微小RNA-6783-3p通過靶向Ⅲ型纖維連接蛋白域蛋白1基因表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移

顧園 常城 滕小軍 黃耿 王品發(fā)

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科435000

胃癌起源于胃黏膜上皮細(xì)胞，是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高［1］。胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的重要因素［2］。因而，探究胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)胃癌的治療具有重要臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種18～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA［3］。miRNA通過誘導(dǎo)形成靶基因mRNA的沉默復(fù)合體，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［4］。研究顯示，miR-6783-3p在肺腺癌、肝癌中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、化療敏感性有關(guān)［5］。miR-6783-3p在胃癌中的表達(dá)和功能尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察miR-6783-3p是否通過調(diào)節(jié)Ⅲ型纖維連接蛋白域 蛋 白1（fibronectin typeⅢdomain-containing protein 1，F(xiàn)NDC1）基因表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 胃癌細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒、超敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司；miR-6783-3p模擬物、陰性對(duì)照序列、FNDC1 mRNA 3’-UTR野生型（FNDC 1-WT）序列及FNDC1 mRNA 3’-UTR突變型（FNDC1-MT）序列購(gòu)于上海吉瑪有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將BGC823細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823細(xì)胞，按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列（對(duì)照組）和miR-6783-3p模擬物（試驗(yàn)組）。

1.3 qRT-PCR檢 測(cè)miR-6783-3p和FNDC1 mRNA的表達(dá) 在細(xì)胞中加入1 ml TRIzol，提取總RNA，定量檢測(cè)后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-6783-3p以U6作為內(nèi)參照，F(xiàn)NDC1 mRNA以GAPDH作為內(nèi)參照。miR-6783-3p：正向引物5’-CUACAGAGGAGAAGCCCA-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6：正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；FNDC1：正向引物5’-GCCAAGGCATGTGAAACTGC-3’，反向引物5’-CTGGTAGCATCTTTGGGTGGG-3’；GAPDH：正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。取引物和cDNA根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書檢測(cè)基因的表達(dá)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK-8法檢測(cè)BGC823細(xì)胞的增殖能力 收集兩組BGC823細(xì)胞，以200μl/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，在隔天相同時(shí)刻行CCK-8法檢測(cè)。每孔加入30μl濃度為5 g/L的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱避光孵育2.5 h，使用酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。

1.5 劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)BGC823細(xì)胞的遷移能力 收集兩組BGC823細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后接種于6孔板。使用200μl槍頭在6孔板底劃痕，加入無血清培養(yǎng)基。于倒置顯微鏡下記錄劃痕的寬度，即0 h劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在同一測(cè)量點(diǎn)記錄劃痕寬度，即24 h劃痕寬度。細(xì)胞劃痕愈合率＝（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 在線工具預(yù)測(cè)miR-6783-3p的靶基因 使用microRNA.org、DIANA-microT在線工具預(yù)測(cè)miR-6783-3p的靶基因，miR-6783-3p的靶基因可能是FNDC1。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-6783-3p的靶基因 構(gòu)建FNDC1-WT和FNDC1-MT熒光素酶表達(dá)載體，將其和/或陰性對(duì)照序列、miR-6783-3p模擬物共轉(zhuǎn)染至BGC823細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，依據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，使用生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取熒光值，計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)靶基因表達(dá) 收集各組BGC823細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)泳道加入40μg總蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。在含5%脫脂奶粉的PBS溶液中封閉3 h，加入一抗在4℃過夜孵育。洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。洗膜后采用ECL化學(xué)法顯色，在顯色凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-6783-3p表達(dá)水平 對(duì)照組和試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞中miR-6783-3p的表達(dá)分別為（1.02±0.12）、（12.75±2.02），試驗(yàn)組miR-6783-3p的表達(dá)是對(duì)照組的12.50倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 miR-6783-3p對(duì)BGC823細(xì)胞增殖的影響 如圖1，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞在第3、4、5天的A值明顯降低（均P＜0.05），提示miR-6783-3p可抑制胃癌BGC823細(xì)胞增殖。在第1、2天，兩組細(xì)胞A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 miR-6783-3p對(duì)BGC823細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-6783-3p對(duì)BGC823細(xì)胞遷移的影響 對(duì)照組和試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞劃痕愈合率分別為（63.55±8.28）%、（28.79±6.26）%。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；表明miR-6783-3p可抑制胃癌BGC823細(xì)胞遷移。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-6783-3p的靶基因 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示，試驗(yàn)組1（野生型+miR-6783-3p）、試驗(yàn)組2（突變型+miR-6783-3p）、陰性對(duì)照組1（野生型+陰性對(duì)照序列）、陰性對(duì)照組2（突變型+陰性對(duì)照序列）熒光素酶相對(duì)活性分別為（1.01±0.10）、（0.40±0.08）和（0.97±0.06）、（1.01±0.13），與試驗(yàn)組1相比，試驗(yàn)組2的熒光素酶相對(duì)活性明顯較低（P＜0.01）；表明miR-6783-3p可互補(bǔ)結(jié)合FNDC1基因mRNA 3’UTR。

2.5 miR-6783-3p對(duì)FNDC1 mRNA表達(dá)水平的影響對(duì)照組和試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞中FNDC1 mRNA的表達(dá)分別為（0.26±0.03）、（1.02±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；表明miR-6783-3p可有效抑制FNDC1 mRNA的表達(dá)。

2.6 FNDC1和增殖、遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blotting結(jié)果（圖2）表明，試驗(yàn)組BGC823細(xì)胞FNDC1蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖蛋白PCNA、Ki67表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Slug、Zeb2表達(dá)降低，提示BGC823細(xì)胞增殖和遷移能力降低。

圖2 miR-6783-3p對(duì)FNDC1蛋白和增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

miRNA可精確調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，同一個(gè)基因也可被多個(gè)miRNA組合調(diào)控，miRNA的表達(dá)對(duì)細(xì)胞正常生物學(xué)行為的維持具有重要意義［3］。胃癌組織具有獨(dú)特的miRNA表達(dá)特性和功能［6］。miRNA在不同惡性腫瘤中的表達(dá)程度不同，因而表現(xiàn)的功能也不相同，既可作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，也可作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生［7］。Dong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，沉默linc01559表達(dá)可促進(jìn)miR-6783-3p的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，miR-6783-3p的表達(dá)水平與肝癌患者的生存率、肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性相關(guān)。Yao等［8］研究發(fā)現(xiàn)，circ_0006427可通過下調(diào)miR-6783-3p的表達(dá)抑制肺腺癌的進(jìn)展。miR-6783-3p對(duì)胃癌增殖和遷移能力的影響尚不清楚。

本研究通過轉(zhuǎn)染miR-6783-3p模擬物后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-6783-3p模擬物后BGC823細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯降低，說明miR-6783-3p可以抑制胃癌BGC823細(xì)胞的增殖和遷移能力。miRNA在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用與其靶基因的功能密切相關(guān)［4］。本研究利用microRNA.org、DIANA-microT在線工具預(yù)測(cè)miR-6783-3p的靶基因，miR-6783-3p可能與FNDC1基因mRNA配對(duì)結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)同樣證實(shí)FNDC1基因是miR-6783-3p的靶基因。FNDC1基因位于6號(hào)染色體，F(xiàn)NDC1蛋白屬于FNDC家族［9］。FNDC1在食管癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織表達(dá)增加，其表達(dá)水平與腫瘤的生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、放療敏感性、化療耐藥性等關(guān)系密切［10］。FNDC1在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌患者的臨床分期、病理分級(jí)正相關(guān)，F(xiàn)NDC1高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-6783-3p模擬物可明顯抑制FNDC1基因表達(dá)。FNDC1基因表達(dá)降低，細(xì)胞增殖蛋白PCNA、Ki67表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Slug、Zeb2表達(dá)降低，提示BGC823細(xì)胞增殖和遷移能力降低。

綜上所述，miR-6783-3p可通過FNDC1抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。miR-6783-3p為胃癌的分子靶向治療提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。