高鐵脅迫對甜菜幼苗生長及保護系統(tǒng)的影響

耿 貴，王 堽，董寅壯，范國凱，於麗華，王宇光

（1黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgarisL.)，一種主要的糖料作物和經(jīng)濟作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中占有重要地位[1]。在中國，甜菜種植主要分布于北方地區(qū)，而南方地區(qū)少有栽培，其原因之一是甜菜更適應北方地區(qū)中性偏堿土壤環(huán)境[2]。因此，在農(nóng)業(yè)種植和農(nóng)業(yè)推廣上土壤pH等理化性質(zhì)是一個重要的受限因素[3]。酸性土低pH環(huán)境能使鐵、錳、鋁等大量的金屬離子富集，使植物生長受到重金屬離子的毒害[4]。在中國東北甜菜產(chǎn)區(qū)地勢平坦，大量耕作土地容易受到季節(jié)性積水形成澇地，使土壤中氣相被液相取代，溶解氧減少，氧化還原電位降低，堿性金屬離子富集，其中微量鐵元素的富集最為嚴重[5]。

在過去的研究中發(fā)現(xiàn)了酸性Al3+會嚴重影響苜蓿生長和根系發(fā)育，在對大豆(Glycine maxMerr)的研究中還證實了酸性Al3+會改變根際微生物群落的結構、功能與遺傳多樣性，從而驅(qū)動土壤肥力發(fā)生改變影響植物生長[6-7]。錳的富集導致小飛蓬(Conyza canadensisL.)中滲透調(diào)節(jié)生理指標發(fā)生顯著變化，植物矮小等性狀的出現(xiàn)[8]。Cu2+脅迫下玉米(Zea maysL.)葉片可見光-近紅外光譜電子傳遞會隨著離子濃度的增加向段波光反向躍遷[9]。關于鐵元素脅迫的相關研究也顯示過量的Fe2+對大豆農(nóng)藝性狀和葉肉細胞內(nèi)膜系統(tǒng)產(chǎn)生較大的影響[10]。但目前的研究中針對高濃度的鐵脅迫研究較少，相反缺鐵脅迫的研究在番茄(Solanum lycopersicum)[11]、小麥 (Triticum aestivumL.)[12]、大豆[13]等諸多農(nóng)作物研究中備受關注。

眾所周知，鐵作為植物生長所必須的微量元素，同時也是植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，植物對鐵營養(yǎng)的需求量一般在10-11～10-6mmol/L[14]。鐵在植物光合作用、呼吸作用、激素合成及代謝、氮的固定、質(zhì)膜的氧化還原系統(tǒng)及質(zhì)膜的流動等生理代謝和酶促反應中發(fā)揮著極為重要的作用[15]。但是當環(huán)境所含鐵的含量超過植物生理代謝所能調(diào)節(jié)的濃度時，會影響植物對其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻礙植物生長發(fā)育甚至導致植物死亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵過量會對植物造成脅迫，使植物體內(nèi)積累過量的鐵以及鐵的化合物，這些物質(zhì)會誘發(fā)生成多種活性氧自由基[16]。活性氧對質(zhì)膜具有攻擊性，造成過氧化從而導致膜損傷。而植物本身所具備的防御脅迫應答機制會啟動體內(nèi)保護系統(tǒng)，包括APX、CAT、SOD等酶類物質(zhì)和Pro、MDA、可溶性糖等非酶類物質(zhì)來防御脂質(zhì)過氧化的形成并消除組織中多余的過氧化自由基，有效維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性[17]。目前，有關鐵脅迫對植物生長及生理的研究多集在農(nóng)作物缺鐵受脅迫上，針對高濃度鐵脅迫對植物生長的影響少有報道。本次實驗為了探究甜菜幼苗在高濃度鐵脅迫下的生理變化以甜菜幼苗作為實驗材料，設計高出甜菜正常培養(yǎng)的Fe2+脅迫環(huán)境進行水培實驗。通過測定甜菜幼苗保護系統(tǒng)等生理生化指標，研究高鐵脅迫下甜菜植株保護系統(tǒng)和膜脂過氧化的變化規(guī)律，以期為甜菜在重金屬逆境脅迫研究中提供進一步的理論支持和借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以德國KWS公司培育的KWS1176品系，丸粒化的包衣甜菜(Beta vulgarisL.)種子作為實驗材料。

1.2 實驗設計

試驗于2020年10—11月于黑龍江大學國家糖料改良中心植物培養(yǎng)室進行。甜菜包衣種子采用蛭石培養(yǎng)發(fā)芽，5天后選擇長勢均勻的甜菜幼苗，移栽至半倍的Hoagland營養(yǎng)液中。

Fe2+濃度梯度設置：0.06 mmol/L（霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)的正常 Fe2+濃度）、0.12 mmol/L、0.24 mmol/L、0.48 mmol/L、0.96 mmol/L、1.92 mmol/L、3.84 mmol/L，共計7個處理，每個處理重復6次。

培養(yǎng)條件為：光照有效輻射(460±15)μmol/(m2·s)，光照時間段6:00—20:00，晝夜溫度(28±2)℃和(25±2)℃，相對濕度65%～70%。培養(yǎng)過程中不間斷給營養(yǎng)液通入氧氣，每天監(jiān)測各處理營養(yǎng)液中的Fe2+濃度及pH值，使處理間營養(yǎng)液的其他離子濃度保持相對平衡，pH維持在5.7±2范圍。5天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第18天收獲樣品。

1.3 收獲樣品

選取甜菜完全展開的第三、第四片真葉和完整的植株根系進行收獲。收獲前先用自來水沖洗，再用去離子水沖洗，最后用吸水紙把表面水吸干，用眼科剪剪去甜菜葉片主葉脈和死亡的側根，剪碎混勻，各自稱取0.5 g多份置于液氮中-80℃保存。

1.4 生理生化指標測定

收獲后用分析天平測定甜菜植株鮮重(FW)，105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重后稱取干重(DW)，利用公式(1)計算得到葉片相對含水量(RWC)[18]。

相對電導率通過電導率儀(DDSJ-308A)測定，具體測定、計算參照參考文獻19中的方法[19]。

收獲的樣品分別進行抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定。過氧化氫法測定CAT、愈創(chuàng)木酚法測定POD、氮藍四唑(NBT)法測定SOD、抗壞血酸(AsA)還原法法測定APX、酸性茚三酮測定Pro含量、蒽酮比色法測定可溶性糖含量。酶活性變化以蛋白含量定量，測定方法選用生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Bradford法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)收集及分析

采用Microsoft Office Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理；用IBM SPSS Statistics20.0專業(yè)軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan法顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 鐵脅迫對甜菜幼苗葉片質(zhì)膜透性和相對含水量的影響

植物細胞電解質(zhì)外泄是反映植物受到環(huán)境脅迫時細胞損傷程度的重要生理指標之一，相對電導率可以有效反映細胞電解質(zhì)外泄情況。實驗通過測定不同濃度Fe2+培養(yǎng)下的甜菜幼苗葉片的相對電導率（圖1-a），發(fā)現(xiàn)隨著鐵離子處理水平的加劇葉片電導率逐漸升高。較0.06 mmol/L培養(yǎng)條件下分別上升了67.7%、70.38%、75.28%、76.01%、79.39%并達到差異顯著水平(P<0.05)。說明隨Fe2+濃度的提升，甜菜幼苗葉片質(zhì)膜受損程度加劇，且在3.84 mmol/L Fe2+培養(yǎng)條件下達到實驗組的最大值，即細胞質(zhì)膜受損最嚴重。

甜菜幼苗葉片組織的相對含水量(WRC)結果與處理濃度成反比。如圖1-b所示，隨著Fe2+處理水平加劇，甜菜幼苗葉片相對含水呈現(xiàn)降低趨勢。其中0.12 mmol/L、0.48 mmol/L、3.84 mmol/L Fe2+處理下培養(yǎng)幼苗相對含水量較0.06 mmol/L條件下顯著降低(P<0.05)，分別降低12.7%、16.2%、25.4%。從而說明，隨著鐵離子處理濃度的增加，葉片組織含水量降低，代謝能力下降。

2.2 鐵脅迫對甜菜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

通過表1發(fā)現(xiàn)：高濃度Fe2+培養(yǎng)條件下，甜菜幼苗植株抗氧化系統(tǒng)(SOD、CAT、POD、APX)會產(chǎn)生不同程度的影響。隨著Fe2+處理水平的提高，SOD活性在葉片中變化趨勢是先升高后降低，但各個處理間SOD活性都高于0.06 mmol/L鐵離子處理水平。其中0.96、1.96、3.84、0.24 mmol/L達到顯著差異水平(P<0.05)，較0.06 mmol/L鐵離子處理分別升高了14.37%、10.182%、7.105%、6.533%。有趣的是，F(xiàn)e2+脅迫水平低于0.96 mmol/L時，SOD的活性與處理水平成正相關；高于0.96 mmol/L時處理濃度提高，葉片中SOD活性顯著降低(P<0.05)。同樣在根系中，SOD含量較0.06 mmol/L Fe2+處理顯著升高，隨著鐵濃度的提高分別升高了24.52%、34.45%、46.80%、82.66%、70.68%、57.60%。變化趨勢與葉片中SOD保持一致。因此，甜菜幼苗SOD活性都呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且在0.96 mmol/L鐵離子處理時達到實驗組的最大值。該結果表明過量的鐵離子脅迫產(chǎn)生大量的活性氧，從而調(diào)節(jié)甜菜幼苗SOD的活性，但是當活性氧的增加遠超過SOD酶的正常歧化能力時，細胞結構和功能受到破壞，生理代謝發(fā)生紊亂SOD酶的活性反而受到抑制。

表1 鐵脅迫下甜菜幼苗根和葉片SOD(a、b)、CAT(c、d)、POD(e、f)、APX(g、h)的變化

與此同時，通過對甜菜幼苗葉片和根系的CAT、POD和APX活性進行測定，發(fā)現(xiàn)其整體與SOD活性變化趨勢基本一致。即隨著Fe2+濃度的增加，酶活性先升高后降低，且在Fe2+濃度為0.96 mmol/L時酶活性最高。

2.3 鐵脅迫對甜菜幼苗葉片和根系滲透調(diào)節(jié)物的影響

圖2-a和2-b的結果表明：隨著鐵離子處理水平的提高，甜菜幼苗（根系和葉片）組織積累了大量的脯氨酸。在此次實驗處理的鐵濃度范圍內(nèi)，0.96 mmol/L鐵濃度培養(yǎng)下根系和葉片的脯氨酸含量均達到最高。甜菜幼苗Fe2+脅迫超過0.96 mmol/L時脯氨酸含量開始下降，整體上仍然高出0.06 mmol/L。其中葉片中脯氨累積量在0.48、0.96、1.96、3.84 mmol/L鐵離子處理下分別高出0.06 mmol/L培養(yǎng)下27.37%、59.64%、54.44%、31.02%，且達到顯著差異水平(P<0.05)。根系中脯氨酸累積量在0.48、0.96、1.96、3.84 mmol/L鐵離子處理下分別高出0.06 mmol/L培養(yǎng)下19.37%、39.89%、31.34%、24.83%，且達到顯著差異水平(P<0.05)。

圖2 過量鐵脅迫下甜菜幼苗根和葉片Pro(a、b)、可溶性糖(c、d)的變化

此外通過測定植株可溶性糖發(fā)現(xiàn)：隨著鐵離子濃度的提高，甜菜幼苗（根系和葉片）組織中可溶性糖的積累量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。整體上組織中可溶性糖積累量都高于0.06 mmol/L的鐵離子培養(yǎng)下含量，且在處理濃度范圍內(nèi)鐵離子濃度為0.96 mmol/L培養(yǎng)下可溶性糖積累量達到最高。其中葉片組織中可溶性糖含量在0.48、0.96、3.84 mmol/L鐵離子處理下分別高出0.06 mmol/L培養(yǎng)下12.70%、36.88%、24.89%，且達到顯著差異水平(P<0.05)。根系中可溶性糖積量在0.12、0.24、0.96、1.96、3.84mmol/L鐵離子處理下分別高出0.06mmol/L培養(yǎng)下27.05%、36.61%、67.74%、64.03%、59.20%，且達到顯著差異水平(P<0.05)。甜菜中組織中可溶糖的這種變化量說明甜菜通過提高可溶性糖的積累量，增加了植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而響應過量Fe2+脅迫。

2.4 鐵脅迫對甜菜農(nóng)藝性狀的影響

農(nóng)藝性狀是植物受到脅迫后最直觀的表現(xiàn)，植物的根系作為離子吸收和養(yǎng)分運輸?shù)钠鞴倌茏钕雀惺芡饨珉x子的脅迫。在圖3-b中，隨著Fe2+脅迫濃度的提高，除0.24 mmol/L Fe2+處理以外，其余各處理均表現(xiàn)出生長抑制作用。其中0.48 mmol/L、0.96 mmol/L、1.92 mmol/L Fe2+脅迫下根系面積較0.06 mmol/L Fe2+處理顯著下降(P<0.05)，分別降低了36.8%、43.05%、89.54%，F(xiàn)e2+脅迫濃度為3.84 mmol/L時根系面積為處理組中的最小值6.71 cm2。葉片的變化與根系變化一樣隨著Fe2+處理水平的提高，除了0.48 mmol/L處理外其余各組甜菜幼苗葉面積均有變小。其中Fe2+脅迫濃度為0.24 mmol/L和1.92 mmol/L時葉面積相對于0.06 mmol/L Fe2+處理顯著下降(P<0.05)，分別下降了27.25%和76.90%，處理為3.84 mmol/L時葉面積達到了處理間的最小值46.53 cm2。此外，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)甜菜葉片葉面積隨著Fe2+脅迫水平的提高呈現(xiàn)變小趨勢。因此Fe2+脅迫水平的增加抑制了甜菜幼苗根和葉片的生長，且Fe2+濃度越高對甜菜生長抑制作用越明顯。

圖3 鐵脅迫下甜菜幼苗真葉面積(a)和根面積(b)變化

通過圖4的根系形態(tài)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+濃度的提高，甜菜幼苗根系形態(tài)和根系顏色發(fā)生明顯的改變。在0.06、0.12 mmol/L Fe2+處理下甜菜根系顏色為白色，生長旺盛。Fe2+濃度的提升甜菜幼苗根系開始由白色轉變?yōu)榘导t色。0.24 mmol/L時根系顏色開始變暗，0.96 mmol/L時變?yōu)闇\紅色，1.92 mmol/L時部分變紅，3.84 mmol/L時完全變?yōu)榧t色。且根系整體形態(tài)上表現(xiàn)出生物量逐漸變小。除此外，甜菜幼苗在Fe2+濃度提搞后表現(xiàn)出葉片碎小，植株矮化，生物量降低等形態(tài)。Fe2+為0.06 mmol/L和0.12 mmol/L甜菜幼苗地上部分變化不明顯，0.24 mmol/L時植株開始出現(xiàn)矮化，0.48 mmol/L、0.96 mmol/L、1.92 mmol/L和3.84 mmol/L處理下矮化現(xiàn)象明顯，其中3.84 mmol/L時甜菜幼苗株高最低，生長明顯受到抑制。

圖4 鐵脅迫下甜菜幼苗根系和植株形態(tài)的變化

3 討論與結論

在長期因排水不良導致積水或受工業(yè)污染的酸性土壤中，F(xiàn)e2+的含量可以達到一個相當?shù)臄?shù)量級，植物因此而受到Fe2+的毒害。然而，不同植物對鐵毒害的癥狀也不盡相同[20]。研究發(fā)現(xiàn)過量的Fe2+脅迫會導致豌豆(Pisum sativumL.)葉片的葉尖開始出現(xiàn)白斑，并且白斑會隨脅迫濃度的增加而向整個葉片蔓延，最終導致植株大部分葉片出現(xiàn)白化癥狀。除此外，高濃度的Fe2+使豌豆植株形態(tài)特征發(fā)生改變，如植株矮化，根系分支、變短以及生物量降低等[17,21]。在過量鐵脅迫對大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]生長及顯微結構影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，用過量的Fe2+培養(yǎng)大豆會導致植株葉片縮小，生長受到抑制[10]。在本次實驗中，隨著鐵離子濃度的增加甜菜幼苗表現(xiàn)出根變黃、葉片碎小、植株變矮、生長緩慢等特征，但沒有出現(xiàn)明顯的斑點。因此，出現(xiàn)斑點尚不能反映植物受鐵離子脅迫的程度，同時也不能排除水培條件下鐵含量過高影響的其他離子的吸收原因?qū)е隆?/p>

植物受到外界環(huán)境帶來的非生物脅迫時，葉片相對電導率通常能反映了該條件下細胞質(zhì)膜的損傷程度。研究發(fā)現(xiàn)植物在受到鹽、堿、干旱和重金屬等非生物脅迫時，葉片相對電導率升高，意味著質(zhì)膜透性增加，原生質(zhì)體受損嚴重[22-23]。本研究中，隨著鐵濃度的增加甜菜幼苗葉片相對電導率升高，因此高濃度Fe2+會破壞甜菜幼苗葉片細胞的完整性，導致細胞內(nèi)液體外滲從而提高葉片相對電導率。

Fe2+是自由基形成的誘發(fā)劑，其能誘發(fā)生成超氧自由基，同時生成一些毒性極強的羥基自由基，與周圍的活性生物大分子發(fā)生反應，不斷地產(chǎn)生次生自由基。因此，鐵離子對植物有毒害作用。此外，鐵離子會與脅迫產(chǎn)生的過氧化物反應生成一種具有攻擊性的鐵自由基，主要攻擊代謝酶類的反應中心以及蛋白復合體[24]。最終這些自由基共同導致膜質(zhì)過氧化，從而使植物組織中細胞膜結構和功能受損，酶促反應中斷，細胞代謝紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)，高鐵脅迫下油橄欖[Canarium album(Lour.)Raeusch.]植株中CAT、SOD、POD活性隨著Fe2+濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[15]，該結果與本實驗結果相符。在0.96 mmol/L處理條件下達到最高，之后隨著鐵離子處理濃度的升高甜菜幼苗組織中的抗氧化酶活性受到抑制。因此本次實驗處理濃度范圍內(nèi)，0.96 mmol/L的Fe2+濃度是甜菜幼苗組織抗氧化酶類調(diào)節(jié)范圍的最大濃度，也說明甜菜抗氧化酶能調(diào)節(jié)外界環(huán)境鐵離子的脅迫濃度為0.96 mmol/L。因此，植物組織中所存在的抗氧化酶類在抵御逆境脅迫中具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用，且發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)能力是有一定的限度的。當外界環(huán)境施加的脅迫強度超過植物自身的調(diào)節(jié)范圍時，它們對活性氧的清除能力則會被明顯削弱。

植物對非生物逆境脅迫的適應調(diào)控，除了通過抗氧化物酶類來調(diào)節(jié)以外，還可以通過非酶類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)直接參與調(diào)節(jié)[25-26]。研究證實植物在多種逆境下很容易發(fā)生滲透調(diào)節(jié)作用，如在鹽脅迫下組織會合成、積累可溶性糖、可溶蛋白和脯氨酸等在滲透調(diào)節(jié)上有活性而對細胞無毒害的一類有機物來參與滲透調(diào)節(jié)，從而更好的適應高鹽脅迫下的高滲透壓環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)鐵、錳脅迫下人參(Panax ginsengC.A.Meyer)會維持較高水平可溶性糖、脯氨酸含量以此對抗鐵和錳毒害作用，這是人參適應環(huán)境、緩解鐵和錳脅迫的重要機制之一[26]。本研究發(fā)現(xiàn)在實驗組設計的處理體系中，F(xiàn)e2+濃度的提高促進了甜菜幼苗組織中脯氨酸和可溶性糖含量的積累，變化趨勢是先增加后降低，并在0.96 mmol/L鐵離子培養(yǎng)下達到最大值。分析其原因可能是過量鐵促使羥基自由基(-·OH)大量產(chǎn)生，進而誘導甜菜幼苗組織中脯氨酸和可溶性糖的大量積累。實驗說明高鐵脅迫促進植物組織中非酶類可溶性物質(zhì)的積累，從而調(diào)節(jié)植物組織的滲透壓，提高了植物組織對水分的吸收與保持。此外，實驗也證明植物對任何逆境脅迫的調(diào)節(jié)都有一個適應性上限，當超過植物本身所能調(diào)節(jié)的范圍時，調(diào)節(jié)能力將會下降。

本次試驗，僅研究了水培條件下7個鐵離子濃度梯度處理下甜菜生長和基礎生理生化特性的變化，尚不能夠充分解釋高鐵脅迫對甜菜耐生長的影響，至于其他相關因素的影響作用還有待于進一步研究。

但是可以確定的是，高鐵脅迫下隨著Fe2+脅迫濃度的提升，甜菜幼苗生長受到抑制：葉面積減小，相對含水量降低，質(zhì)膜受損嚴重；根系生長能力減弱，根系顏色變暗。此外甜菜幼苗組織中抗氧化酶(SOD、CAT、POD、APX)活性隨著鐵離子水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在鐵離子脅迫處于較低濃度時，SOD、CAT、POD、APX活性隨Fe2+濃度增加呈現(xiàn)升高趨勢，說明甜菜植株中的保護酶系統(tǒng)能有效清除Fe2+脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基。但隨著鐵離子濃度的不斷提高增加到0.96 mmol/L，SOD、CAT、POD、APX活性開始下降，對組織中活性氧自由基的清除能力開始減弱。與此同時，非酶類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖和脯氨酸的積累量也出現(xiàn)了相同的變化趨勢。因此可以初步確定，甜菜植株抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在高鐵脅迫中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，當Fe2+超過0.96 mmol/L時，這種調(diào)節(jié)機制會明顯受到抑制。