家蠶耐氟性抗血液型膿病品系選育研究

黃　凌

家蠶耐氟性抗血液型膿病品系選育研究

黃凌

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院廣西南寧530007）

將家蠶抗血液型膿病品種的抗性親本與耐氟化物品種的抗性親本進(jìn)行雜交，從后代中篩選出兼耐血液型膿病和氟化物的家蠶個體，用系統(tǒng)選育的方法進(jìn)行家蠶抗病性品種選育。經(jīng)測試，新品系2齡起蠶經(jīng)口添食家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡寫為NPV），半數(shù)致死濃度（LC50）為2.18×108個/mL，并且耐受一定濃度的含氟桑葉。在正常環(huán)境條件下，該品系的蟲蛹率與對照932不相上下，但在環(huán)境受NPV污染的情況下，該品系的蟲蛹率明顯高于對照932。因此，經(jīng)本研究表明，品系96·NC99R對血液型膿病和氟化物兼具一定耐受性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性。

家蠶抗病材料；血液型膿??；氟化物

家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡稱為NPV）經(jīng)食下感染或傷口感染后，通常使家蠶于下一齡期發(fā)病或蛹期發(fā)病，100%致死，死蠶尸體污染蠶座致使其他蠶兒感染發(fā)病，嚴(yán)重可使整批蠶感染病毒致死。桑葉受工廠氟化物污染后出現(xiàn)氟化物中毒，蠶兒食下氟化物中毒的桑葉后出現(xiàn)氟化物中毒癥狀，環(huán)節(jié)凸起，發(fā)育開叉大，吐絲量減少，嚴(yán)重的可能不結(jié)繭，產(chǎn)不出受精卵等。不管是NPV感染或是氟中毒，蠶兒一旦發(fā)病或中毒，尚無有效的治療或解毒方法，現(xiàn)階段只有消毒防控和培育抗逆性家蠶品種這兩種有效方式。有研究結(jié)果表明，家蠶耐氟性狀呈部分顯性遺傳，有加性效應(yīng)，由一對耐氟主效基因和若干微基因控制，該耐氟基因與第12連鎖群緊密連鎖，F(xiàn)1代耐氟性與雜種優(yōu)勢呈顯著正相關(guān)，與父本為顯著負(fù)相關(guān)，并且可以較容易地通過表型選拔獲得耐氟性個體[1-5]。與耐氟性相似，家蠶對NPV的抗性同樣受若干微基因和一對主效基因控制，該抗性基因?yàn)轱@性基因，雜交后代（F1代和F2代）對NPV的抗性呈偏父遺傳現(xiàn)象，雜交一代（F1代）的抗NPV性表現(xiàn)出雜交優(yōu)勢，累代添食NPV可提高家蠶品種對NPV的抗性，且經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定[6-7]。至今已培育出的抗NPV家蠶品種或耐氟家蠶品種有桂蠶N2、華康3號、秋豐×白玉和桂蠶F95等[8-11]，然而，這些品種均只是單一的抗血液型膿病或耐氟化物，尚未報道有家蠶品種兼抗兩者。因此，本研究擬將含有抗NPV基因的家蠶品種親本與含有耐氟基因的家蠶品種親本雜交，對其后代進(jìn)行抗NPV和耐氟性篩選，并累代添毒添氟以提高個體的抗病性和耐毒性，采用系統(tǒng)選育的方法選育出兼抗血液型膿病和耐氟化物的家蠶品系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶母種NC99R與96均由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站育成并保存，均為二化性中系品種。其中NC99R攜帶抗NPV顯性主效基因，為抗家蠶血液型膿病品種桂蠶N2的親本之一；96攜帶耐較高濃度氟化物顯性主效基因，為耐氟化物品種桂蠶F95的親本之一。

1.2 飼育方法

96·NC99R和對照932均在平均溫度29 ℃、平均濕度81%的飼育環(huán)境中飼育，1齡～3齡全覆蓋育，4齡半覆蓋育，5齡普通育，每天3回育，并調(diào)查齡期經(jīng)過、簇中經(jīng)過、飼育成績和繭質(zhì)成績。

1.3 抗NPV性篩選與提升

將提純的NPV病毒原液稀釋成3×106個/mL備用（隨配隨用）。添食當(dāng)天摘取新鮮適熟葉，浸泡入制備好的NPV病毒液中，充分浸漬均勻，取出后待桑葉表面水分自然蒸發(fā)后，切成4 cm×4 cm的方塊。2齡餉食第一口葉開始定量添食，每30 頭蠶在24 h內(nèi)一次性喂給4 cm×4 cm的浸漬過NPV的桑葉3 片，待24 h食盡后用新鮮石灰粉消毒蠶座，更換蠶座紙，開始換為普通桑葉正常飼喂，3齡起蠶后淘汰掉不抗NPV的病蠶。

1.4 半數(shù)致死濃度（LC50）的測定

將NPV病毒原液稀釋成1×104個/mL、1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL、1×108個/mL和1×109個/mL共6 個濃度，添食方法同1.3。3齡第2天開始統(tǒng)計死亡與存活的蠶頭數(shù)，每個濃度梯度攻毒2 個重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)區(qū)30 頭蠶。

1.5 耐毒性篩選與提升

準(zhǔn)確稱取氟化鈉（NaF）分析純試劑3 g，加入10 kg清水稀釋后得到300 mg/L的NaF溶液，NaF溶液宜即配即用。將新鮮適熟桑葉浸入300 mg/L的NaF溶液中，充分浸漬10 min后撈出晾干備用。自3齡餉食至3齡眠下，連續(xù)添食制備好的含氟桑葉（實(shí)測含氟量237 mg/L），過程中選留不出現(xiàn)氟化物中毒癥狀的家蠶個體。

1.6 統(tǒng)計分析

獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過MicrosoftExcel 2007軟件錄入和處理，半數(shù)致死濃度的計算參考Reed-Muench法。添食NPV病死率與蟲蛹率的顯著性分析用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行計算，所用軟件為SPSS 24.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 品系96·NC99R的選育

以含有耐氟化物基因載體的家蠶母種96為母本、以含有抗NPV基因載體的家蠶母種NC99R為父本，雜交的后代（暫命名為96·NC99R）為F1代。為了固定新品系的耐氟能力，再以96為父本連續(xù)回交3次，使后代中耐氟化物品種的理論遺傳成分占93.75%，抗NPV品種的理論遺傳成分占6.25%（見表1）。

表1回交后代群體中2個親本的遺傳成分理論值

飼養(yǎng)時間回交次數(shù)世代親本遺傳成分占比/%回交后代基因型組成NC99R96 2017.30F15050NnFf 2017.51BC12575NnF_ 2017.62BC212.587. 5NnF_ 2017.93BC36.2593.75NnF_

注：含有抗NPV主效基因的家蠶品種的基因型為NNff，含有耐氟化物主效基因的家蠶品種的基因型為nnFF，其中N對n為顯性，F(xiàn)對f為顯性，F(xiàn)_表示基因型為FF或Ff。

最后一次回交的后代設(shè)定為B1世代，從B1世代開始，進(jìn)行抗病性和耐毒性的選拔提高。2齡餉食經(jīng)口添食NPV攻毒篩選抗性個體，3齡期添食含氟桑葉篩選耐毒性個體（詳見材料與方法1.3和1.5）。B1～B6世代全部混區(qū)飼養(yǎng)，混區(qū)制種。

2.2 抗血液型膿病的鑒定

在添食NPV濃度為106個/mL的數(shù)量級下，品系96·NC99R與對照932的死蠶率見表2。品系96·NC99R的病死率平均為7.14%，對照932的病死率平均為69.91%[12]，差異極顯著（<0.01），說明96·NC99R的抗NPV性高于932，兩個品系的抗病性有差異，且差異極顯著。將NPV病毒原液稀釋成1×104個/mL、1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL、1×108個/mL和1×109個/mL的6個濃度進(jìn)行添食處理（結(jié)果如表3所示），按Reed-Muench法計算出品系96·NC99R的半數(shù)致死濃度為2.19×108個/mL。

如表4所示，在蠶室受NPV污染的情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲蛹率為43.93%，而對照932的蟲蛹率為6.94%，差異極顯著（<0.01）；在正常情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲蛹率為89.41%，而對照932的蟲蛹率為90.25%，差異不顯著（>0.05）?？梢娫谡Ｇ闆r下，96·NC99R的蟲蛹率和對照932不相上下，而在遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲蛹率與對照932的蟲蛹率差異極顯著，而且新品系的蟲蛹率要高于對照932，說明96·NC99R的抗NPV性優(yōu)于對照932。

表2品系96·NC99R與對照的抗病性比較

品種名NPV濃度/個/mL死蠶數(shù)活蠶數(shù)死蠶率/% 96·NC99R3×1064527.14 對照932[12]3×10641718069.91

注：對照932的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)摘自文獻(xiàn)《家蠶抗氟品種“桂蠶F95”的選育研究》[12]。

表3品系96·NC99R添食NPV梯度濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

病毒稀釋度/個/mL1×1041×1051×1061×1071×1081×109 接毒蠶數(shù)273029263026 活蠶數(shù)252525212420 NPV死蠶數(shù)254566

表4品系96·NC99R與對照932的飼養(yǎng)情況比較

飼養(yǎng)條件蟲蛹率/% 96·NC99R對照932 蠶室正常情況89.4190.25 蠶室受NPV污染43.936.94

2.3 耐氟化物的鑒定

3齡起蠶淘汰掉不抗NPV的家蠶個體后，就開始進(jìn)行氟化物的添食篩選（詳見材料與方法1.5）。從圖1中可以看出，添食氟化鈉后，96·NC99R和932都出現(xiàn)了環(huán)節(jié)凸起等氟中毒現(xiàn)象（圖1中C和D），但932的蠶頭數(shù)明顯比96·NC99R少，而且蠶個體明顯比96·NC99R瘦小，發(fā)育不齊（圖1中A和B）。在添食NPV又連續(xù)添食氟化鈉后，932蠶無法結(jié)繭化蛹，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的氟化物中毒癥狀。

（A、C：添食氟化物后的96?NC99R。B、D：添食氟化物后的932。）

3 討論

本研究用兩個抗性親本雜交，使得抗NPV顯性基因與耐氟顯性基因均整合至96·NC99R上，為鞏固F1代的耐氟性又與96親本進(jìn)行連續(xù)三代回交，回交后代在高溫多濕環(huán)境下飼養(yǎng)，通過累代添氟添毒，選拔抗性個體進(jìn)行留種繼代，以提升新品系的抗病性和耐毒性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，新品系的食下感染半數(shù)致死濃度為2.19×108個/mL，比它的抗病親本NC99R低[8]。在添食NPV濃度為106個/mL的數(shù)量級下，新品系96·NC99R的病死率比兩廣二號的親本932低62.77%，差異極顯著（<0.01），說明品系96·NC99R與932的抗病性有極顯著差異。在正常情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲蛹率比932低0.84%，差異不顯著（>0.05）；在蠶室遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲蛹率比932高36.99%，差異極顯著（<0.01），說明96·NC99R與932的蟲蛹率可能存在差異，但差異還未達(dá)到顯著水平。而96·NC99R的抗病性與932的抗病性差異極顯著，說明品系96·NC99R含有抗NPV主效基因，對NPV有相當(dāng)好的抗性。3齡起蠶至3齡眠下連續(xù)添食含氟桑葉，進(jìn)行耐氟性篩選，通過累代篩選出耐氟化物個體留種繼代，可以逐步提升96·NC99R品系的耐氟性。

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2095-1205(2021)08-01-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2021.08.01