量。蛋白上清經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用TBST封閉1.5 h，一抗于4 ℃孵育過夜，按照ECL試劑盒說明書進行操作，X線片曝光、顯影、定影。GAPDH作為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.4Transwell小室實驗檢測MCF-7/TAX細胞的侵襲和遷移 實驗前1天，以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備濃度為5 mg/mL Matrigel基質膠，將膠平鋪到Transwell小室的底部，室溫下自然凝固。加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基水化基膜30 min。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室中，并加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h后，取出小室，小心拭去上層小室內(nèi)殘留的細胞，分別以4%多聚甲醛和5%結晶紫固定、染色各15 min。洗出染色液后，采用倒置顯微鏡觀察各組中的穿膜細胞數(shù)，結果以隨機選取3個視野內(nèi)細胞數(shù)的均值表示。

1.2.5MTT法檢測MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性 將長勢良好的對數(shù)生長期的各組細胞以每孔105個接種至96孔細胞板上后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。加入終濃度為0、20、40、60、80和100 μmol/L紫杉醇處理48 h。棄上清液后，加入20 μL濃度為5 g/L MTT溶液孵育4 h。加入150 μL DMSO溶液震蕩反應至MTT結晶重復溶解。采用酶標儀在490 nm波長處檢測各組細胞的光密度值。

2 結果

2.1 miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4的靶向關系采用Targetscan軟件對miR-7-5p及miR-152-3p的靶基因進行預測，TCF4 3′UTR區(qū)域存在能夠與miR-7-5p及miR-152-3p互補的結合位點(圖1A)。結合相關資料，最終將TCF4作為研究對象，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC組相比，轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics可使TCF4-WT報告基因載體的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05，圖1B)；但兩者對TCF4-MUT報告基因載體的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。

圖1 miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4靶向關系的驗證：A.Targetscan軟件分析miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4 3′UTR的結合位點；B.轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后細胞的熒光素酶活性；與NC組相比，*P<0.05

2.2 miR-7-5p和miR-152-3p對MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響Western blot法檢測結果顯示，轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin和TCF4蛋白的表達水平較NC組明顯降低(P<0.05)，且共同轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX細胞中β-catenin和TCF4蛋白的表達水平較miR-7-5p組或miR-152-3p組進一步降低(P<0.05，圖2)。

圖2 miR-7-5p和miR-152-3p對MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響：A.Western blot法檢測β-catenin和TCF4蛋白的表達；B.β-catenin和TCF4蛋白相對表達量；與NC組相比，*P<0.05；與miR-7-5p組或miR-152-3p組相比，#P<0.05

2.3 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞EMT進程的影響在轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics基礎上給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理MCF-7/TAX細胞后，Western blot法檢測結果見圖3，Transwell小室實驗檢測結果見圖4和圖5。與miR-7-5p組或miR-152-3p組或miR-7-5p/152-3p組相比，給予LiCl處理后MCF-7/TAX細胞中β-catenin、TCF4和vimentin蛋白的表達水平明顯升高，而E-cadherin蛋白的表達水平明顯降低，且MCF-7/TAX細胞侵襲和遷移能力明顯增強(P<0.05)。

圖3 激活Wnt/β-catenin信號通路對β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響：A.Western blot法檢測β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達；B.β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的相對表達水平；1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl; 與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

圖4 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞侵襲能力的影響：A.Transwell小室實驗檢測MCF-7/TAX細胞侵襲結果；B.各組中侵襲細胞數(shù)；1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl;與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

圖5 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞遷移能力的影響：A.Transwell小室檢測MCF-7/TAX細胞遷移結果；B.各組中遷移細胞數(shù);1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl; 與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

2.4 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性的影響在轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics基礎上給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理后，采用MTT法檢測MCF-7/TAX細胞紫杉醇耐藥性的變化。不同濃度紫杉醇作用下，miR-7-5p+LiCl組細胞增殖活力較miR-7-5p組明顯升高；同時miR-152-3p+LiCl組和miR-7-5p/152-3p+LiCl組細胞的增殖活力較miR-152-3p組、miR-7-5p/152-3p組也均明顯升高(P<0.05，圖6)。

圖6 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性的影響：與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

3 討論

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過降解或者抑制靶基因mRNA的翻譯，在轉錄后水平對靶基因進行調控，影響細胞增殖、侵襲、遷移、EMT和耐藥形成等，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[3]。Mansoori等[4]的研究結果指出，miR-142-3p可通過靶向調控BTB-CNC異體同源體1(Bach-1)的表達減少EMT相關蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。Yang等[5]指出，miR-125b可通過靶向調控軸突導向蛋白分子(Semaphorins 4C, Sema4C)表達抑制EMT表型逆轉乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性。

除了與靶基因相互作用外，miRNA還可通過直接或間接調控相關信號通路的活化參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Han等[6]的研究結果發(fā)現(xiàn)，異常高表達的miR-30d可通過靶向調控kruppel樣因子11(kruppel-like factor 11, KLF11)和激活信號轉導子與轉錄活化子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路的活化促進乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力和EMT進程。Li等[7]指出，miR-106b和miR-93通過靶向調控PTEN激活PI3K/AKT信號通路誘導乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。Mohammadi-Yeganeh等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-340可通過直接靶向調控Wnt信號通路抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移。Jiang等[9]報道，miR-100可通過直接靶向Wnt/β-catenin信號通路的受體卷曲蛋白8(frizzled homolog 8,FZD-8)表達并抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號通路是細胞內(nèi)經(jīng)典Wnt通路，當受到信號刺激時，糖原合成激酶-3β(glucogen synthase kinase-3β, GSK-3β)失活，β-catenin在細胞質內(nèi)過量積累，進入細胞核，β-catenin可通過與T細胞因子/淋巴樣增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)結合，進而調控下游靶基因的轉錄，在細胞生長、發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌中異常激活，核內(nèi)β-catenin活化可引起下游靶基因，如Cyclin D1、原癌基因c-myc、多藥耐藥基因MDR1和轉移相關基因MMP-7等的表達，在乳腺癌發(fā)生、轉移和耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用；抑制Wnt/β-catenin信號通路活化能夠有效抑制乳腺癌細胞生長及對化療藥物耐藥性，被認為是乳腺癌的潛在治療靶點。

TCF4屬于TCF/LEF家族成員，是Wnt信號通路的關鍵因子，在Wnt信號激活時，細胞質內(nèi)過多的β-catenin進入細胞核，與TCF4結合形成復合物，使其喪失抑制作用，在促轉錄因子作用下，引起下游靶基因過度表達，促進包括結直腸癌、肝癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Huang等[10]在乳腺癌的研究中指出，TCF4是miR-591的靶基因，其表達上調可部分逆轉miR-591對乳腺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用?？梢姡琓CF4在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用。此外，Hong等[11]在結直腸癌的研究中指出，TCF4可通過與E-cadherin轉錄抑制因子Slug結合介導EMT發(fā)生。Kendziorra等[12]研究指出，TCF4可能以β-catenin獨立的方式參與直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶化療耐藥。

本組前期實驗已證實miR-7-5p和miR-152-3p聯(lián)合可通過抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX的EMT進程降低乳腺癌細胞癌細胞紫杉醇耐藥性，但其具體作用機制尚不明確。本實驗采用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4 3′UTR均存在互補的結合位點，采用雙熒光素素酶報告基因實驗證實，TCF4是miR-7-5p和miR-152-3p的共同靶標。同時，Western blot法檢測結果發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p和miR-152-3p表達上調均可引起Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin、TCF4蛋白表達下調，且兩者聯(lián)合具有協(xié)同作用。同時，給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑處理后，miR-7-5p和miR-152-3p及兩者聯(lián)合上調對乳腺癌耐藥MCF-7/TAX的EMT進程及紫杉醇耐藥性的抑制作用明顯減弱。這提示，miR-7-5p和miR-152-3p可能通過聯(lián)合靶向調控TCF4使β-catenin/TCF4復合物減少，Wnt/β-catenin信號通路的活化受到抑制，從而使乳腺癌耐藥細胞株EMT進程及紫杉醇耐藥性減弱。

綜上所述，TCF4是miR-7-5p和miR-152-3p的共同靶標，miR-7-5p和miR-152-3p聯(lián)合可通過降低TCF4表達抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，進而抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX細胞株EMT進程，降低對紫杉醇的耐藥性。該結果從細胞水平上初步闡述了miR-7-5p和miR-152-3p聯(lián)合抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX細胞株EMT進程及紫杉醇耐藥性與Wnt/β-catenin信號通路有關，后期將從體內(nèi)動物水平上進一步闡述，以期為miR-7-5p和miR-152-3p有望成為改善乳腺癌紫杉醇耐藥性的靶標提供參考依據(jù)。