檸檬葉片潰瘍病菌的分離鑒定及室內(nèi)防治藥劑篩選

李 亞，蔡永軍，余沁涵，孔少連，周曉晴，張穎荷

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江524088）

0 引言

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞柑橘亞種(Xanthomonas citri subsp.citri)引起的一種重要檢疫性病害，是柑橘生產(chǎn)上的重要病害之一[1]。檸檬作為一種營養(yǎng)兼藥用價值較高的保健水果，近年來深受人們的喜愛，由于柑橘潰瘍病的危害，粵西地區(qū)檸檬的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和布局受到極大的限制。柑橘潰瘍病菌因其菌系分化復(fù)雜、發(fā)病率高、傳播途徑廣、傳染速度快、寄主范圍廣對柑橘生產(chǎn)造成巨大損失[2]。該病害可危害蕓香科數(shù)十種植物，包括橙類、柚類、檸檬等柑橘類品種，其中以甜橙、臍橙、酸橙等橙類品種最為感病[3]。感染柑橘潰瘍病的柑橘枝條、葉片和果實表面形成類似火山口狀的病斑，輕則影響柑橘樹及柑橘的外觀，引起少量的落果，重則能導(dǎo)致柑橘樹大量落葉、落果甚至枝梢枯死，尤其是果實染病后，嚴重影響果實外觀，極大降低了柑橘作為鮮食商品的價值[4]。目前對于柑橘潰瘍病的防治主要以藥劑防治為主，包括鏈霉素、四環(huán)素、中生菌、赤霉素和春雷霉素等農(nóng)用抗生素[5]。對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的生防細菌，如枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等[6]。還有各種無機和有機銅制劑包括波爾多液、氫氧化銅、硫酸銅和噻菌銅等[7-8]。但是藥劑的過多使用會增強潰瘍病菌對各類防控藥劑的耐藥性[9]。因此，到目前為止還沒有完全安全有效的方法對柑橘潰瘍病進行徹底清除和防控，致使柑橘潰瘍病逐漸向非疫區(qū)蔓延，危害不斷擴大，嚴重影響了柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[10]。為了深入研究柑橘潰瘍病菌在檸檬上的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和作用機制，詳細調(diào)查研究湛江地區(qū)發(fā)展檸檬種植業(yè)的前景和風(fēng)險。本文對檸檬葉片上疑似潰瘍病病菌進行了分離鑒定，并在實驗室條件下檢測5種常用化學(xué)藥劑對潰瘍病菌的抑制效果，從而篩選出對柑橘潰瘍病防治效果較好的防治藥劑，為今后開展柑橘潰瘍病菌的致病機制研究提供試驗材料，也為柑橘潰瘍病的田間防治和其它農(nóng)藥復(fù)配劑的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化

病原材料：采自湛江市果樹所檸檬園檸檬潰瘍病病葉。

病原菌的分離：取有典型柑橘潰瘍病病斑的檸檬葉片，剪取病健交界處黃色暈圈部位小塊病組織，用75%的乙醇處理30 s后，放入3%次氯酸鈉中浸泡30 s，最后用無菌水沖洗3～5次，晾干后挑取3塊約0.5×0.5mm的組織塊放入加有500 μL無菌水的無菌研缽中研磨，隨后轉(zhuǎn)入1.5 mL尖底離心管中靜置10 min。用接種環(huán)蘸取組織浸出液接種于NA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3天，挑取具有典型潰瘍病菌黃色菌落特征的單菌落進行2～3次純化后保存?zhèn)溆?。實驗在廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院海洋微生物實驗室，于2018年12月—2019年12月份進行。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 病原菌的菌落形態(tài)及鞭毛、莢膜觀察 將純化后的病原菌接種于NA培養(yǎng)基上，48 h后觀察菌落特征。將純化的病原菌在NA試管斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，取最新純化的菌種放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)14 h，用接種環(huán)挑取沾有冷凝水的菌體5環(huán)，移入裝有2 mL無菌水的離心管中，將其置于28℃恒溫箱中靜置10 min，待其幼齡菌鞭毛松展開，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，并將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，涂片放空氣中自然干燥，用電子顯微鏡觀察莢膜和鞭毛的形態(tài)[11]。

1.2.2 病原菌的革蘭氏染色 參照革蘭氏染色試劑盒（環(huán)凱微生物革蘭氏染色液配套試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）說明書對其進行革蘭氏染色并觀察。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 病原菌基因組DNA提取 將分離純化后的潰瘍病菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖48 h后，取1.5 mL菌液提取其DNA（方法參考TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）用于后續(xù)PCR鑒定。

1.3.2 病原菌的PCR鑒定 以提取的病原菌DNA為模板，分別用柑橘潰瘍病菌的特異性引物P8/P9[12]、JYF5/JYR5[13]、Xac01/Xac02[14-15]、GGS1F/GGS2R[16]及 27F/1492R(16S rDNA)進行PCR擴增，所用引物序列（見表1）。PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為96℃，5 min；95℃，45 s，55℃，30 s，72℃，60 s；35個循環(huán)，72℃，7 min。PCR完成后取5 μL產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶。將目的條帶的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

表1 柑橘潰瘍病菌分子鑒定的特異性引物

1.4 病原菌的致病性測定

將純化的病原菌在NA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h后，用無菌水稀釋菌懸液濃度至1×108cfu/mL[17]。選取健康檸檬葉片，采用離體葉片接種法對病原菌的致病性進行測定，將蘸取菌液后的滅菌脫脂棉覆蓋在葉片的針刺部位，以無菌水作為對照，每個處理3次重復(fù)。將接種后的離體葉片置于28℃、濕度為60%、光照時間為12 h的培養(yǎng)箱中，2天后將覆蓋葉片的脫脂棉去除，葉片繼續(xù)保持28℃光照保濕培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則對回接發(fā)病的檸檬葉進行病原菌的再分離、純化與鑒定，并與最初的接種菌進行比較。

1.5 病原菌的生理生化測定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]，對病原菌的不同碳源利用等各項生理生化進行鑒定。包括D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、蔗糖、蜜二糖、海藻糖、丙三醇、肌醇、核糖醇、山梨醇、D-甘露醇等的分解代謝情況，并對其淀粉水解實驗、過氧化氫酶測定、氧化酶測定、明膠液化能力、甲基紅實驗、硝酸鹽還原實驗、吲哚實驗、產(chǎn)氨實驗、V-P測定實驗等各項生理生化指標進行測定。

1.6 室內(nèi)藥劑篩選

1.6.1 供試藥劑 46%氫氧化銅水分散粒劑（美國杜邦公司）、27.12%堿式硫酸銅懸浮劑（澳大利亞紐發(fā)姆有限公司）、12%中生菌素可濕性粉劑（福建凱立生物制品有限公司）、50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑（江蘇克勝集團股份有限公司）、10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑[撒爾夫（河南）農(nóng)化有限公司]。

1.6.2 毒力測定方法 將病原菌在NA固體培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接NB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)24 h[19]。將菌液稀釋成1×108cfu/mL，取1 mL菌液，連同冷卻至40～50℃的NA固體培養(yǎng)基10～15 mL，一起倒入滅菌培養(yǎng)皿中，搖勻后冷卻凝固并做好標記。用滅菌的鑷子夾取消毒的濾紙片(d=1.5 cm)分別投入各種待測藥液中，30 min后把藥液的濾紙片放置于固體培養(yǎng)基中心位置（以水作為對照），每皿3～4片，在皿底做標記，每個處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測量其抑菌圈直徑，重復(fù)3次取其平均值，并按公式(1)計算抑制百分率。

其中A：抑制百分率，B：抑菌圈直徑，C：紙碟直徑。

根據(jù)菌抑制率與其所對應(yīng)的殺菌劑濃度，計算殺菌劑對柑橘潰瘍病菌的抑制有效中濃度，即為EC50[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和純化

從湛江市果樹所采集的新鮮檸檬病葉（圖1），病斑部位正反面隆起，初期呈海綿狀，感染后期病部中央破裂逐漸形成木栓化并開裂呈火山口狀，病斑周邊有黃色暈環(huán)。采用稀釋分離法分離病原菌后（圖2），挑取具有典型潰瘍病菌菌落特征的單菌落進行純化并保存。病原菌在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，菌落呈蠟黃色，圓形，全緣，表面光滑，有光澤，微隆起，粘稠狀（圖3），將純化保存的病原菌編號為zlm1908。

圖1 健康檸檬葉片與感病檸檬葉片

圖2 病原菌的分離

圖3 病原菌的菌落形態(tài)

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 鞭毛及莢膜觀察 通過電子顯微鏡觀察，病原菌zlm1908的菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，極生單鞭毛，能游動，有莢膜，無芽孢（圖4）。

圖4 柑橘潰瘍病菌的鞭毛及莢膜電鏡觀察

2.2.2 革蘭氏染色 病原菌zlm1908染色后用100倍油鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病原菌呈紅色，為革蘭氏陰性菌（圖5）。

圖5 柑橘潰瘍病菌的革蘭氏染色

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用柑橘潰瘍病菌的特異性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和 GGS1F/GGS2R以 及 細 菌16SrDNA通用引物27F/1492R檢測所分離到的病原菌的DNA，分別得到符合預(yù)期大小的870 bp，413 bp，582 bp，760 bp和1500 bp的目的條帶（圖6）。將PCR產(chǎn)物測序后得到的序列與Genbank中的序列進行比對分析，結(jié)果顯示分離物zlm1908的引物P8/P9擴增的序列與strainXcc49相似性為99.08%，strainXcc49的登錄號為(CP023662.1)。Xac01/Xac02擴增的序列與strainXcc49相似性為99.04%，strainXcc49的登錄號為(CP024031.1)。結(jié)合5對不同引物PCR擴增結(jié)果表明所分離的病原菌為柑橘潰瘍病菌(Xcc)。

圖6 特異性引物的PCR擴增結(jié)果

2.4 病原菌的致病性測定

檸檬葉片回接病原菌4～5天左右，刺傷部位正反面均出現(xiàn)海綿狀隆起，接種點周圍出現(xiàn)輕微黃色暈圈。7～9天后葉片海綿狀逐漸形成木栓化，葉片接種點周圍黃色暈圈更為明顯。2周后葉片上接種點周圍形成典型火山口狀病斑，且葉背面更為明顯，對照組不發(fā)?。▓D7A,B）。通過柯赫氏法則從接種發(fā)病病斑中重新分離病原菌，挑取與黃單胞形態(tài)相似的菌落進行純化后得到與接種菌菌落形態(tài)極為相似的病原菌(圖7C,D)。利用柑橘潰瘍病菌的4對特異性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和GGS1F/GGS2R對分離純化后的接種菌進行菌落PCR鑒定，分別得到413 bp、582 bp、760 bp和870 bp與最初接種菌完全一致的特異性目的條帶，因此可以確定從離體葉片發(fā)病部位分離出的病原菌與接種的柑橘潰瘍病菌一致。

圖7 病原菌體外致病性測定及接種菌的再分離

2.5 生理生化測定

將分離鑒定的檸檬潰瘍病菌菌株zlm1908與對照菌株生理生化結(jié)果表明：該病原菌可以利用D-果糖、蜜二糖，不能以D-半乳糖、D-甘露糖、海藻糖、蔗糖、丙三醇、核糖醇、D-甘露醇、肌醇、山梨醇等作為碳源（表2），淀粉酶（陽性）、過氧化氫酶（陽性）、明膠液化（陽性）、硝酸鹽還原（陽性）、產(chǎn)氨（陽性）、氧化酶（陰性）、吲哚（陰性）、V-P（陰性）、甲基紅（陰性）（表2）。

表2 病原菌zlm1908生理指標測定

表3 病原菌zlm1908生化指標測定

2.6 供試藥劑的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明供試的5種藥劑對檸檬潰瘍病菌zlm1908都有一定的抑制效果（表4）?？莶菅挎邨U菌在低濃度時就顯示出較好的抑菌效果，當(dāng)濃度為15 g/L時，抑制率可達到59.5%，當(dāng)濃度增加到40 g/L時，抑菌率達到68%。46%氫氧化銅的抑菌效果與有效濃度密切相關(guān)，有效濃度越高，抑菌效果越好，當(dāng)有效濃度從16 g/L增加到60 g/L，抑制率從46.9%上升到79.1%。27.12%堿式硫酸銅的抑菌效果，從有效濃度為5 g/L上升到40 g/L時，抑菌率從34.8%上升到64.3%。50%氯溴異氰尿酸對該菌的抑制效果也不錯，當(dāng)有效濃度為45 g/L時，抑菌率可達到55.9%。12%中生菌素有效濃度為25 g/L時，抑菌率就已經(jīng)達到的54.1%，但在25～60 g/L時，抑制率變化較為平緩，保持在54.1%～60.5%之間。

表4 5種殺菌劑對病原菌zlm1908的室內(nèi)毒力測定

2.7 供試藥劑對柑橘潰瘍病菌的毒力回歸方程

由供試藥劑對檸檬潰瘍病菌的毒力回歸方程可知（表5），供試藥劑濃度的對數(shù)值與抑制率的機率值間有良好的線性關(guān)系，除50%氯溴異氰尿酸PX的R2為0.97，其他4種藥劑的R2都在0.99以上。46%氫氧化銅WG、27.12%堿式硫酸銅SC、枯草芽孢桿菌WP、50%氯溴異氰尿酸PX、12%中生菌素WP的EC50值分別為18.45 g/L、14.99 g/L、5.28 g/L、32.81 g/L和14.60 g/L，從EC50的大小可以看出5種殺菌劑的毒力作用的強弱依次為：10億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP＞12%中生菌素WP＞27.12%堿式硫酸銅SC＞46%氫氧化銅WG＞50%氯溴異氰尿酸PX。

表5 5種殺菌劑對病原菌zlm1908的毒力回歸方程

3 討論

檸檬屬柑橘類水果，具有獨特的風(fēng)味，富含多種維生素、類胡蘿卜素、類黃酮等生物活性成分，有生津解暑、助消化、預(yù)防心血管硬化、預(yù)防口腔潰瘍、緩解疲勞及美容養(yǎng)顏等多種功效，除直接鮮食和切片泡水外，檸檬還廣泛用于制作飲料、提取精油和入藥等，是藥食兼用的功能性水果，深受消費者喜愛[21]。由于柑橘潰瘍病的危害，檸檬的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和布局受到很大的限制，為了深入研究潰瘍病菌在檸檬上的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和作用機制，詳細調(diào)查研究湛江地區(qū)大力發(fā)展檸檬種植業(yè)的前景和風(fēng)險，本文對檸檬葉片上疑似潰瘍病病菌進行了分離鑒定和室內(nèi)防治藥劑篩選。本試驗證實在所有的供試藥劑中，產(chǎn)自撒爾夫（河南）農(nóng)化有限公司的10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)毒力作用最強，最高抑制率可達68%。吳明瓊等[22]在篩選柑橘潰瘍病菌拮抗細菌試驗中發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對潰瘍病菌都有較好的抑菌效果。Caicedo等[23]認為枯草芽孢在植物體內(nèi)抑制柑橘潰瘍病菌的毒力作用可能與細菌附著及生物膜形成的改變有關(guān)。芽孢桿菌作為最有應(yīng)用前景的生防細菌，在黃瓜棒孢葉斑病、辣椒疫病、香蕉枯萎病等很多植物病害的防治中表現(xiàn)出良好的抑菌效果[24-26]。關(guān)于枯草芽孢桿菌的抑菌機制可能與該菌能在植物體內(nèi)及植物生長的土壤中快速、大量繁衍和定植，并通過營養(yǎng)競爭和空間位點競爭有效地阻止病原微生物的繁殖，干擾植物病原微生物對植物侵染，破壞病原微生物在植物上的定殖，從而達到良好抑菌效果[27]。隨著人們對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)要求的不斷提高，芽孢桿菌將在農(nóng)藥領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，未來將在柑橘潰瘍病和其他病害生物防治及農(nóng)藥的安全使用和環(huán)境保護方面有著良好的應(yīng)用前景。

農(nóng)用抗生素及其衍生物也是生產(chǎn)上用來進行柑橘潰瘍病防治的主要藥劑，主要包括鏈霉素、硫酸鏈霉素、中生菌素、土霉素、四環(huán)素等。不同農(nóng)用抗生素對柑桔潰瘍病的防治效果因使用地域不同，濃度不同、藥品生產(chǎn)廠家不同等差別較大，尤華峰等[5]進行室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)72%農(nóng)用鏈霉素WP對柑橘潰瘍病菌沒抑制活性，但普通的生物試劑鏈霉素、四環(huán)素稀釋32000倍以后持續(xù)抑菌期超過14天。任建國等[28]發(fā)現(xiàn)來自重慶成都3個不同廠家的72%農(nóng)用鏈霉素WP均無抑菌效果，但購于圣豐化學(xué)（河南）有限公司的潰枯寧（有效成分10%農(nóng)用鏈霉素）1000倍稀釋液對潰瘍病菌有較強的抑制效果。鐘德志等[29]在浙江使用72%農(nóng)用鏈霉素WP發(fā)現(xiàn)抑菌效果非常明顯。除了鏈霉素外，其他農(nóng)用抗生素如0.3%的四霉素AS，3%中生菌素可濕性粉劑室內(nèi)測定結(jié)果顯示都對柑桔潰瘍病菌有非常強的抑制效果[30]。本實驗結(jié)果也證實12%中生菌素WP防治效果僅次于枯草芽孢桿菌，防治效率最高達60.5%。

銅制劑如堿式硫酸銅和氫氧化銅等因其具有粘附性好、毒性低等特點，也經(jīng)常作為藥物來抑制各類植物病原菌。有研究表明，金屬離子可作為細菌蛋白的輔基或輔助因子參與黃單胞桿菌的代謝過程，從而影響該病原菌對寄主的致病性[31-32]。Heydarpanah等[33]采用離體防治和活體接種兩種方法研究了波爾多混合物、三氯氧化銅和硫酸銅等3種銅制劑對柑橘潰瘍病菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波爾多混合物在柑橘潰瘍病的防控方面表現(xiàn)出很好的抑菌效果。Behlau等[34]通過不同時段噴灑不同的銅制劑探究其對Xcc的功效發(fā)現(xiàn)，在不同時間，銅對柑橘潰瘍病的影響有所差異，但總體上，柑橘潰瘍病在葉片上的發(fā)病率與銅噴霧的總量呈線性反比關(guān)系。在選用27.12%堿式硫酸銅SC、77%硫酸銅鈣WP、20%噻菌銅SC與47%春雷.王銅WP這4種藥劑對海南瓊中綠橙潰瘍病進行田間藥效對比試驗中發(fā)現(xiàn)供試的4種藥劑對潰瘍病菌的防治效果均高于70%，且春雷.王銅因具有保護和治療雙重作用，其防效優(yōu)于堿式硫酸銅，因此可在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用[35]。結(jié)合本試驗毒力測定試驗結(jié)果表明27.12%堿式硫酸銅SC和46%氫氧化銅WG最高防效分別可以達到79.1%和64.3%，甚至超過枯草芽孢桿菌的最高防治效率，說明銅制劑確實對柑橘潰瘍病菌株有良好的抑制效果，可作為防控柑橘潰瘍病的有效藥劑。至于不同的銅制劑以及不同實驗中相同的銅制劑表現(xiàn)出的防治效率的差異可能跟與菌株的致病性、菌株所處的環(huán)境、試驗條件、或農(nóng)藥生產(chǎn)廠家及農(nóng)藥制作工藝等不同有關(guān)。氯溴異氰尿酸在植物表面釋放的酸類物質(zhì)對病原菌有一定的抑制作用且對植物和環(huán)境危害較小，因此該類藥劑可以用在病害初期來預(yù)防和控制柑橘潰瘍病。據(jù)報道，在選用50%氯溴異氰尿酸防治柑橘潰瘍病時發(fā)現(xiàn)該藥劑對潰瘍病菌有良好的防控作用，其防效最高可達66.6%[36]。本試驗在選用50%氯溴異氰尿酸抑制潰瘍病菌的試驗中發(fā)現(xiàn)，該藥劑雖然是所選5種藥劑中抑制效果最弱的，但最高的防治效率仍然可以達到55.9%。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明從疑似柑橘潰瘍病病斑的檸檬病葉上所分離到的菌株zlm1908，通過對其形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標測定和分子生物學(xué)鑒定其為柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種(Xcc)，是引起湛江地區(qū)檸檬上產(chǎn)生柑橘潰瘍病病斑的病原菌。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明供試的5種藥劑對檸檬潰瘍病菌zlm1908都有一定的抑制效果，從EC50的大小可以看出5種殺菌劑的毒力作用的強弱依次為：10億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP，12%中生菌素WP，27.12%堿式硫酸銅SC，46%氫氧化銅WG和50%氯溴異氰尿酸PX。由此可見不同的化學(xué)藥劑在一定程度上對柑橘潰瘍病菌都有一定的抑制效果，但無論是生防菌、抗生素還是化學(xué)藥劑在室內(nèi)毒力測定中EC50都相當(dāng)高，最高防治效率除50%氯溴異氰尿酸外均超過60%。但實驗過程中也發(fā)現(xiàn)供試藥劑的防治效率都跟藥品的使用濃度呈正相關(guān)，當(dāng)供試藥劑的濃度設(shè)置較低時，對柑橘潰瘍病菌菌株zlm1908的抑制效果不明顯，因此推測在田間試驗中，在環(huán)境條件要求的濃度范圍內(nèi)使用時，這5種藥劑對柑橘潰瘍病的實際防治效果應(yīng)該不理想。雖然室內(nèi)毒力測定結(jié)果可以直接為田間用藥提供理論參考，但是室內(nèi)毒力測定畢竟是離體情況下測定殺菌劑對柑橘潰瘍病菌的抑制作用，不能等同于大田實際防治效果，大田使用時會因為病原菌濃度差異、寄主植物的作用、田間氣候、藥劑的附著及滲透力等因素而表現(xiàn)出與室內(nèi)不同的作用效果，因此這5種藥劑在田間對柑橘潰瘍病的防治效果，還需要通過進一步的田間實驗來證實。