基于克隆文庫(kù)法研究古爾班通古特沙漠藍(lán)藻多樣性

劉樂漢，呂 杰，馬 媛,3*，呂光輝,3

(1 新疆大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2 新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；3 綠洲生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

生物土壤結(jié)皮(biological soil crusts, BSCs)是土壤與藻類、地衣、苔蘚和微生物相互作用形成的復(fù)合有機(jī)體，通常覆蓋在不完全裸露生長(zhǎng)有高等植物之間的土壤表面，結(jié)構(gòu)較薄容易被破壞，在溫帶和熱帶沙漠、濕地、喀斯特地貌分布區(qū)域和地球南北兩極均有發(fā)現(xiàn)[1-2]。在干旱和半干旱區(qū)，隨著生物土壤結(jié)皮中微生物的更替，結(jié)皮粘結(jié)狀態(tài)的方式發(fā)生變化，逐漸由藻類向胞外分泌多糖的粘結(jié)作用轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)藻等荒漠藻產(chǎn)生的藻絲體、地衣菌絲體和苔蘚假根粘連土壤顆粒和土壤生物，使原本疏松的土壤表層變得較為致密，并可以改善土壤表層水分分布狀況，從而影響維管植物的發(fā)芽與定植和上層植被的演替，對(duì)干旱地區(qū)的防沙治沙具有重要意義[3-4]。Eldridge等[5]和吳麗等[6]研究結(jié)果一致表明，荒漠地區(qū)的生物土壤結(jié)皮一般以藻類為先鋒拓殖生物形成的藻類結(jié)皮開始，依次向地衣結(jié)皮和蘚類結(jié)皮發(fā)育演替。在某些局部區(qū)域內(nèi)水分和營(yíng)養(yǎng)充足，蘚類也可直接在藻類結(jié)皮上生長(zhǎng)，形成復(fù)合結(jié)構(gòu)?？梢哉f(shuō)生物土壤結(jié)皮的出現(xiàn)是干旱和半干旱區(qū)流動(dòng)沙漠向固定、半固定沙漠轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，可用來(lái)評(píng)價(jià)或預(yù)測(cè)區(qū)域生態(tài)環(huán)境變化趨勢(shì)[7]。研究表明，土壤中的自養(yǎng)生物可將光合作用同化物釋放到一般碳含量有限的沙漠土壤中，并且部分藻類的生物結(jié)皮是許多沙漠生態(tài)系統(tǒng)中氮素的重要來(lái)源，許多學(xué)者在藍(lán)藻內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有固氮功能nif基因簇，可將空氣中的氮?dú)膺€原為銨態(tài)氮，為周圍沙生植物持續(xù)不斷地提供可利用氮源，促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和流動(dòng)。這種碳氮的運(yùn)移在全球尺度上影響著干旱地區(qū)生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和氣候變化，因此，生物土壤結(jié)皮可被用以監(jiān)測(cè)氣候變化過(guò)程[8-10]。

傳統(tǒng)微生物多樣性和群落組成研究大多基于培養(yǎng)和分離純化的方式進(jìn)行研究，但實(shí)驗(yàn)室內(nèi)純培養(yǎng)的微生物最多是環(huán)境微生物總量的10%，甚至更少，從而限制了對(duì)微生物的全面了解。以往對(duì)微生物鑒定多采用形態(tài)學(xué)鑒定為主，目前隨分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方式比傳統(tǒng)單純的形態(tài)學(xué)鑒定分類更為精確[11-12]。多細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌相對(duì)于其他原核微生物具有高度的形態(tài)學(xué)分化，形態(tài)特征常被作為分類的標(biāo)準(zhǔn)。但一些16S rRNA分析結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果并不一致，形態(tài)學(xué)分類某些群組并非具有單系起源[13]。

16S rRNA基因序列可以快速識(shí)別復(fù)雜的藍(lán)藻群落，但可能無(wú)法區(qū)分親緣關(guān)系較近的藍(lán)藻物種[14]。因此常采用psbA基因引物[15]和ntcA基因引物[16]兩個(gè)功能基因作為補(bǔ)充，已在海洋微型藍(lán)藻分子鑒定方面取得成功，并在淡水微型藍(lán)藻分子鑒定方面也驗(yàn)證有效[17]。針對(duì)沙漠藍(lán)藻的研究報(bào)道較少，Hagemann等[18]以CYA359F和CYA781R為引物，構(gòu)建藍(lán)藻16S rRNA 克隆文庫(kù)，對(duì)以色列內(nèi)蓋夫沙漠西北部不同降水梯度下生物結(jié)皮中藍(lán)藻多樣性進(jìn)行研究，驗(yàn)證CYA359F和CYA781R引物的有效性。此外Zhang等[19]以CYA106F和CYA781R為引物，采用Roche454高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)藍(lán)藻16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，研究古爾班通古特沙漠藍(lán)藻多樣性及分布情況。該研究采用Roche454測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)出400 bp測(cè)序產(chǎn)物，但該引物可擴(kuò)增出690 bp左右長(zhǎng)度的片段，因此未獲得該引物全部序列信息。鑒于以上研究成果，無(wú)法判斷已發(fā)表藍(lán)藻16S rRNA基因引物以及psbA和ntcA基因簡(jiǎn)并引物對(duì)于古爾班通古特沙漠藍(lán)藻分子鑒定的有效性。因此前期針對(duì)藍(lán)藻16S rRNA、psbA和ntcA3個(gè)基因，采用4對(duì)引物以古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮中基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮中不能擴(kuò)增出ntcA基因相應(yīng)片段，其余引物均可擴(kuò)增出相應(yīng)片段。因此本研究采用psbA基因簡(jiǎn)并引物，該引物可以擴(kuò)增出920 bp左右的基因片段，并選擇藍(lán)藻16S rRNA CYA106F和CYA781R引物，該引物可以獲得更多的序列信息。選擇的引物擴(kuò)增片段均大于500 bp，無(wú)法使用主流二代高通量技術(shù)，所以采用克隆文庫(kù)的技術(shù)開展研究。針對(duì)古爾班通古特沙漠10個(gè)樣地進(jìn)行藻類結(jié)皮內(nèi)的藍(lán)藻多樣性進(jìn)行研究，通過(guò)研究驗(yàn)證引物的有效性，并通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析獲得藍(lán)藻多樣性以及古爾班通古特沙漠藍(lán)藻分布情況，并進(jìn)行微生物環(huán)境因子分析，研究藍(lán)藻分布與理化因子相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)樣品古爾班通古特沙漠位于新疆維吾爾自治區(qū)準(zhǔn)噶爾盆地中部，44°15′～46°50′N，84°50′～91°20′E，面積約4.88×104km2，是中國(guó)最大的固定、半固定沙漠。2017年7月，根據(jù)古爾班通古特沙漠中的實(shí)際情況，在可到達(dá)的區(qū)域布設(shè)10個(gè)采樣點(diǎn)，樣點(diǎn)基本可覆蓋整個(gè)沙漠，地理位置見圖 1所示。在沙隴底部采集僅具有明顯藻類結(jié)皮結(jié)構(gòu)土壤樣本，采集時(shí)清理表層沙漠植物凋落物等雜質(zhì)，采集厚度為0～3 cm藻類結(jié)皮結(jié)構(gòu)土層，混勻后分為兩份，一份供藍(lán)藻克隆文庫(kù)構(gòu)建；另一份供理化因子的測(cè)定。

Gur2、Gur3、Gur5、Gur7、Gur8、Gur9、Gur10、Gur11、Gur13、Gur17表示10個(gè)采樣點(diǎn)，海拔分別為463、479、190、619、582、482、469、403、707和539 m圖1 古爾班通古特沙漠10個(gè)采樣點(diǎn)Gur2, Gur3, Gur5, Gur7, Gur8, Gur9, Gur10, Gur11, Gur13 and Gur17 represent ten sample sites, the elevation are 463, 479, 190, 619, 582, 482, 469, 403, 707 and 539 m, respectivelyFig.1 Ten sample sites in the Gurbantunggut Desert

1.1.2 試劑和儀器FastDNA?SPIN Kit for Soil (MP bio, USA)，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa Bio, 大連寶)，pCRTM2.1 vector(Thermo Fisherinvitrogen, USA)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen, 杭州)，HhaI和HinfI(NEB, USA)，DNA Marker(TaKaRa Bio, 大連寶)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增儀(Biometra, GER)，電泳儀(北京六一)，凝膠成像儀(UVP, USA)，pH計(jì)(雷磁, 上海)。

1.2 方 法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定對(duì)采集到的0～3 cm藻類結(jié)皮土層進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定。土壤有機(jī)碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法測(cè)定；土壤全氮采用開氏消煮法測(cè)定；土壤全磷采用酸溶-鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤全鉀采用NaOH堿熔-火焰光度法測(cè)定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用氯化鉀浸提-分光光度法測(cè)定；土壤微生物生物量碳和生物量氮采用氯仿熏蒸浸提法(FE)測(cè)定[20-21]；pH值采用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.2 藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建

采用FastDNA?Spin Kit for Soil對(duì)藻類結(jié)皮土壤DNA進(jìn)行提取，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。分別構(gòu)建藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因克隆文庫(kù)。藍(lán)藻16S rRNA擴(kuò)增引物為CYA106F (5′-CGGACGGGTGA-GTAACGCGTGA-3′)和CYA781R(a)/CYA781R(b) (5′-GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3′/5′-GA-CTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3′)[14]，psbA基因擴(kuò)增引物為psbA86F (5′-TTTATGTGGGTTGGTTCGG-3′)和psbA980R(5′-TGAGCATTACG-CTCGTGC-3′)[17]，以不同樣點(diǎn)提取出的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和條件均按文獻(xiàn)報(bào)道，每個(gè)樣點(diǎn)平行3個(gè)PCR擴(kuò)增。分別混合不同樣點(diǎn)3個(gè)平行擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，將目的基因與pCR2.1 T-載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選與PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，最終構(gòu)建藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因克隆文庫(kù)。篩選獲得的陽(yáng)性克隆子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HhaI和HinfI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行2輪酶切，產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將不同電泳帶型對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆子送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。所得藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因序列去除嵌合子后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用CD-HIT(http://weizhongli-lab.org/cd-hit/)軟件對(duì)藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因序列進(jìn)行聚類分析，相似性高于97%歸為相同OTU(operational taxonomic unit)。在每一類OTU中選擇一條代表性序列進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，選取相似性高且具有明確分類地位的序列信息作為標(biāo)準(zhǔn)序列，利用Mega 7.0軟件選擇鄰接法(Neighbor-Joining)聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過(guò)Blast比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果，將克隆文庫(kù)鑒定藍(lán)藻的種類在門、目、科、屬不同分類水平上進(jìn)行分類。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析采用R語(yǔ)言基于hclust函數(shù)的最長(zhǎng)距離法(complete)(其中兩點(diǎn)間距離用定性定量距離法(binary))對(duì)10個(gè)樣點(diǎn)藍(lán)藻種類進(jìn)行層次聚類分析。基于Unifrac距離矩陣對(duì)10個(gè)不同樣點(diǎn)所獲藍(lán)藻種類進(jìn)行聚類分析，使用環(huán)境因子和藍(lán)藻屬水平豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行RDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮土壤理化性質(zhì)差異分析

SOC.土壤有機(jī)碳；TN.全氮；NH4+-N.銨態(tài)氮；硝態(tài)氮；TP.全磷；TK.全鉀；MBC.微生物量碳；MBN.微生物量氮圖2 古爾班通古特沙漠土壤理化性質(zhì)SOC. Soil Organic Carbon； TN. Total Nitrogen； NH4+-N. Ammonium Nitrogen； Nitrate Nitrogen； TP. Total Phosphorus；TK. Total Potassium； MBC. Microbial Biomass Carbon； MBN. Microbial Biomass NitrogenFig.2 Soil physical and chemical properties of Gurbantunggut Desert

除此之外，計(jì)算藻類結(jié)皮土壤被測(cè)元素化學(xué)計(jì)量比，其中土壤C∶N Gur10樣點(diǎn)最高且與其他樣點(diǎn)有顯著性差異，其余樣點(diǎn)均無(wú)顯著性差異，P∶K 10個(gè)樣點(diǎn)較為一致。土壤C∶P，樣點(diǎn)Gur10和Gur2顯著高于其余8個(gè)樣點(diǎn)(P<0.05)，Gur13最低。土壤N∶P，樣點(diǎn)Gur11顯著高于其他樣點(diǎn)(P<0.05)。土壤C∶K，樣點(diǎn)Gur2和Gur10顯著高于其他樣點(diǎn)(P<0.05)。土壤N∶K，樣點(diǎn)Gur13最高，Gur10最高，二者差異顯著(P<0.05)。從結(jié)果可以得出古爾班通古特沙漠不同位置藻類結(jié)皮土壤理化性質(zhì)和元素化學(xué)計(jì)量比均存在一定差異，為斑塊化分布，可能是由于采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)小尺度上景觀格局存在差異。

2.2 藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因克隆文庫(kù)及系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究共獲得古爾班通古特沙漠藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因分別為116條和86條，16S rRNA基因序列注冊(cè)號(hào)為MT740501-MT740616，psbA基因注冊(cè)號(hào)為MT783310-MT783395，針對(duì)藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 3和圖 4所示。藍(lán)藻16S rRNA基因聚類結(jié)果如圖3所示，從古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮土壤中獲得的藍(lán)藻16S rRNA基因?qū)儆谒{(lán)藻門(Cyanophyta)，藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)的顫藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)和色球藻目(Chroococcales)的3個(gè)目，分屬于席藻科(Phormidiaceae)、偽枝藻科(Scytonemataceae)、色球藻科(Chroococcaceae)、顫藻科(Oscillatoriaceae)、念珠藻科(Nostocaceae)、聚球藻科(Synechococcaceae)和戈芒藻科(Gomontiellaceae) 7個(gè)科和一個(gè)未分類單元，又分別隸屬于顫藻屬(Oscillatoria, 42.54%)、微鞘藻屬(Microcoleus, 37.16%)、聚球藻屬(Synechococcus, 3.18%)、紫管屬(Porphyrosiphon, 2.69%)、鞘絲藻屬(Lyngbya, 2.69%)、偽枝藻屬(Scytonema, 2.20%)、擬色球藻屬(Chroococcidiopsis, 2.20%)、席藻屬(Phormidium, 0.73%)、瘦鞘絲藻屬(Leptolyngbya, 0.73%)和念珠藻屬(Nostoc, 0.73%) 10個(gè)藍(lán)藻屬。其中有明確分類地位的藍(lán)藻占總克隆文庫(kù)的94.85%，Uncultured類群占5.15%，顫藻屬和微鞘藻屬為古爾班通古特沙漠中的優(yōu)勢(shì)屬。

圖中黑色箭頭由代表性序列與標(biāo)準(zhǔn)序列聚類合并所得，箭頭越大表示與標(biāo)準(zhǔn)序列聚類在一起的代表性序列越多。下同圖3 Neighbor-joining法構(gòu)建古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮藍(lán)藻16S rRNA基因克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育樹The black arrows in the figure are obtained by clustering representative sequences and standard sequences together, the lager arrow showed that the more representative sequences are clustered together with the standard sequence. The same as belowFig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on Cyanophyta 16S rRNA gene clone library in Gurbantunggut Desert biological soil crusts

圖4 Neighbor-joining法構(gòu)建古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮藍(lán)藻psbA基因克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on Cyanophyta psbA gene clone library in Gurbantunggut Desert biological soil crusts

藍(lán)藻psbA基因序列聚類結(jié)果如圖 4所示，從古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮中獲得的藍(lán)藻psbA基因?qū)儆谒{(lán)藻門，藍(lán)藻綱的顫藻目和念珠藻目，分屬于顫藻科、念珠藻科、戈芒藻科(Gomontiellaceae)和席藻科，又分別隸屬于顫藻屬(36.05%)、念珠藻屬(1.20%)、發(fā)毛針藻屬(Crinalium, 1.20%)和微鞘藻屬(61.63%)4個(gè)屬。同樣地，顫藻屬和微鞘藻屬為古爾班通古特沙漠中的優(yōu)勢(shì)屬。

對(duì)比藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因鑒定結(jié)果，如表1所示，基于藍(lán)藻16S rRNA基因共鑒定出3目，6科，10屬的沙漠藍(lán)藻；而基于psbA基因共鑒定出3目，4科，4屬沙漠藍(lán)藻。綜合二者鑒定結(jié)果，從古爾班通古特沙漠藻類土壤結(jié)皮中獲得的藍(lán)藻隸屬于3目7科11屬和一個(gè)未分類藍(lán)藻群。此外基于psbA基因鑒定出的戈芒藻科的發(fā)毛針藻屬是采用16S rRNA基因未鑒定出來(lái)的種類。綜合聚類統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以得出，基于psbA基因鑒定沙漠藍(lán)藻結(jié)果偏少，因此本研究著重采用16S rRNA基因鑒定結(jié)果對(duì)古爾班通古特沙漠中藻類結(jié)皮多樣性進(jìn)行研究。

表1 藍(lán)藻16S rRNA和psbA基因鑒定結(jié)果對(duì)比

2.3 古爾班通古特沙漠藍(lán)藻多樣性及其分布

基于16S rRNA基因分類結(jié)果統(tǒng)計(jì)10個(gè)樣點(diǎn)藻類結(jié)皮中藍(lán)藻的組成及多樣性如圖 5所示。從結(jié)果可得，基于藍(lán)藻16S rRNA基因總共鑒定出3目，6科，10屬的沙漠藍(lán)藻，但10個(gè)樣點(diǎn)藻類結(jié)皮中最多鑒定出6個(gè)藍(lán)藻屬和一個(gè)未分類藍(lán)藻群，最少僅含2個(gè)藍(lán)藻屬。每個(gè)樣點(diǎn)所含藍(lán)藻種類不盡相同，其中顫藻屬和微鞘藻屬基本出現(xiàn)在每個(gè)采樣點(diǎn)中，因此認(rèn)為是古爾班通古特沙漠中的藻類結(jié)皮中的優(yōu)勢(shì)屬。10個(gè)樣點(diǎn)中Gur17和Gur2樣點(diǎn)中藍(lán)藻種類較多，Gur9、Gur5和Gur3中包含的藍(lán)藻種類較少，其中Gur2、Gur3、Gur5和Gur17相對(duì)地理位置較近，因此認(rèn)為地理位置并不是影響藍(lán)藻分布的主要因素。

圖5 古爾班通古特沙漠各藍(lán)藻在采樣點(diǎn)中的相對(duì)數(shù)量(基于16S rRNA基因分類結(jié)果)Fig.5 Cyanobacteria relative quantity of sample sites in Gurbantunggut Desert(Based on 16S rRNA gene classification result)

基于Unifrac法對(duì)10個(gè)采樣點(diǎn)藍(lán)藻16S rRNA進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果如圖 6所示，可將10個(gè)采樣點(diǎn)分為五類。第一類為樣點(diǎn)Gur8和Gur9，位于古爾班通古特沙漠西部；第二類為樣點(diǎn)Gur5、Gur3和Gur7聚在一起，主要位于古爾班通古特沙漠的中部；第三類為樣點(diǎn)Gur10和Gur13；第四類為Gur17和Gur2，位于古爾班通古特沙漠南部；第五類樣點(diǎn)Gur11不與其他樣點(diǎn)聚在一起，說(shuō)明Gur11的藍(lán)藻多樣性與其他樣地差異較大。綜合來(lái)看，聚類結(jié)果主要是以古爾班通古特沙漠不同位置進(jìn)行聚類，可能是由于沙漠不同樣地小的景觀格局差異所致。

圖6 采樣點(diǎn)聚類樹(基于16S rRNA基因分類結(jié)果)Fig.6 Clustering tree of sampling sites (Based on 16S rRNA gene classification result)

2.4 古爾班通古特沙漠土壤理化性質(zhì)對(duì)結(jié)皮藍(lán)藻生物多樣性的影響

圖7 土壤環(huán)境因子與藍(lán)藻多樣性的RDA分析Fig.7 RDA analysis of soil environmental factors and cyanobacterial diversity

3 討 論

古爾班通古特沙漠主要以各種類型的固定、半固定沙壟和沙丘分布為主。有研究結(jié)果表明固定和半固定沙丘結(jié)皮中的微生物數(shù)量遠(yuǎn)大于流動(dòng)沙丘表層[10]，而且固定沙丘結(jié)皮層酶活性也比流動(dòng)沙丘表面高，微生物活動(dòng)比較活躍[7]。古爾班通古特沙漠的藻類多樣性高于其他沙漠，其中藍(lán)藻在生物土壤結(jié)皮中占優(yōu)勢(shì)地位并發(fā)揮著重要的生態(tài)作用。

3.1 古爾班通古特沙漠生物土壤結(jié)皮土壤生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征比較

本研究結(jié)果表明，古爾班通古特沙漠藻結(jié)皮土壤中有機(jī)碳、全氮、全磷含量均低于全國(guó)北方典型風(fēng)沙區(qū)土壤有機(jī)碳、全氮、全磷平均含量[22]，說(shuō)明古爾班通古特沙漠腹地土壤營(yíng)養(yǎng)極度貧瘠。其次本研究藻類結(jié)皮土壤中有機(jī)碳和全氮含量差異較大，說(shuō)明古爾班通古特沙漠中不同位置藻類結(jié)皮土壤營(yíng)養(yǎng)元素分布不均一。在這種空間上不同區(qū)域內(nèi)沙漠土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成和含量的不均一，導(dǎo)致生物土壤結(jié)皮發(fā)育狀況差異較大。一般沙隴底部營(yíng)養(yǎng)較坡地和隴頂豐富，生物結(jié)皮發(fā)育較好[23]。

此外不同采樣點(diǎn)藻類結(jié)皮土壤C∶N不存在顯著差異，其比值均低于中國(guó)北方典型風(fēng)沙區(qū)C∶N的最小值1.05[22]。王紹強(qiáng)等研究結(jié)果表明土壤C∶N與有機(jī)質(zhì)分解速率存在反比關(guān)系[24]，說(shuō)明古爾班通古特沙漠藻類結(jié)皮土壤有機(jī)質(zhì)分解速率相近且分解速度較慢。土壤C∶P同樣較低，可能是不同采樣點(diǎn)中有機(jī)碳含量普遍較低進(jìn)而導(dǎo)致C∶P變小。土壤N∶P可有效預(yù)測(cè)土壤養(yǎng)分限制類型，古爾班通古特沙漠不同藻結(jié)皮土壤中N∶P存在差異，但該比值總體偏小，是因?yàn)橥寥乐械肯鄬?duì)較低，而磷含量相對(duì)較為豐富，因此古爾班通古特沙漠主要表現(xiàn)為氮限制土壤類型。

3.2 古爾班通古特沙漠生物土壤結(jié)皮中藍(lán)藻多樣性組成及分布

本研究采用非培養(yǎng)的方法所獲藍(lán)藻種類比張丙昌等采用培養(yǎng)法獲得的種類較少[23]。推測(cè)可能克隆文庫(kù)法僅獲得了藻類結(jié)皮中的優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻種屬，未分離獲得或者未檢測(cè)到極低豐度藍(lán)藻，后續(xù)可采用高通量測(cè)序的方法開展研究。從研究結(jié)果可以看出，顫藻屬和微鞘藻屬基本在全部樣點(diǎn)都有分布，并且在總克隆文庫(kù)中所占比例較高，為古爾班通古特沙漠廣布種，此結(jié)果與張丙昌研究成果一致[23]，其余藍(lán)藻屬僅分布在個(gè)別樣點(diǎn)。朱震達(dá)先生提出的“就地起沙”論點(diǎn)[25]，古爾班通古特沙漠不同區(qū)域沙物質(zhì)礦物組成特征因地而異，同一區(qū)域內(nèi)沙丘沙和丘間地沙物質(zhì)組成之間較為相似，由此推測(cè)本研究鑒定獲得的一些藍(lán)藻屬與沙物質(zhì)僅在局部遷移，為沙漠局部分布種。值得注意的是16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹中微鞘藻屬并沒有單獨(dú)聚為一枝，而與席藻屬和擬色球藻屬等藍(lán)藻有密切聯(lián)系，此結(jié)果與美國(guó)科羅拉高原和奇瓦瓦沙漠等地研究結(jié)果一致[26]。研究結(jié)果表明，生物土壤結(jié)皮中藍(lán)藻會(huì)隨環(huán)境變化導(dǎo)致生態(tài)位分化，微鞘藻隨著全球變暖發(fā)生變異，以更好地適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變化[27]。Gur11和Gur13中土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮非常低，說(shuō)明生物結(jié)皮處于早期發(fā)育階段；而環(huán)境條件良好養(yǎng)分充足的區(qū)域，有向地衣結(jié)皮或苔蘚結(jié)皮演替的趨勢(shì)或已經(jīng)完全演替為地衣或苔蘚結(jié)皮，呈現(xiàn)出混生結(jié)皮的狀態(tài)。鄭寧等通過(guò)對(duì)新疆三大山區(qū)及盆地13年的水文資料統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)論，在時(shí)空上新疆盆地可降水量呈增加的趨勢(shì)，特別是1-7月，可降水量逐漸增加[28]，從而有效地改變了沙漠土壤的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，促進(jìn)古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮更快地由藻類結(jié)皮向地衣或苔蘚結(jié)皮演替。隨著地衣或苔蘚的逐漸生長(zhǎng)，消耗結(jié)皮中大量的有機(jī)質(zhì)和氮素，與藍(lán)藻發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致微鞘藻的優(yōu)勢(shì)度下降，而偽枝藻和聚球藻的優(yōu)勢(shì)度會(huì)上升[29]。本研究中樣點(diǎn)Gur2、Gur10、Gur13和Gur17中，有不同比例的偽枝藻和聚球藻出現(xiàn)，與此研究結(jié)果相符。通過(guò)藍(lán)藻psbA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，分類鑒定效果并不理想。已有研究表明，psbA基因在對(duì)于海洋水域中的藍(lán)藻群落分類很成功，但在淡水和干旱區(qū)尚未得到廣泛應(yīng)用，使其在屬水平的分類中難以將應(yīng)有的物種準(zhǔn)確地鑒定分類[15]。

3.3 藍(lán)藻分布與理化因子關(guān)系

BSC對(duì)干旱區(qū)溫帶荒漠系統(tǒng)的穩(wěn)定性和健康狀況有巨大貢獻(xiàn)。在空間尺度上，生物土壤結(jié)皮中的藍(lán)藻群落的組成和結(jié)構(gòu)受當(dāng)?shù)貧夂?、土壤?nèi)部環(huán)境(包括土壤質(zhì)地、pH、濕度，有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等)和人類活動(dòng)的共同影響[1]。本研究選取9種土壤理化性質(zhì)結(jié)合藍(lán)藻多樣性綜合分析古爾班通古特沙漠不同區(qū)域藍(lán)藻群落與土壤性質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，得知在沙漠中南部土壤中養(yǎng)分較為豐富，孕育著豐富的藍(lán)藻種類。絲狀藍(lán)藻顫藻屬和微鞘藻屬為優(yōu)勢(shì)屬，微生物量氮、土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物量碳對(duì)大多數(shù)藍(lán)藻影響程度較大。Baran等[30]的研究表明，成束狀、絲狀的非固氮藍(lán)細(xì)菌微鞘藻是初級(jí)生產(chǎn)者的開拓者，也是生物結(jié)皮形成的主要參與者，同時(shí)可進(jìn)行光合作用固碳，是周圍環(huán)境有機(jī)碳的重要來(lái)源，與本研究結(jié)果相近。已有研究證明微鞘藻很少單獨(dú)存在，在其膠鞘結(jié)構(gòu)上附著許多微生物和藻類與其共生[31]；并且美國(guó)奇瓦瓦沙漠藻類的研究中發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)藻形成的藻際環(huán)境周圍傾向于聚集富營(yíng)養(yǎng)菌[32]，因此藍(lán)藻生存的區(qū)域環(huán)境微生物碳氮含量較高，與本研究RDA分析中微鞘藻屬與微生物量碳氮存在正相關(guān)關(guān)系結(jié)果一致。生物結(jié)皮中的顫藻屬于進(jìn)化后的多細(xì)胞原核生物，具有高等生物所具有的固氮功能，為周圍環(huán)境和生物提供氮素。另外有研究表明，顫藻對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收和利用效率較高[33]，因此藍(lán)藻群落可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身的碳氮代謝過(guò)程向土壤輸送可利用的有機(jī)物，以此來(lái)改善土壤性質(zhì)；反過(guò)來(lái)發(fā)育良好、營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤能承載更多的生物。

本研究采用克隆文庫(kù)法對(duì)古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮中藍(lán)藻多樣性以及與周圍環(huán)境相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明，古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮中藍(lán)藻優(yōu)勢(shì)屬較少，僅有顫藻屬和微鞘藻屬，寡種屬較多。在沙漠中南部土壤營(yíng)養(yǎng)豐富，藍(lán)藻群落組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，微生物量氮和土壤有機(jī)碳含量對(duì)藍(lán)藻種類影響程度較大。目前隨著微生物組學(xué)的快速發(fā)展，各類生物結(jié)皮菌群結(jié)構(gòu)和功能正在被深入探索，但還有許多問(wèn)題亟待解決，如生物結(jié)皮中藍(lán)藻與土壤及大氣環(huán)境的碳氮的交流模式是怎樣的？全球變暖背景下，生物結(jié)皮中藍(lán)藻及其他微生物如何應(yīng)對(duì)？這些問(wèn)題的解決才能夠更加深入理解BSC作為“荒漠生態(tài)系統(tǒng)工程師”的價(jià)值，為保護(hù)、改善和恢復(fù)荒漠生態(tài)系統(tǒng)提供理論借鑒。