市政尾水排污口附近海洋底泥細(xì)菌微生物群落組成研究

徐愛玲，郭明月，宋志文，喬鳳祿，李慧娟

(青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，青島 266033)

底泥作為水體生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，成分極其復(fù)雜，不僅是氮、磷、有機物等營養(yǎng)物質(zhì)的接納庫，也是水體中懸浮顆粒物和化學(xué)污染物的釋放源，更含有豐富的微生物源。底泥微生物是生態(tài)環(huán)境中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要動力，如碳循環(huán)、氮循環(huán)[1]、腐殖質(zhì)分解和合成以及厭氧菌對磷、硫、鐵以及重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化等。底泥微生物作為食物鏈中復(fù)雜的生物群體，對整個生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要的作用。

關(guān)于物候期的變化、產(chǎn)量的提高、品質(zhì)的提升，也與今年葡萄管理和今年的氣候條件有關(guān)，試驗的葡萄園今年無論是施用本然的還是施用化肥的，產(chǎn)量都提高了，同時，檢測手段還不先進(jìn)，所以在研究本然土壤調(diào)理劑的作用的時候要充分考慮這些因素[4]。

青島是我國東部沿海重要的經(jīng)濟中心城市，位于山東半島東南部沿海，東、南瀕臨黃海，海域面積約1.22萬 km2，海岸線總長為816.98 km，海洋旅游業(yè)已經(jīng)成為青島市的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，同時也向海洋環(huán)境提出了更高的要求。青島市的18家污水處理廠均采用直接排?；蛳扰藕雍笈藕５姆绞竭M(jìn)行尾水排放[10]，其高排放量對海域底泥環(huán)境產(chǎn)生巨大影響。因此，本文選取青島市3種不同排海方式市政排污口附近海域底泥作為研究對象，對其細(xì)菌群落組成、優(yōu)勢菌群、致病菌進(jìn)行分析，揭示不同排海方式對細(xì)菌微生物群落和功能細(xì)菌微生物的變化規(guī)律及季節(jié)差異規(guī)律，以期為城市合理尾水排海方式的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及采樣點設(shè)置

設(shè)置三個采樣點，其中A為青島海泊河污水處理廠排污口附近海域，B為青島麥島污水處理廠排污口附近海域，C為青島第二海水浴場雨水排放口附近海域，采樣點附近海域水質(zhì)理化指標(biāo)背景值見表1。其中海泊河污水處理廠采用MSBR處理工藝，處理污水量占全市的40%左右，排水方式為加氯消毒后先排入海泊河后再進(jìn)入膠州灣，出水達(dá)到一級A標(biāo)準(zhǔn)；麥島污水處理廠采用Biostys生物濾池處理工藝，污水經(jīng)預(yù)處理后通過DN1000、長1030 m的管道直接排入深海中，出水達(dá)到一級B標(biāo)準(zhǔn)；第二海水浴場位于匯泉灣東側(cè)的太平灣內(nèi)與八大關(guān)別墅區(qū)相鄰的一處沙灘浴場，為雨水管道直接排污點，作為背景值。

別看我表面上鎮(zhèn)定，心里早就發(fā)毛了。紙里是包不住火的，在我們村，屁大點事都藏掖不住，不用說我也知道，我強奸李金枝的事肯定傳播得像蒼蠅一樣無處不在了。我感覺馬蘭眼里甩出來兩條鞭子，劈劈啪啪抽打著我的全身。

在受不同排海方式的影響下，三個研究區(qū)域底泥樣品的細(xì)菌微生物群落組成進(jìn)行門水平的分類統(tǒng)計如圖2所示。12個底泥樣品中共檢測到35個菌門，其中，在A取樣點(先排河后排海)四季分別檢測出29，31，32，27個菌門，在B取樣點(直接排海)四季分別檢測出27，26，29，28個菌門，在C取樣點(雨水管道排放)四季分別檢測出29，29，31，29個菌門。相對于其他排放方式，直接排放附近海域底泥樣品菌門的數(shù)量較低。主要包括變形菌門( Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門( Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門( Planctomycetes)等，其中變形菌門( Proteobacteria)相對豐度均在36%以上表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢。通過橫向排海方式對比發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門( Firmicutes)在B點(直接排海)相對豐度較高，秋季最高為48.23%超過變形菌門( Proteobacteria)；放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)在C取樣點(雨水管道排放)相對豐度高于其他取樣點；綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門( Planctomycetes)在A取樣點(先排河后排海)的相對豐度遠(yuǎn)高于其他取樣點；其他菌門受排海方式的影響未出現(xiàn)明顯規(guī)律變化。通過縱向四季對比發(fā)現(xiàn)，秋冬季厚壁菌門( Firmicutes)的相對豐度高于春夏季；放線菌門( Actinobacteria) 在夏季的相對豐度遠(yuǎn)低于其他季節(jié)，在C取樣點(雨水管道排放)擬桿菌門( Bacteroidetes)夏季出現(xiàn)驟降現(xiàn)象。

表1 樣品附近海域水質(zhì)理化指標(biāo)背景值

1.2 樣品采集

三個研究區(qū)域底泥樣品的細(xì)菌微生物群落組成綱水平分類統(tǒng)計如圖3所示。12個底泥樣品中共檢測到73個菌綱，其中，在A取樣點(先排河后排海)四季分別檢測出67，81，58，61個菌綱，在B取樣點(直接排海)四季分別檢測出63，59，61，59個菌綱，在C取樣點(雨水管道排放)四季分別檢測出70，76，58，59個菌綱。相對于其他排放方式，直接排放附近海域底泥樣品菌綱的數(shù)量較低。主要由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和擬桿菌綱(Bacteroidia)組成。通過橫向排海方式對比發(fā)現(xiàn)，ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、螺旋菌綱(Spirochaetes)和柔膜菌綱(Mollicutes)在B取樣點(直接排海)的相對豐度明顯高于其他取樣點。通過縱向四季對比發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌綱(Bacilli)和放線菌綱(Actinobacteria)在秋冬季節(jié)的相對豐度明顯高于春夏季節(jié)，而酸微桿菌綱(Acidimicrobiia)只在春夏季節(jié)可以檢測出來。β-變形菌綱(Betaproteobacteria)在冬季的相對豐度明顯高于其他季節(jié)，黃桿菌綱(Flavobacteria)在秋季出現(xiàn)驟降現(xiàn)象。δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的占比在B點(直接排海)夏季出現(xiàn)驟降現(xiàn)象，而梭菌綱(Clostridia)和擬桿菌綱(Bacteroidia)在C取樣點(雨水管道)冬季出現(xiàn)驟增現(xiàn)象。

1.3 總DNA 提取與檢測

三個研究區(qū)域四季底泥樣品中A取樣點(先排河后排海)的Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)在春季、秋季、冬季均高于其他地點的底泥樣品，而夏季C取樣點(雨水管道排放)的Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)高于其他地點的底泥樣品，說明受排海方式的影響，在除夏季之外的季節(jié)，細(xì)菌群落的豐富度表現(xiàn)為：先排河后排海>雨水管道>直接排海；在夏季受雨水季節(jié)以及旅游旺季的影響，雨水管道排放附近海域底泥的群落豐富度較高。縱向季節(jié)對比發(fā)現(xiàn)，底泥樣品的群落豐富度在夏季和冬季最高，秋季次之，春季最低。所有樣品Simpson指數(shù)均在0.981 57～0.997 39之間。通過整體樣品對比發(fā)現(xiàn)，Chao 1和ACE指數(shù)所反映出的細(xì)菌豐富度與稀釋曲線表現(xiàn)的情況一致(表3)。

表2 DNA提取情況

2 結(jié)果與分析

2.1 物種豐度

2.1.1 OTU稀釋曲線

中國在全球奢侈品市場扮演的重要角色已無需解釋，值得注意的是，過去一年，擁抱互聯(lián)網(wǎng)和電商正逐漸成為鐘表行業(yè)的主流趨勢，特別在中國市場，不少代表傳統(tǒng)鐘表業(yè)核心價值的高端品牌正突破以往束縛，大膽試水線上渠道。

隨著測序深度的增加12個樣品的稀釋曲線趨于平緩，表明此時樣品的庫容已經(jīng)涵蓋該位點的絕大部分細(xì)菌菌群。整體來說，B取樣點(直接排放)的OTU數(shù)在四季相對較低，尤其夏秋季節(jié)，說明尾水直接排放處附近海域底泥中細(xì)菌微生物群落豐富度最低(圖1)。

2.1.2 α多樣性分析

稱取約0.25 g的底泥樣品，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取樣品中的總DNA，通過微量核酸蛋白分析儀對提取后的DNA 濃度與純度進(jìn)行檢測，全部DNA樣品波長260 /280 值均在1.7～1.9(表2)。檢測合格的基因組DNA 樣品交由派森諾公司對其進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

表3 樣品菌群微生物α多樣性指數(shù)

2.2 門水平分析

教師們提到，影響小學(xué)教師情緒勞動表現(xiàn)的因素主要有教師與學(xué)生、同事、家長等各種關(guān)系狀況，種種關(guān)系的交織狀態(tài)所形成的教師對學(xué)校文化的自我感知更是影響小學(xué)教師情緒勞動表現(xiàn)的重要因素之一，因此有必要探究小學(xué)教師眼中理想的學(xué)校文化類型，以期更好地助益實踐。下面根據(jù)訪談資料從教師的期望中捕捉有助于他們情緒展現(xiàn)的理想學(xué)校文化特征。

圖2 不同排海方式下底泥樣品在門水平群落分類學(xué)組成和豐度分布

2.3 綱水平分析

分別于2017年11月、2018年1月、7月和11月用已滅菌的柱狀采泥器采集表層(0～20 cm) 底泥樣品，每個斷面采集3—4 個重復(fù)，分離時用活塞自下而上將泥柱推出，并將泥樣每隔5 cm 分層，置于無菌自封袋中，2 h內(nèi)送回實驗室并盡快提取DNA ，用于PCR擴增。

圖3 不同排海方式下底泥樣品在綱水平群落分類學(xué)組成和豐度分布

2.4 種水平分析

底泥是一個物質(zhì)交換頻繁、微生物種類豐富、生物活性高的特殊環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，排海方式為先排河后排海的排污口附近底泥樣品細(xì)菌微生物群落豐富度除夏季外均高于其他排海方式，原因可能是先排河后排海的排海方式交換能力較高、穩(wěn)定性較差，對底泥中微生物有稀釋作用。而夏季在雨水管道排放處群落豐富度最高，考慮由于雨水管道排放處的取樣點為青島第二海水浴場，夏季又是青島旅游旺季，受氣溫和人類活動的影響，其群落豐富度最高，而直接排海有利于提高微生物群落多樣性。顯示底泥樣品的群落豐富度在夏季和秋季最高，春季次之，冬季最低，這與其他研究[11-12]存在顯著差異。其主要原因是受季節(jié)污水處理量的影響，冬季氣溫低，底泥微生物活性較低，城市用水量也較少，而夏秋季受氣溫和人類活動的影響，底泥中細(xì)菌大量生長繁殖，因此夏秋季細(xì)菌群落豐富度偏高；冬季受氣溫和排水量的影響，在氣溫較低排水量減少的情況下，冬季細(xì)菌群落豐富度最低。因此，各區(qū)域的底泥微生物多樣性和豐富度在季節(jié)和空間上存在顯著差異[13]。這與徐愛玲等研究的城市尾水排海過程中的細(xì)菌微生物群落豐富度和多樣性的結(jié)果[9]相一致，由此也可總結(jié)出底泥與水體環(huán)境中微生物多樣性和豐富度相互響應(yīng)。

圖4 不同排海方式下相對豐度大于1%的種水平群落分布

3 討論

對排海方式影響下三個研究區(qū)域四季底泥樣品的細(xì)菌微生物群落組成中相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌種進(jìn)行分類統(tǒng)計如圖4所示。12個樣品共檢測出優(yōu)勢菌種68種，在A點(先排河后排海)四季的底泥樣品中分別檢測出7，2，7，5種，在B點(直接排海)四季的底泥樣品中分別檢測出9，11，11，8種，在C點(雨水管道排放)四季的底泥樣品中分別檢測出1，3，9，10種。整體來說直接排海的排放方式在春、夏、秋季會增加優(yōu)勢菌的種類，而雨水管道排放在冬季會增加優(yōu)勢菌的種類。其中水單細(xì)胞菌(Pelomonasaquatica)和布魯氏菌(Brucellamicroti)在A取樣點冬季樣品中相對豐度分別為16.18%和12.71%，表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢；秋季Lactococcuspiscium在三個取樣點的相對豐度分別為5.57%，11.99%和13.05%，表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，其他季節(jié)沒有發(fā)現(xiàn)。Propionigeniummaris只在A點(先排河后排海)處發(fā)現(xiàn)，秋季B點(直接排海)的優(yōu)勢菌表現(xiàn)出的相對豐度明顯高于其他地點；春季和夏季三個取樣點的樣品所研究的優(yōu)勢菌的相對豐度都小于10%，且變化幅度較小，沒有呈現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。

12個底泥樣品中共檢測到34個菌門，優(yōu)勢菌門主要有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，這與張承銘的研究結(jié)果[14]一致。研究[15]發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes) 豐度與營養(yǎng)化指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而在B取樣點污水處理廠特有的Biostys曝氣生物濾池脫氮除磷[16]導(dǎo)致厚壁菌門(Firmicutes)在直接排海處相對豐度較高。由于放線菌門( Actinobacteria)是革蘭氏陽性細(xì)菌，在有機質(zhì)分解過程中起重要作用[17]，而秋冬季節(jié)是青島第二海水浴場滸苔暴發(fā)的季節(jié)，在一定時間內(nèi)導(dǎo)致有機物含量增加[18]，這也是秋冬季節(jié)放線菌門( Actinobacteria)以及藍(lán)藻門(Cyanobacteria)在雨水排放口相對豐度較高的原因。有研究[19]報道疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)是廣泛存在于底泥環(huán)境中的。冬季氣溫低，底泥中污染物的釋放量和微生物的酶活性均較低，微生物的新陳代謝能力低，導(dǎo)致冬季細(xì)菌微生物群落豐度出現(xiàn)降低現(xiàn)象。

第四，共享經(jīng)濟的運作離不開信息技術(shù)平臺這一關(guān)鍵媒介和載體，互聯(lián)網(wǎng)與信息技術(shù)是保障共享經(jīng)濟順利運行的重要保障，能夠為其帶來很多支持與便利。

由于底泥環(huán)境為兼性厭氧或者發(fā)酵環(huán)境，海水流量以及河流的補給，導(dǎo)致底泥環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生改變[20]，對底泥中的細(xì)菌微生物群落組成產(chǎn)生一定的影響，而直接排海在這三種排海方式中流量最小，因此，直接排放附近海域底泥樣品菌綱的數(shù)量較低，并且變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)等厭氧菌綱在直接排海方式下的相對豐度高于其他取樣點。秋冬季節(jié)是海水富營養(yǎng)化、滸苔暴發(fā)的季節(jié)，底泥中的有機物含量增加，異養(yǎng)菌豐度增加[21]，因此，芽孢桿菌綱(Bacilli)在秋冬季的相對豐度明顯較高。夏季溫度升高，δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的占比在直接排海的方式下夏季出現(xiàn)驟降現(xiàn)象，有研究報道[13]溫度是影響底泥中細(xì)菌群落組成的重要因素。β-變形菌綱(Betaproteobacteria)在冬季的相對豐度明顯高于其他季節(jié)，造成這種現(xiàn)象的主要原因是β-變形菌綱(Betaproteobacteria)中包含腸胃疾病和口腔疾病的致病菌，這符合張乾[22]曾報道胃腸道比較容易在冬季發(fā)難的結(jié)論，冬季氣溫低，河道底泥容易缺氧，并增加梭菌綱(Clostridia)和擬桿菌綱(Bacteroidia)的豐度，這與林國榮等[21]的研究結(jié)果相一致。

三個研究區(qū)域四季底泥樣品的細(xì)菌微生物群落組成中相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌種有68種，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于本課題組前期對尾水的研究[8-9]。可見底泥是微生物的主要棲息地和儲存庫，與尾水水體進(jìn)行能量和物質(zhì)交換，并與水體環(huán)境互相響應(yīng)。而相較于其他尾水排放方式，尾水直接排放對尾水稀釋較快，底泥中營養(yǎng)物質(zhì)濃度較低，故優(yōu)勢菌種數(shù)量相對較低。秋季乳酸乳球菌屬(Lactococcusspp.)在三個研究區(qū)域均表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，乳球菌屬(Lactococcusspp.)是主要發(fā)酵菌劑之一，河道底泥為其生長提供了兼性厭氧環(huán)境，而秋季是水體富營養(yǎng)化的季節(jié)，河道底泥中營養(yǎng)成分較復(fù)雜，促進(jìn)其生長繁殖；有研究[23-25]發(fā)現(xiàn)乳球菌屬(Lactococcusspp.)可以調(diào)節(jié)腸胃、呼吸等功能，對魚類的生長起到促進(jìn)作用。產(chǎn)丙酸菌屬(Propionigeniumspp.)廣泛分布于淡水底泥中，而筆者只在A點(先排河后排海)處發(fā)現(xiàn)，原因可能是先排河后排海處河流流量較大，擴散距離增加促使其生長。

空氣齡(Age of Air)是指房間內(nèi)某點處空氣在房間內(nèi)已經(jīng)滯留的時間，反映了室內(nèi)空氣的新鮮程度，可以用來衡量房間內(nèi)空氣的新鮮程度和通風(fēng)換氣效果，是評價室內(nèi)空氣的重要指標(biāo).這一概念最早是由SANDBERG[9]在20世紀(jì)80年代提出的.某處空氣齡越小，則空氣越新鮮，空氣品質(zhì)也就越好.圖6為各斷面平均空氣齡(Mean Age of Air)分布圖.Y=0.8 m、Y=1.2 m與Y=1.6 m處工作區(qū)平均空氣齡為110～283 s，辦公區(qū)域空氣齡并不是很大，且越接近送風(fēng)口，辦公室內(nèi)的平均空氣齡數(shù)值越小，空氣便越新鮮，空氣品質(zhì)也就越高.

筆者在冬季A取樣點(先排河后排海)發(fā)現(xiàn)致病菌Pelomonasaquatica和Brucellamicroti的占比高達(dá)16.18%和12.71%，水單細(xì)胞菌(Pelomonasaquatica)是皮膚、呼吸道和腸道的主要致病菌；布魯氏菌(Brucellamicroti)可引起人畜共患性全身傳染病，主要表現(xiàn)癥狀為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等，該病進(jìn)入慢性期可能引發(fā)多器官和系統(tǒng)損害，造成不孕不育，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，由于它的廣泛傳播和極大危害已經(jīng)對部分地區(qū)人們的健康和經(jīng)濟造成極大的影響。假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonasspp.)是一種海洋底泥中常見的魚類條件致病菌，由于A取樣點附近海域有水產(chǎn)養(yǎng)殖，該菌屬相對豐度更高一點；而在秋冬季節(jié)致病菌種類和豐度明顯增多。尾水底泥中存在的各種致病菌不僅能降低水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且對附近海域活動的人群健康也有很大威脅，青島作為著名的旅游勝地，建議相關(guān)部門加強對海濱附近海域的致病菌檢測，尤其是人口流量大的區(qū)域。

4 結(jié)論

1) 尾水先排河后排海排放附近海域底泥中細(xì)菌分布在27—32個菌門，58—81個菌綱，四季相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌種分別有7，2，7，5種；尾水直接排海排放附近海域底泥中細(xì)菌分布在26—29個菌門，59—63個菌綱，四季相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌種分別有9，11，11，8種；雨水管道排海排放附近海域底泥中細(xì)菌分布在29—31個菌門，58—76個菌綱，四季相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌種分別有1，3，9，10種，相對于其他排海方式，直接排放處菌門、綱種類數(shù)量較少，優(yōu)勢種的種類較多。除夏季外先排河后排海排放的細(xì)菌微生物群落豐富度最高，雨水管道排放次之，直接排海排放最低。優(yōu)勢菌門有變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢菌綱主要集中在α-變形菌綱、γ-變形菌、δ-變形菌綱和黃桿菌綱。底泥微生物受季節(jié)變化以及排海方式的影響，導(dǎo)致補給水、海水流量、海水環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致底泥環(huán)境以及底泥中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生改變，從而使底泥中的細(xì)菌微生物群落組成發(fā)生改變并隨著季節(jié)呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。

2) 秋冬季節(jié)在尾水間接排放附近海域底泥中檢測出的致病菌Pelomonasaquatica占比高達(dá)16.18%，可引起皮膚、呼吸道和腸道等疾病，同時檢測出的致病菌Brucellamicroti的占比達(dá)到12.71%，是人畜共患性全身傳染病的致病菌，相關(guān)部門應(yīng)該加強對這兩種致病菌的監(jiān)測力度。