黃河鯉figla基因表達(dá)分析

呂茜茜，馮世坤

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

卵泡是哺乳動物卵巢上的基本發(fā)育單位，早期卵巢上的卵泡基因調(diào)控開始于生殖細(xì)胞簇和原始卵泡的形成。原始卵泡可以不斷生長，并發(fā)育為初級和次級卵泡。生殖系a因子（figla）是一個螺旋-環(huán)-螺旋堿性轉(zhuǎn)錄因子，在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，是原始卵泡形成所必需的因子之一。在小鼠的雌性性腺中，figla最早表達(dá)于胚胎期的13.5 d，并參與后續(xù)卵泡與生殖細(xì)胞簇的發(fā)育過程[1]。figla的缺失會影響與減數(shù)分裂相關(guān)基因（Sycp5、Rad51、Ybx2）和與卵母細(xì)胞生長分化相關(guān)基因（Nobox、Lhx8、Taf4b）的表達(dá)，造成減數(shù)分裂的異常，損傷DNA并因此導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡[2]。在缺乏figla的小鼠品系中，生殖細(xì)胞的遷移和增殖未受到影響，胚胎性腺發(fā)育正常，然而，在出生后卵母細(xì)胞會迅速凋亡，原始卵泡未能形成，最終導(dǎo)致雌鼠不孕[1]。

基于figla在哺乳類卵巢分化過程中的重要作用，水產(chǎn)科學(xué)工作者也展開了它在硬骨魚類中的研究。在青鳉（Oryzias latipes）中，figla基因在成魚卵巢中大量表達(dá)，但在成魚精巢中不表達(dá)[3]。另外，在其他硬骨魚類中也發(fā)現(xiàn)了figla在卵巢中大量表達(dá)的特征，例如大鱗海豬魚（Halichoeres poecilopterus）、挪威鮭魚（Atlantic salmon Salmo salar）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、原雌瀨魚（protogynous wrasse Halichoeres trimaculatus）、日本鰻鱺（Japanese ell Anguilla japonica）等。在黑綢（Acanthopagrus schlegeli）的研究中發(fā)現(xiàn)，在雄性支持細(xì)胞向雌性濾泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，figla作為關(guān)鍵控制因子，可能在黑綢的性逆轉(zhuǎn)中有重要作用[4]。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）中，figla基因僅在卵巢表達(dá)，在其他組織不表達(dá)；在XY個體過表達(dá)figla基因?qū)е戮影l(fā)生異常，暗示Fig.a通過抑制雄性精子發(fā)生，而在卵巢發(fā)育中有重要作用[5]。在斑馬魚中研究發(fā)現(xiàn)，figla在早期斑馬魚卵巢發(fā)育中起著重要的作用，在由卵母細(xì)胞形成單個卵泡的過程中尤為重要[6]。

黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus），是我國重要的淡水魚類，其雌魚較雄魚長得快。單性養(yǎng)殖可以提高產(chǎn)量，因而很有必要開展黃河鯉性別決定與分化分子機制研究。為了研究figla在黃河鯉卵巢分化過程中的作用，本實驗從已公布的鯉魚基因組數(shù)據(jù)中分離到figla序列，設(shè)計了ORF（Open reading frame）引物，以黃河鯉性腺為模板克隆了f igla基因的ORF序列，并通過同源性比對、系統(tǒng)進(jìn)化分析等對其進(jìn)行分析。通過RT-PCR實驗來分析figla在黃河鯉雌、雄魚不同組織，胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)情況，為后續(xù)figla基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料的收集

本實驗所用黃河鯉均取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，選取健康成魚作為親魚進(jìn)行培育。

在繁殖季節(jié)（每年4～6月份），挑選健康雌雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn)、授精[7]，將得到胚胎在23±2℃，孵化過程中，定期取樣觀察胚胎發(fā)育情況，取不同發(fā)育時期（未受精、受精、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期、心跳期、出膜期）胚胎材料，提取總RNA。凝膠電泳檢測RNA完整性，ND-2000核酸蛋白儀測定其濃度及OD值。

1.2 黃河鯉fi gla基因ORF全長的克隆

根據(jù)NCBI上已公布鯉魚基因組數(shù)據(jù)，分離figla序列，并設(shè)計ORF相關(guān)引物（表1），成魚卵巢總RNA為模板，按照TaKaRa第一鏈cDNA合成試劑盒（RR047A）說明書操作，合成第一鏈cDNA，并用DNA酶去除基因組DNA，隨后以其為模板進(jìn)行PCR，擴增黃河鯉figla。PCR條件如下：94°C預(yù)變性3 min，94°C變性30 s，59°C退火30 s，72°C延伸1 min，循環(huán)35圈；72°C延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并純化，連接、轉(zhuǎn)化，將陽性菌落進(jìn)行測序?；谝勋@得的序列設(shè)計特異性引物（表1），使目的片段在400-600 bp左右，進(jìn)行組織分布以及胚胎發(fā)育時期figla表達(dá)量檢測。

表1 所用引物序列

1.3 黃河鯉f i g la基因氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測序所得黃河鯉figla基因ORF序列，使用MEG軟件進(jìn)行同源性比，利用在線網(wǎng)站（http://www.expasy.ch/tools/）推算其編碼氨基酸序列情況。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 6.0軟件鄰位相連法Neighbor-Joining（bootstrap values為1000）構(gòu)建。

1.4 黃河鯉f i g la基因組織分布

選取健康成魚取各組織（腦、心臟、肌肉、肝臟、脾、腸、性腺、腎臟等），并提取總RNA，按照TaKaRa第一鏈cDNA合成試劑盒（RR047A）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以其10倍稀釋量作為RT-PCR模板。RT-PCR檢測figla在各組織表達(dá)情況。反應(yīng)體系（20μL）：rTaq酶0.3μL，buffer 2μL上、下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 14.7μL；反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性2 min；94℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共28個 循 環(huán)；72℃10 min，4℃10 min。以β-actin為內(nèi)參。

1.5 黃河鯉f i g la基因在不同胚胎期的表達(dá)

以各胚胎期總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA檢測figla表達(dá)量。實驗方法參照1.1和1.4。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸序列比對

使用MegAlign軟件對黃河鯉和其他物種的Figla氨基酸序列進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)與鯉科魚類相似性較高，與其他物種同源性較低。黃河鯉Figla與金線鲃Figla相似性最高（96%），然后為斑馬魚（84.1%），最低的是人（24.2%）。與其他脊椎動物一樣，黃河鯉Figla具有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，但其它區(qū)域在不同物種之間的差異比較大（圖1）。

圖1 黃河鯉與其他脊椎動物的Figla氨基酸序列比對分析

黑色框框及劃線所指區(qū)域為“bHLH”DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域，用灰色或黑色標(biāo)記

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，黃河鯉Figla與其他硬骨魚類聚為一枝，其中與鯉科魚類具為一小支，這與其分類地位一致。

MEGA 6.0構(gòu)建進(jìn)化樹，以黃河鯉Max為外類群

圖2 脊椎動物Figla系統(tǒng)發(fā)生分析

2.3 組織分布

RT-PCR結(jié)果表明，figla在精巢及其他組織中均不表達(dá)，主要表達(dá)于卵巢（圖3）。

圖3 黃河鯉f igla在成體組織中的表達(dá)

2.4 不同胚胎期表達(dá)

以管家基因-actin作為參照基因，通過RT-PCR來檢測figla基因在黃河鯉胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，figla在未受精、受精及卵裂期存在表達(dá)，而后figla幾乎不表達(dá)（圖4），暗示f igla可能是一個母源因子。

圖4 黃河鯉figla在胚胎中的表達(dá)

3 討論

已有的研究表明，在脊椎動物中，性腺的性別決定是一個高度受控的發(fā)育過程。轉(zhuǎn)錄因子Sry和Sox9以及Rspo1/Wnt/β-actin信號分別作為拮抗途徑，從胚胎未分化性腺的共同原基中驅(qū)動一系列分化發(fā)育后，形成卵巢或精巢。其中，雌、雄性通路的拮抗中占優(yōu)勢的一方?jīng)Q定哺乳動物性別分化的方向。在雄性中，位于Y染色體的雄性性別決定基因Sry（sex-determining region on Y chromosome），于交配后12.5 d開始表達(dá)，并激活下游的特異基因Sox9和Fgf9，這些特異基因進(jìn)一步誘導(dǎo)精巢的分化。而在雌性中，卵巢的分化方向則由既彼此獨立，又具有協(xié)同作用的Rspo1/Wnt/β-actin通路以及Fox12激活的雌激素合成通路決定著。在哺乳類，卵巢的分化和維持需要生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的相互作用，在這種cross-talk過程中，生殖細(xì)胞f igla發(fā)揮重要作用[8]。在無脊椎動物向高等脊椎動物進(jìn)化過程中，魚類處于進(jìn)化的初始階段，其中硬骨魚物種數(shù)量占整個脊椎動物物種數(shù)量的一半。已有研究表明，在硬骨魚中，figla也是一個卵母細(xì)胞特定的標(biāo)記因子[9]。

通過分離黃河鯉figla基因全長ORF序列，并進(jìn)行Figla氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，黃河鯉Fig.a和其他物種的同源性較低。黃河鯉f igla的系進(jìn)化分析中，與其他硬骨魚類聚為一枝，這與其分類地位相一致。與此同時，RT-PCR分析表明，黃河鯉figla在卵巢中大量表達(dá)，而在精巢等組織中均不表達(dá)，這種表達(dá)模式跟在小鼠，人類，斑馬魚，青鳉和牙鲆（Paralichthys olivaceus）中的figla的表達(dá)模式基本一致。

有報道表明在胚胎發(fā)育母源mRNA被逐步降解的同時，合子基因組激活并開始轉(zhuǎn)錄，如在小鼠中，母源mRNA的大量降解，以及合子基因的表達(dá)開始于受精后22 h左右和第一次細(xì)胞分裂結(jié)束時；而在斑馬魚中，這個過程發(fā)生在受精后2.75 h和第10次細(xì)胞分裂時[10]。通過對黃河鯉胚胎發(fā)育過程中figla的表達(dá)情況的研究，發(fā)現(xiàn)在未受精、受精及卵裂期三個時期均存在表達(dá)，而后figla幾乎不存在表達(dá)，暗示黃河鯉f igla可能是一個母源性因子。

綜上，本研究通過對黃河鯉Figla氨基酸序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及在雌雄魚不同組織、不同胚胎期表達(dá)的研究為進(jìn)一步揭示figla在黃河鯉卵巢發(fā)育中功能奠定基礎(chǔ)。