褐藻寡糖對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜穩(wěn)定性、分子間作用力及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

楊天 耿文豪 鄭志紅 汪秋寬 陳勝軍 劉麗 叢?；?/p>

摘 要：為區(qū)別不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0 g/100 mL）褐藻寡糖，包括酸解甘露糖醛酸寡糖（acidolyzed mannose oligosaccharide，AMO）、酸解古羅糖醛酸寡糖（acidolyzed guluronic oligosaccharide，AGO）和酶解褐藻酸鈉寡糖（enzymolysis alginate oligosaccharide，EAO）對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜熱穩(wěn)定性、分子間作用力以及肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜、內(nèi)源熒光光譜及紫外吸收光譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明：AMO質(zhì)量濃度對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜熱穩(wěn)定性作用無(wú)規(guī)律，但在總體上，EAO提高了魚(yú)糜的熱穩(wěn)定性，且與EAO質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，低質(zhì)量濃度AMO與AGO更容易降低魚(yú)糜的冰點(diǎn)和可凍結(jié)水含量，在提高魚(yú)糜的抗凍性方面性能更優(yōu)越;1.0 g/100 mL AGO保護(hù)離子鍵效果最好，EAO保護(hù)了肌原纖維蛋白的離子鍵、降低了氫鍵含量;褐藻寡糖修飾后，所有魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物的β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋含量減少，β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲含量上升;3 種褐藻寡糖對(duì)肌原纖維蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)有不同影響。

關(guān)鍵詞：鰱魚(yú)魚(yú)糜;肌原纖維蛋白;褐藻寡糖;穩(wěn)定性;分子間作用力;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

Abstract： This study compared the effects of different concentrations （0.5 and 1.0 g/100 mL） of acidolyzed mannose oligosaccharide （AMO）， acidolyzed guluronic oligosaccharide （AGO） and enzymolysis alginate oligosaccharide （EAO） on the thermal stability， intermolecular forces， Fourier transform spectra， endogenous fluorescence spectra and UV absorption spectra of myofibrillar proteins in silver carp surimi. The results showed that AMO affected the thermal stability of silver carp surimi irrespective of its concentration. However， on the whole， EAO increased the thermal stability of surimi， and this effect was positively correlated with EAO concentration. Low concentrations of AMO and AGO could more readily reduce the freezing point and freezable water content of surimi， and have stronger ability to increase the freezing resistance. AGO at 1.0 g/100 mL had the best protective effect on ionic bonds， and EAO was able to protect ionic bonds of myofibrillar proteins and reduce the hydrogen bond content. After oligosaccharide modification， the contents of β-turn and α-helix of myofibrillar proteins decreased， while the contents of β-sheet and random coil increased. The three oligosaccharides had different effects on tertiary structure unfolding of myofibrillar proteins in silver carp surimi.

Keywords： silver carp surimi; myofibrillar protein; alginate oligosaccharides; stability; intermolecular force; protein structure

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-116

中圖分類號(hào)：TS254.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）07-0001-08

引文格式：

楊天， 耿文豪， 鄭志紅， 等. 褐藻寡糖對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜穩(wěn)定性、分子間作用力及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（7）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-116. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

YANG Tian， GENG Wenhao， ZHENG Zhihong， et al. Effects of alginate oligosaccharides on the stability， intermolecular forces and myofibrillar protein structures of silver carp surimi[J]. Meat Research， 2021， 35（7）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-116. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

我國(guó)是淡水魚(yú)養(yǎng)殖大國(guó)，鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）是四大淡水魚(yú)之一，2019年鰱魚(yú)年產(chǎn)量已達(dá)到381 萬(wàn)t[1]，在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域占有重要地位，鰱魚(yú)以原料價(jià)格低和產(chǎn)量大的優(yōu)勢(shì)近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，已成為魚(yú)糜制品的潛在原料[2]。2019年我國(guó)魚(yú)糜制品產(chǎn)量已達(dá)到139.4 萬(wàn)t[1]。鰱魚(yú)肌原纖維蛋白是魚(yú)肉的重要組成部分，也是魚(yú)肉中最主要的蛋白，在肉類的加工貯存中起到非常重要的作用[3]。抑制或減少魚(yú)糜肌原纖維蛋白在貯藏和加工過(guò)程中的變性可以改善魚(yú)糜制品的功能特性，生產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)品。

常用物理、化學(xué)、酶和基因工程等方法修飾蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)法主要包括酰化、磷酸化、脫氨基、糖基化改性等，其中糖基化改性以操作條件溫和、加工安全性高及賦予蛋白質(zhì)新功能等優(yōu)勢(shì)受到重視[4]。研究發(fā)現(xiàn)，酶解褐藻酸鈉寡糖（enzymolysis alginate oligosaccharide，EAO）可提高肌原纖維蛋白在低NaCl濃度溶液中的溶解度[5]和保水性能[6];山梨糖醇、山梨糖醇與海藻糖/蔗糖復(fù)合，可抑制肌原纖維蛋白的聚集[7];經(jīng)葡萄糖糖基化改性后具有高溶解度的肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性顯著提高[8];右旋糖酐[9]和葡萄糖[10]可提高肌原纖維蛋白的乳化性。

褐藻酸鈉的分子式為（C6H7O6Na）n，相對(duì)分子質(zhì)量為32 000～200 000，其結(jié)構(gòu)單元相對(duì)分子質(zhì)量理論值為198.11[11-13]，在pH>12時(shí)呈膠體狀態(tài)，在pH<3時(shí)形成不溶性凝膠，由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古羅糖醛酸（G）通過(guò)1→4糖苷鍵以3 種方式（MM、GG和GM）連接成直鏈線性高聚合物[14]。褐藻寡糖具有良好的溶解度、生物利用度和多重生物活性[15]，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16]、保護(hù)神經(jīng)元[17]、抗氧化[18]、免疫調(diào)節(jié)[19]、抗炎、抗腫瘤[20-21]等。褐藻寡糖是低分子低聚物，通常用酸水解、氧化和生物酶水解的方法降解褐藻酸鈉獲得。酸水解法可分別使用草酸、鹽酸、硫酸或甲酸等降解獲得聚甘露糖醛酸（MM）和聚古羅糖醛酸（GG）[22]，進(jìn)一步降解獲得酸解甘露糖醛酸寡糖（acidolyzed mannose oligosaccharide，AMO）、酸解古羅糖醛酸寡糖（acidolyzed guluronic oligosaccharide，AGO），但酸法降解的反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)，一般需4～12 h，反應(yīng)條件不易控制，能耗高，產(chǎn)物回收率低，且“三廢”污染嚴(yán)重，產(chǎn)品外觀色澤差[22]。酶解法條件溫和、可控性強(qiáng)，生產(chǎn)的EAO特異性高[23]。

冷凍魚(yú)糜是魚(yú)糜制品加工行業(yè)主要的流通料[24]，淡水魚(yú)糜在冷凍貯藏和加工過(guò)程中需要更好地保存品質(zhì)，褐藻寡糖可作為冷凍海產(chǎn)品原料的抗凍劑。本研究系統(tǒng)考察不同來(lái)源褐藻寡糖（酸解法分別獲得AMO和AGO，酶解法獲得EAO）對(duì)冷凍鰱魚(yú)魚(yú)糜的穩(wěn)定作用及對(duì)肌原纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步研究冷凍、解凍等加工過(guò)程和消化過(guò)程中蛋白質(zhì)變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鰱魚(yú)糜，2019年6月12日購(gòu)于洪湖市井力水產(chǎn)食品股份有限公司。AMO、AGO ? 實(shí)驗(yàn)室自制;EAO 中科榮信生物科技有限公司;溴化鉀（光譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠;氯化鈉（分析純） 遼寧泉瑞試劑有限公司;氫氧化鈉（分析純） 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;乙醇（分析純） 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司;尿素（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;β-巰基乙醇（分析純） 上海雅吉生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純） 青島捷世康生物科技有限公司;食鹽 濰坊千源鹽化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;Q20差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)TA儀器公司;F-2700熒光分光光度計(jì)日本Hitachi公司;NEXUS670傅里葉變換紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國(guó)PerkinElmer公司;UV-9000雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸解法制備AMO、AGO

參考趙丹等[25]的方法略作修改，采用酸水解法制備AMO、AGO。取2 g褐藻酸鈉，加入100 mL蒸餾水浸泡24 h，加入80 mL 0.3 mol/L鹽酸，沸水回流水解10 h，冷卻后5 000×g離心15 min，取沉淀溶于60 mL 0.8 g/100 mL Na2CO3溶液，用0.5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.85，5 000×g離心15 min得上清液與沉淀2，在上清液中加入2 倍體積乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%），5 000×g離心15 min后得沉淀1，沉淀1和沉淀2分別用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇反復(fù)洗滌，再將2 種沉淀冷凍干燥，分別得到AMO和AGO。

1.3.2 魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物的制備

參考楊姣等[26]的方法略作修改。將冷凍鰱魚(yú)魚(yú)糜于4 ℃層析柜中解凍過(guò)夜，取20 g魚(yú)糜，加入1.5%食鹽，擂潰5 min，添加10 mL 0.5 g/100 mL或1.0 g/100 mL的AMO、AGO、EAO溶液，將魚(yú)糜水分含量調(diào)整為76%，以添加10 mL蒸餾水的樣品為空白，繼續(xù)擂潰2 min使水分與魚(yú)糜充分混勻，得到添加不同質(zhì)量濃度3 種褐藻寡糖的魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物。

1.3.3 DSC法測(cè)定復(fù)合物穩(wěn)定性

參考黃海[27]的方法。稱取13～15 mg魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物，放入氧化鋁坩堝底部密封，使用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)DSC儀進(jìn)行校準(zhǔn)后進(jìn)行樣品測(cè)定，以密封的空坩堝為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)采用的測(cè)定程序?yàn)椋撼跏紲囟扰c結(jié)束溫度設(shè)定為15 ℃，先以10 ℃/min降溫到-50 ℃并保持10 min，再以5 ℃/min升溫到15 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫到100 ℃后以50 ℃/min降溫到15 ℃。

在升溫曲線上，冰點(diǎn)理論上為結(jié)晶剛剛?cè)劢馔瓿傻臏囟?，但由于試樣熔化完后，基線受升溫速率和樣品量的影響，出現(xiàn)不同程度的滯后現(xiàn)象，因此把相變峰的峰值溫度確定為魚(yú)肉的冰點(diǎn)[28]。

水分形態(tài)分析[29]：假設(shè)魚(yú)糜樣品中水分的總焓變與純水相同，可凍結(jié)水（包括自由水和不易流動(dòng)水）含量可通過(guò)樣品在0 ℃附近的焓變計(jì)算得到，按式（1）計(jì)算。

在40～80 ℃分析復(fù)合物的熱穩(wěn)定性[30]。使用TA Universal Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄并分析各處理組樣品DSC圖譜各峰的峰值溫度（Tp）和總變性焓（ΔH3）。

1.3.4 分子間作用力測(cè)定

根據(jù)Li Fengtang等[31]方法稍作修改。取2 g魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物，分別與10 mL 0.05 mol/L?NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L?NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L?NaCl+8 mol/L尿素（SD）、0.6 mol/L?NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巰基乙醇（SE）混合，4 000 r/min均質(zhì)3～5 min后，于4 ℃靜置1 h，8 000 r/min離心10 min，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用力、二硫鍵含量分別按式（3）～（6）計(jì)算，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

離子鍵含量/（mg/mL）=ρSB-ρSA （3）

氫鍵含量/（mg/mL）=ρSC-ρSB （4）

疏水相互作用力/（mg/mL）=ρSD-ρSC （5）

二硫鍵含量/（mg/mL）=ρSE-ρSD （6）

式中：ρSA為溶解于SA溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρSB為溶解于SB溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρSC為溶解于SC溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρSD為溶解于SD溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρSE為溶解于SE溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 肌原纖維蛋白的提取

參考儀淑敏等[32]的方法。分別取上述魚(yú)糜-褐藻寡糖復(fù)合物5 g，加入25 mL 10 mmol/L、pH 7.2 Tris-HCl緩沖液，4 000 r/min均質(zhì)2 min后，于4 ℃、5 000 r/min離心15 min，取沉淀加入20 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2），于4 000 r/min均質(zhì)30 s，4 ℃、4 500 r/min離心20 min后取上清，上清液即為肌原纖維蛋白溶液，用雙縮脲試劑測(cè)定上清液中肌原纖維蛋白含量。用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L?NaCl，pH 7.2）將肌原纖維蛋白配制成質(zhì)量濃度

1.0 mg/mL的溶液。

1.3.6 FTIR測(cè)定肌原纖維蛋白中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

根據(jù)Xu Yujuan等[33]方法稍作修改。將提取的各肌原纖維蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，取2 mg冷凍干燥后的肌原纖維蛋白粉末，與100 mg干燥的無(wú)水溴化鉀充分混合，在約18 N的壓力下加壓2 min，制成溴化鉀壓片。用FTIR儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)定和分析，分辨率4 cm-1，光譜掃描范圍400～4 000 cm-1。Peak Fit軟件用于酰胺Ⅰ譜帶的原始光譜曲線擬合。1 600～1 639 cm-1被認(rèn)為是β-折疊結(jié)構(gòu)波段，1 640～1 650 cm-1被認(rèn)為是無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)波段，1 651～1 660 cm-1被認(rèn)為是α-螺旋結(jié)構(gòu)波段，1 661～1 700 cm-1被認(rèn)為是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)波段[34]。利用Peak Fit軟件，根據(jù)積分面積占比計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.7 肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

取各組肌原纖維蛋白溶液，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描范圍300～450 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度[35]。猝滅常數(shù)（Ksv）用Stern-Volmer方程計(jì)算[36]，如式（7）所示。

式中：F0和F分別為空白組與添加褐藻寡糖組的熒光強(qiáng)度最大值;[Q]為褐藻寡糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 肌原纖維蛋白紫外吸收光譜測(cè)定

取各組肌原纖維蛋白溶液，以10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2）作為對(duì)照。將樣品置于石英比色皿中，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)230～350 nm獲得紫外吸收光譜。使用OriginPro 2017軟件從紫外吸收光譜獲得二階導(dǎo)數(shù)光譜[37]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P<0.05），使用OriginPro 2017軟件制表、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合物DSC測(cè)定結(jié)果及分析

DSC技術(shù)可以定量測(cè)定樣品的物理轉(zhuǎn)變及化學(xué)反應(yīng)，水分狀態(tài)的改變對(duì)食品的貯藏性、加工性和商品的利用價(jià)值都有極大影響。DSC技術(shù)可用來(lái)測(cè)定蛋白的結(jié)晶點(diǎn)、冰點(diǎn)等[38]。

由圖1可知，DSC曲線顯示了明顯的熔融溫度（Tp1），其中放熱峰為水分結(jié)晶峰。解凍鰱魚(yú)魚(yú)糜經(jīng)褐藻寡糖修飾后其熔融溫度改變，表明加熱過(guò)程中晶態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞[39]。

由表1可知：除了1.0 g/100 mL AGO組，褐藻寡糖導(dǎo)致解凍鰱魚(yú)魚(yú)糜的水分結(jié)晶峰Tp1升高，且低質(zhì)量濃度組更高;AMO組、EAO組水分結(jié)晶峰ΔH1升高，且高質(zhì)量濃度組升高幅度較大，而AGO組ΔH1降低，且AGO高質(zhì)量濃度組降低幅度較大，水分結(jié)晶峰的出現(xiàn)可能是由于本研究設(shè)置的程序中水分結(jié)晶峰值在-50～15 ℃升溫速率較大。

寡糖修飾后加快水分的相變，導(dǎo)致魚(yú)糜水分分布的改變，由于寡糖的親水性使復(fù)合物的親水性增強(qiáng)，從而提高了樣品的可凍結(jié)水含量[40]。高質(zhì)量濃度褐藻寡糖對(duì)魚(yú)糜水分分布（可凍結(jié)水含量和非凍結(jié)水含量比例）的影響較大。1.0 g/100 mL AMO、1.0 g/100 mL AGO提高了冰點(diǎn)峰Tp2，而0.5 g/100 mL AMO、AGO、EAO則降低了冰點(diǎn)峰Tp2。1.0 g/100 mL AMO、AGO、EAO組ΔH2升高，可凍結(jié)水含量升高，而0.5 g/100 mL AMO、AGO組ΔH2降低，可凍結(jié)水含量降低，這是因?yàn)樵诳臻g允許的情況下，水分子有形成更多氫鍵的趨勢(shì)，以形成類似“籠形”的聚集體結(jié)構(gòu)，水分子與寡糖之間也會(huì)形成部分氫鍵，以利于上述結(jié)構(gòu)的形成，使更多水分子禁錮在寡糖-蛋白復(fù)合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，可凍結(jié)水的流動(dòng)性減弱，導(dǎo)致冰點(diǎn)降低，吸熱峰的峰值向低溫區(qū)移動(dòng)[41]。高質(zhì)量濃度褐藻寡糖組冰點(diǎn)峰值溫度升高，可能與EAO由M、G 2 種單體聚合而成有關(guān)，其較MM、GG聚合體較復(fù)雜?？偟膩?lái)說(shuō)，AMO與AGO在抗凍性方面性能更優(yōu)越，且低質(zhì)量濃度（0.5 g/100 mL）褐藻寡糖更容易降低冰點(diǎn)、可凍結(jié)水含量更低，能更好地抵抗低溫，便于貯藏[42]。

DSC可以表征肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而推斷熱穩(wěn)定性[43]。圖1中40～80 ℃有3 個(gè)峰，其中峰Ⅰ代表肌球蛋白頭部引起的熱流變化，峰Ⅱ代表肌球蛋白尾部和肌漿蛋白引起的熱流變化，峰Ⅲ代表肌動(dòng)蛋白引起的熱流變化，各峰的峰值溫度（表1中TpⅠ、TpⅡ、TpⅢ）為蛋白變性溫度，該溫度越高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越高，峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ峰面積的積分和為總變性焓（ΔH3）[44]。由表1可知，褐藻寡糖修飾后TpⅠ均升高，其中1.0 g/100 mL EAO、0.5 g/100 mL AMO、0.5 g/100 mL AGO組升高程度較大，表明褐藻寡糖修飾后，魚(yú)糜肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)[45]。寡糖能夠通過(guò)非共價(jià)相互作用和物理纏結(jié)改變魚(yú)糜肌原纖維蛋白的構(gòu)象，使分子結(jié)構(gòu)中的羥基與肌原纖維蛋白分子中的一些基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)也能增強(qiáng)肌原纖維蛋白的疏水相互作用[46]，影響多肽鏈空間結(jié)構(gòu)的重排[47]，從而避免蛋白質(zhì)變性。除1.0 g/100 mL AMO與0.5 g/100 mL EAO組Tp Ⅱ升高，其他組Tp Ⅱ均降低;除0.5 g/100 mL AMO組Tp Ⅲ降低，其他組Tp Ⅲ均升高，且經(jīng)高質(zhì)量濃度褐藻寡糖修飾后更高。AMO、AGO組ΔH3均升高，且高質(zhì)量濃度AMO組升高程度更大?？偟膩?lái)說(shuō)，AMO、AGO組熱穩(wěn)定性都有所改善[47]，且經(jīng)高質(zhì)量濃度褐藻寡糖修飾后樣品的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.2 復(fù)合物分子間作用力測(cè)定結(jié)果及分析

魚(yú)糜凝膠系統(tǒng)中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)蛋白質(zhì)分子間與分子內(nèi)的相互作用來(lái)維持，如離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵[48]。離子鍵和氫鍵是相對(duì)于疏水相互作用和二硫鍵較弱的鍵合力[49]。

由表2可知，鰱魚(yú)魚(yú)糜中存在大量離子鍵和氫鍵，與空白組相比較，1 g/100 mL AMO和1 g/100 mL EAO組離子鍵含量顯著降低（P<0.05），而1 g/100 mL AGO組離子鍵含量顯著升高（P<0.05），經(jīng)低質(zhì)量濃度組褐藻寡糖修飾后，離子鍵含量均升高，離子鍵可以維持肌原纖維蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，離子鍵被破壞意味著蛋白發(fā)生了聚集。與空白組相比較，除1 g/100 mL EAO組外，其他組氫鍵含量均降低，這種現(xiàn)象可能是由于寡糖在蛋白展開(kāi)時(shí)與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)與水結(jié)合。EAO組疏水相互作用力下降，而0.5 g/100 mL AMO組疏水相互作用力顯著增加（P<0.05），且AGO組疏水相互作用力均上升，表明褐藻寡糖修飾對(duì)維持肌原纖維蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定起著重要作用[50]。褐藻寡糖修飾后，高質(zhì)量濃度褐藻寡糖組魚(yú)糜二硫鍵含量均上升，其中1 g/100 mL AMO組二硫鍵含量較高，巰基氧化，形成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)增加，從而改善魚(yú)糜凝膠的性質(zhì)[24]。

2.3 魚(yú)糜肌原纖維蛋白FTIR測(cè)定結(jié)果及分析

由圖2可知，魚(yú)糜肌原纖維蛋白在FTIR圖譜上有多個(gè)吸收波段，其中1 629 cm-1處的特征吸收峰為酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動(dòng);1 555 cm-1處的特征吸收峰為酰胺Ⅱ帶C-N的伸縮與N-H的彎曲振動(dòng)[51];1 180～953 cm-1有一系列重疊峰，為C-O和C-C伸縮振動(dòng)和C-H的彎曲模式。褐藻寡糖修飾后，肌原纖維蛋白酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰波數(shù)略有降低，可能是褐藻寡糖與蛋白發(fā)生靜電相互作用的原因[34];1 180～953 cm-1區(qū)域的透光率變大，可能是肌原纖維蛋白與寡糖之間形成了共價(jià)鍵，導(dǎo)致體系中羥基和碳氧鍵增多，使得該波段吸收增強(qiáng)[10]。加入褐藻寡糖后，3 192 cm-1處的吸收增強(qiáng)，這種變化可能是由N-H的減少引起的，這也證明了褐藻寡糖與肌原纖維蛋白之間可能通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合[34]。

酰胺Ⅰ帶是被公認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征吸收峰，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要通過(guò)非共價(jià)作用力維持，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)分子將重新排列，以達(dá)到最低能量，維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[47]。

由表3可知，魚(yú)糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中相對(duì)含量較高的主要是β-折疊，其次是無(wú)規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角及α-螺旋。褐藻寡糖修飾后，α-螺旋相對(duì)含量均降低，高質(zhì)量濃度褐藻寡糖修飾后α-螺旋相對(duì)含量低于低質(zhì)量濃度組，α-螺旋相對(duì)含量降低表明褐藻寡糖通過(guò)與蛋白質(zhì)分子相互作用抑制水溶性蛋白質(zhì)和疏水殘留物的暴露[52]。褐藻寡糖修飾后，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量均降低，其中高、低質(zhì)量濃度EAO組β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量降低差距不大。除AGO組外，其他組β-折疊相對(duì)含量都有所升高，高、低質(zhì)量濃度EAO組β-折疊相對(duì)含量增加較均衡。無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量均升高，尤其是AGO組，且AGO組與EAO低質(zhì)量濃度組升高幅度較大，無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量的升高表明褐藻寡糖修飾使蛋白結(jié)構(gòu)更加無(wú)序?？赡苁呛衷骞烟堑男揎検功?轉(zhuǎn)角、α-螺旋向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變，肌原纖維蛋白具有更隨機(jī)的結(jié)構(gòu)[53]。

2.4 魚(yú)糜肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜測(cè)定結(jié)果及分析

蛋白質(zhì)內(nèi)源性色氨酸（Trp）熒光對(duì)于其周邊微環(huán)境的極性非常敏感，因此常用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[54]。由圖3可知，空白組熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為331 nm，褐藻寡糖修飾后，魚(yú)糜肌原纖維蛋白的最大發(fā)射波長(zhǎng)并沒(méi)有變化，但是熒光強(qiáng)度均有所增強(qiáng)，酸解樣品高質(zhì)量濃度條件下熒光強(qiáng)度較高，酶解樣品低質(zhì)量濃度條件下熒光強(qiáng)度較高?？赡苁怯捎诤衷骞烟切揎椇?，與蛋白之間發(fā)生聚合反應(yīng)，蛋白反應(yīng)性熒光強(qiáng)度升高[53]，酸解AMO與AGO可能更容易與蛋白反應(yīng)，且高質(zhì)量濃度褐藻寡糖為蛋白提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)[53]。一般來(lái)說(shuō)，生色團(tuán)與猝滅劑相互作用會(huì)降低熒光量子產(chǎn)率。本研究結(jié)果與其相悖，可能歸因于褐藻寡糖與肌原纖維蛋白發(fā)生靜電相互作用，增加了疏水性Trp發(fā)色團(tuán)微環(huán)境的極性，使Trp殘基更多地埋藏在肌原纖維蛋白分子中，從而導(dǎo)致與猝滅劑的相互作用程度較低[55]。

由表4可知，所有褐藻寡糖修飾后樣品Ksv皆為負(fù)值，也說(shuō)明褐藻寡糖修飾后使肌原纖維蛋白溶液的極性改變。

2.5 魚(yú)糜肌原纖維蛋白紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果及分析

色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的R基團(tuán)含有苯環(huán)共軛雙鍵，分別在280、275、257 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。肌原纖維蛋白的最大吸收波長(zhǎng)在275 nm附近，可能是由于Tyr未包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部。

由圖4可知，在275、280 nm波長(zhǎng)處，各樣品的最大吸收峰并未發(fā)生移動(dòng)，表明肌原纖維蛋白中Tyr微環(huán)境變化不明顯。高質(zhì)量濃度褐藻寡糖組肌原纖維蛋白紫外吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，且3 種褐藻寡糖中AMO組增加幅度較大，說(shuō)明褐藻寡糖與肌原纖維蛋白之間發(fā)生分子內(nèi)或分子間的相互作用[56]。

紫外二階光譜可以進(jìn)一步研究肌原纖維蛋白構(gòu)象的細(xì)微差異，在288 nm（Trp、Tyr共同作用）和296 nm（Trp作用）波長(zhǎng)處有2 個(gè)正吸收峰，在284、291 nm波長(zhǎng)處有2 個(gè)負(fù)吸收峰[57]，因此需采用紫外二階導(dǎo)數(shù)生成r值（r=a/b，a、b分別為第1次和第2次正吸收峰與負(fù)吸收峰的差值），來(lái)分析Tyr殘基微環(huán)境。且褐藻寡糖修飾后，二階導(dǎo)數(shù)光譜峰的位置幾乎未發(fā)生變化。

Tyr在極性溶劑中的暴露增加會(huì)導(dǎo)致r值增加。由表5可知，與空白組相比，褐藻寡糖修飾后r值增大，1.0 g/100 mL AGO組增加幅度較大，3 種褐藻寡糖修飾后r值均升高，可能是由于褐藻寡糖通過(guò)大量羥基與Tyr形成氫鍵，從而使Tyr暴露于分子表面[57]，也表明1.0 g/100 mL AGO修飾后的蛋白質(zhì)聚集程度較高[58]。

3 結(jié) 論

褐藻寡糖（0.5、1.0 g/100 mL）的修飾對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜的穩(wěn)定性有一定的改善，1 g/100 mL組的熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，0.5 g/100 mL組魚(yú)糜冷凍穩(wěn)定性顯示出較好的優(yōu)勢(shì)。褐藻寡糖的修飾對(duì)蛋白質(zhì)離子鍵具有保護(hù)作用，且1 g/100 mL AGO組最優(yōu);褐藻寡糖通過(guò)靜電相互作用與蛋白結(jié)合，且改變了肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變，蛋白結(jié)構(gòu)更加無(wú)序;褐藻寡糖修飾后，改變了蛋白周圍的極性環(huán)境，色氨酸被埋藏于分子內(nèi)，而酪氨酸更容易暴露，使蛋白結(jié)構(gòu)更加聚集。

本研究討論了不同來(lái)源的褐藻寡糖作為抗凍劑或熱穩(wěn)定劑在冷凍魚(yú)糜行業(yè)的應(yīng)用，研究結(jié)果有宏觀尺度的對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜品質(zhì)的影響，也有分子尺度的對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的修飾，仍需對(duì)微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以進(jìn)一步明確褐藻寡糖對(duì)蛋白質(zhì)的修飾機(jī)制。本研究為系統(tǒng)理解復(fù)雜食品組分結(jié)構(gòu)變化提供了依據(jù)，為開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品和應(yīng)用提供了參考。

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