siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠髓核細(xì)胞TRAIL表達(dá)和細(xì)胞行為的影響△

徐世民，劉 洋，潘洪發(fā)，史玉林，王瑞泓，高加智

（山東省濰坊市人民醫(yī)院脊柱外科，山東濰坊 261041）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degenera?tion,IDD）作為一種常見的骨關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致椎間盤突出、腰椎滑脫和椎管狹窄甚至造成殘疾的主要原因，嚴(yán)重影響患者健康并降低患者生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確［1］。目前研究顯示，椎間盤退行性病變與衰老、過(guò)度體力勞動(dòng)、炎性細(xì)胞因子以及遺傳因素有關(guān)，其中炎癥因子激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致疾病發(fā)病主要因素［3］。半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）家族激活所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致椎間盤退行性疾病的主要原因［4］。

半胱氨酸天冬氨酸酶家族是一個(gè)高度同源的蛋白質(zhì)家族。Caspase-3是從人T淋巴細(xì)胞中克隆到的Caspase家族成員，在胞漿中作為一種非活性的前體酶存在，Caspase-3的激活導(dǎo)致質(zhì)膜脫落、染色質(zhì)凝聚、DNA斷裂［5］。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3可作為治療IDD靶點(diǎn)改善椎間盤退行性病變癥狀［6］。而TRAIL是屬于TNF超家族的一種氨基酸Ⅱ型跨膜蛋白，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞和癌細(xì)胞中TRAIL可優(yōu)先通過(guò)TRAIL-R2/DR5 和 TRAIL-R1/DR4 受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7，8］。TRAIL基因在人椎間盤中的表達(dá)與IDD有關(guān)，提示TRAIL基因可能在IDD發(fā)病機(jī)制中起一定作用。

細(xì)胞凋亡主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑。在細(xì)胞凋亡的信號(hào)作用下，線粒體中凋亡因子內(nèi)激活，改變線粒體膜通透性，大量凋亡因子被釋放，激活caspese-3蛋白對(duì)底物切割，引起凋亡。在死亡受體途徑中，TRAIL被激活后，誘導(dǎo)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 （Fas-associated death domain,FADD）、cas?pese-8與死亡受體DR4和DR5結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signaling complex,DISC），觸發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，本研究探討TRAIL和Cas?pase-3與IDD發(fā)病的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理

選用雄性SD大鼠（濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重 （400.56±30.14）g，共10只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用彎曲鼠尾法建立椎間盤退變模型。造模后單籠喂養(yǎng)，每日觀察鼠尾U型固定器，若固定器脫落再次進(jìn)行固定。造模8周后隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行腰椎X線檢測(cè)。大鼠腰椎X線顯示脊柱腰段向一側(cè)成S狀側(cè)彎，判斷本次造模成功。造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)4周，將小鼠麻醉后，取得椎間盤組織，處死。PBS液漂洗大鼠尾椎間盤中髓核組織；采用眼科剪，將髓核組織剪碎至0.1 mm3的小碎塊；加入3 mg/mlⅠ型膠原酶和4 mg/ml消化酶，至于溫箱中消化4 h；將消化混合液進(jìn)行離心，使用10%血清DMEM培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸浮液加入到培養(yǎng)皿中，置于5%CO2，37℃的溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)；當(dāng)原代細(xì)胞從髓核組織塊邊緣逐漸生長(zhǎng)出來(lái)，用無(wú)菌PBS進(jìn)行沖洗，然后使用0.25%胰酶消化處理，約有80%的貼壁細(xì)胞脫落時(shí)，終止消化，離心并重懸細(xì)胞，按照106/ml的細(xì)胞密度重新接種于培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)皿底部約80%匯合率時(shí)收獲細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

髓核組織用消化酶消化后，分離出髓核細(xì)胞，用10%胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）進(jìn)行沉淀，記為原代（P0）。加入0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）2 ml，當(dāng)細(xì)胞突起回縮、變圓、細(xì)胞間隙變大，按1∶4傳代接種到新的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

1.3 細(xì)胞分組處理

P1細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組（control組）、TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組（siTRAIL組）、TNF-α處理組（TNF-α組）和TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組（TNF-α+siTRAIL組）。

空白對(duì)照組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不行其它干預(yù)。

TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組：將髓核細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)后接種于6孔板，以DMEM培養(yǎng)基稀釋 10 μl Lipofectamine 2000～250 μl，加入 0.05 nmol的TRAIL siRNA至250μl DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效率。

TNF-α處理組：細(xì)胞接種于6孔板，加入濃度為100 ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2 d。

TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組：將髓核細(xì)胞用濃度為100 ng/ml的TNF-α處理，培養(yǎng)2 d后，用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)后接種于6孔板，加入Lipofectamine 2000和TRAIL siRNA DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效率。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種到培養(yǎng)板。培養(yǎng)48 h后，加新鮮配置的MTT溶液（5 mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)孵育4 h。上清液吸除，每孔中加150μl DMSO，室溫，搖床振蕩10 min。490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收值。

1.4.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞收集后并洗滌，用 100 μl的標(biāo)記溶液FITC-Annexin V和PI溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min。1 200 r/min，棄上清，重懸。加入熒光染液溶液，4℃孵育20min。BD FACSAria流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.3細(xì)胞總蛋白提取與Western blot分析

收集體外培養(yǎng)的各組細(xì)胞，置-80℃冰箱保存。檢測(cè)前室溫下自然解凍，制備細(xì)胞勻漿。采用8%凝膠，室溫，100 v，電泳90 min。在4℃冰箱中利用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)印，85 v，90 min。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜與Caspase-3抗體（1∶500）抗體結(jié)合，4℃，12 h。PVDF膜與二抗（1∶2000）結(jié)合。進(jìn)行發(fā)光法應(yīng)并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果見圖1，相較于空白對(duì)照組，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度（100.75±5.72）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），TNF-α處理組細(xì)胞的增殖速度（49.19±2.89）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞的活性無(wú)明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達(dá)能顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞活性抑制。

圖1 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對(duì)大鼠髓核細(xì)胞活性的影響 注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果見圖2，相較于空白對(duì)照組，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組大鼠髓核細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變（P>0.05），TNF-α處理組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.05），提示TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染可抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖2 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對(duì)大鼠髓核細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Wester block檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)大鼠髓核細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平的結(jié)果見圖3。相較于空白對(duì)照組，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組大鼠髓核細(xì)胞中Caspase-3活性和表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05），TNF-α處理組細(xì)胞中Caspase-3的活性和表達(dá)明顯升高（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞Caspase-3的活性和表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caspase-3激活和表達(dá)。

圖3 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對(duì)大鼠髓核細(xì)胞中Cas?pase-3活性和表達(dá)的影響

3 討論

大約40%的30歲以下的人和超過(guò)90%的55歲或55歲以上的人群患不同程度的椎間盤退行性病變。我國(guó)IDD發(fā)病率呈逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)［6］。在多種機(jī)制的作用下，椎間盤組織發(fā)生細(xì)胞表型改變、凋亡、老化、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)成分改變等，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列臨床癥狀［9］。椎間盤細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化會(huì)破壞纖維環(huán)與核之間的邊界導(dǎo)致髓核細(xì)胞失水，降低椎間盤的承載能力。隨著生活方式的改變、運(yùn)動(dòng)的減少、衰老以及人類生活的加速和長(zhǎng)期的工作，椎間盤退行性病變的發(fā)病率不斷上升。椎間盤退行性病變可能導(dǎo)致喪失勞動(dòng)能力，甚至導(dǎo)致殘疾，已逐漸成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要過(guò)程，在多種臨床疾病中起著重要作用。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致椎間盤退行性病變的主要原因，并證實(shí)在IDD過(guò)程中抑制細(xì)胞凋亡是預(yù)防或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的有效途徑［10，11］。Gruber等［12］首次在人體中證實(shí)椎間盤細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IDD患者60%左右的椎間盤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡的過(guò)程比較復(fù)雜，一般認(rèn)為凋亡過(guò)程主要有兩種途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體通路被多種細(xì)胞應(yīng)激和大量凋亡信號(hào)激活，對(duì)IDD過(guò)程中細(xì)胞凋亡起著重要的作用。在氧化應(yīng)激作用下，位于線粒體中的bcl-樣蛋白發(fā)生構(gòu)象變化導(dǎo)致線粒體通透性改變，線粒體膜電位被下調(diào)，線粒體隨后通過(guò)釋放細(xì)胞色素C，caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，完成對(duì)底物切割，引起凋亡［13］。死亡受體途徑主要由TRAIL/TRAIL-R介導(dǎo)，TRAIL被激活后，誘導(dǎo)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death do?main,FADD）、caspese-8與死亡受體DR4和DR5結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signal?ing complex,DISC），觸發(fā)細(xì)胞凋亡［14］。

多種異常刺激可以增加髓核細(xì)胞中的炎性因子（如IL-1β和TNF-α）表達(dá)，從而引起髓核細(xì)胞合成代謝與分解活性的失衡，加速了椎間盤退變。同時(shí)也有研究證實(shí)，高水平的TNF-α可以激活內(nèi)源性和外源性途徑中的Caspase-3蛋白發(fā)揮凋亡作用，因此本研究選擇TNF-α作為誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的刺激性因子［15］。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TNF-α處理后細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞凋亡顯著升高，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α處理組細(xì)胞的Caspase-3蛋白明顯高于其他組。此外本次研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞的活性、凋亡率及Caspase-3蛋白水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異，提示siRNA沉默TRAIL表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caspase-3激活和表達(dá)。由此本次研究認(rèn)為，TRAIL和Caspase-3蛋白通過(guò)參與髓核細(xì)胞的凋亡而引發(fā)腰椎間盤退變。TRAIL是一種凋亡分子，能與死亡受體特異性結(jié)合后選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3蛋白具有剪切DNA蛋白片段的功能，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。Sun等［16］研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可激活死亡受體而啟動(dòng)外源性凋亡途徑誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，與本次研究結(jié)果相一致，并認(rèn)為抑制TRAIL基因的表達(dá)使ERK通路失活，成為臨床治療IDD的潛在治療靶點(diǎn)。與先前研究相一致的是，caspase-3在內(nèi)源性（線粒體）細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，短期抑制caspase-3可用于治療損傷誘導(dǎo)的椎間盤退行性病變［6］。

簡(jiǎn)而言之，本研究通過(guò)觀察TRAIL沉默后大鼠髓核細(xì)胞生物學(xué)特性的變化情況，表明TRAIL基因和Caspase-3蛋白誘導(dǎo)的凋亡途徑參與了腰椎間盤的退變。