五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用

高金星，余惠凡，覃彬華，張昌文,

（1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖北荊州 434020；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，湖北十堰 442000）

對(duì)乙酰氨基酚（N-acetyl-para-aminophenol，APAP）是一般用于治療普通感冒的一類非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥，屬于乙酰水楊酸類，由于其解熱作用較好副作用小被廣泛用于臨床，故常發(fā)生不規(guī)范性使用的現(xiàn)象。短期低劑量使用不會(huì)對(duì)肝臟造成影響，而對(duì)乙酰氨基酚大劑量攝入會(huì)使肝臟積累代謝有毒物質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)藥物性肝損傷和肝炎[1?2]。藥物性肝損傷是指藥物本身毒性或其活性代謝產(chǎn)物毒性所導(dǎo)致的肝臟損傷，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肝功能衰竭甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。對(duì)乙酰氨基酚超劑量導(dǎo)致葡萄糖醛酸化和硫酸化不充足以及肝臟中過(guò)量的N-乙酰苯醌亞胺消耗谷胱甘肽，一旦肝臟谷胱甘肽儲(chǔ)備耗盡，未結(jié)合的乙酰苯醌亞胺可與其他細(xì)胞蛋白自由組合，從而加劇肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[4?5]。

五汁飲出自清朝吳瑭《溫病條辨》一書，處方由鮮藕汁、鮮梨汁、鮮荸薺汁、蘆根水煎液、鮮麥冬汁組成，具有清熱養(yǎng)陰、生津止渴的功效[6]。組成是由常見食品與使用安全的中藥組成，具有很好的養(yǎng)身保健作用。現(xiàn)代藥理研究表明：梨作為常見水果，有清心、潤(rùn)肺、養(yǎng)肝、解瘡毒和酒毒的功效[7]；荸薺富含硒、黃酮、多酚等抗氧化物質(zhì)，具有抗氧化、抗癌的作用[8]；蘆根中的多糖成分具有抗氧化[9]、抗自由基作用，并可通過(guò)抗氧化作用保護(hù)肝細(xì)胞、抑制膠原沉積等途徑來(lái)抑制肝纖維化，改善肝功能，降低肝脂肪化[10]；麥冬是我國(guó)臨床常用的中藥之一，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心的功效。麥冬的主要成分有皂苷、黃酮、多糖等[11]，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫、改善肝損傷等藥理作用[12]；蓮藕是常見的蔬菜，蓮藕中的多糖、多酚物質(zhì)具有降血糖作用[13]，可提升體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）的活性，減少丙二醛（MDA）的生成。五汁飲的所有組成成分具有良好的保肝、抗氧化、抗自由基作用，由常見食品和使用安全的中藥組成，具有很好的使用安全性。

本文采用高劑量對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠急性肝臟損傷模型[14]，但目前對(duì)五汁飲的營(yíng)養(yǎng)和保健作用的機(jī)制研究較少，本文探討了五汁飲（WZY）對(duì)對(duì)乙酰氨基酚AP所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為五汁飲的研究與開發(fā)新型保健飲品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性KM小鼠 40只，5～6周齡，體重18～22 g，由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK（鄂）2019-0017，小鼠每天給予充足的水和飼料，3 d后開始實(shí)驗(yàn)；新鮮的梨、荸薺、藕 1000 g，均購(gòu)買于本地市場(chǎng)；蘆根和麥冬1000 g，本地藥房；HE染液、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；對(duì)乙酰氨基酚 純度99%，上海源葉生物有限公司。

RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ш型循環(huán)水真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AR224CN分析天平 奧豪斯上海有限公司。Leica DMI6000B熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；GL-12C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五汁飲樣品制備 梨（去心皮）、荸薺、藕洗凈榨汁合并，蘆根和麥冬（各500 g）放入大砂鍋內(nèi)，加入2 L水，浸泡30 min后置大火上煮沸30 min后，改小火煮30 min，過(guò)濾，合并梨、荸薺、藕汁，小火煎煮10 min，反復(fù)三次，紗布擠壓過(guò)濾，濾液減壓濃縮為2.0 g生藥/mL濃縮液，密封，放入4℃冷藏。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模給藥處理 參考文獻(xiàn)[15]，40只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、五汁飲低劑量組（100 mg/kg）、五汁飲中劑量組（200 mg/kg）和五汁飲高劑量組（400 mg/kg），每組8只。五汁飲（低、中、高）組小鼠持續(xù)灌胃給藥7 d，每日1次，空白組和模型組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。最后一次給藥2 h后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射AP（300 mg/kg）建立肝損傷模型。24 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血，靜置離心后留取上清檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)；取小鼠肝臟和脾臟稱重記錄，后取一部分肝組織固定于福爾馬林溶液中，用于肝組織切片染色觀察病理變化，另一部分肝組織凍存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 免疫器官指數(shù)檢測(cè) 稱小鼠體質(zhì)量及肝臟和脾臟質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。肝臟（脾臟）指數(shù)＝肝臟（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 小鼠進(jìn)行眼球取血，靜置離心（2000 r/min，4℃，離心5 min）后留取上清液用試劑盒檢測(cè)ALT、AST酶活力。

1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取?80℃凍存的小鼠肝組織，置于冰上解凍后，加入生理鹽水，勻漿，離心（5000 r/min，常溫，離心5 min），留取上清液，按照GSH和MDA試劑盒的操作說(shuō)明書測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.6 炎癥因子的檢測(cè) 取血清，按照試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.2.7 HE染色 按照HE染色步驟進(jìn)行染色，封片，在顯微鏡下觀察拍照。將H&E染色后的肝組織切片置于顯微鏡下觀察，根據(jù)AP肝損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)。肝損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)（0～1分）：無(wú)明確肝損傷的形態(tài)學(xué)特征；1級(jí)（1～2分）：肝小葉Ⅲ區(qū)，靜脈周圍散在的片狀壞死病灶；2級(jí)（2～3分）：靜脈周圍散在的片狀壞死病灶，一直延續(xù)到Ⅱ區(qū)；3級(jí)（3～4分）：靜脈片狀壞死病灶，一直延續(xù)到Ⅰ區(qū)。

1.2.8 Tunel染色 將待染色的片子置于脫水框中，脫蠟水化步驟同HE染色，接著用3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，再滴加0.01 mol/L TBS新鮮稀釋的Proteinase K（1:200），37℃條件下消化12 min，接著在37℃條件下，依次用標(biāo)記緩沖液孵育2 h、封閉液孵育30 min、抗體稀釋液稀釋的生物素化抗地高辛抗體（1:100）孵育30 min，抗體稀釋液稀釋的SABC（1:100）孵育30 min，最后置于新鮮配制的DAB發(fā)色液中，至鏡檢出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，再置于蘇木素中，之后同HE染色脫水、樹脂封片步驟，待片子風(fēng)干，置于顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞炎癥與凋亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01科學(xué)統(tǒng)計(jì)繪圖軟件進(jìn)行分析，以Mean±SD表示，組間和組內(nèi)采用雙向方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示數(shù)據(jù)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 五汁飲對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

給藥7 d后，五汁飲對(duì)小鼠臟器指數(shù)[16]的影響結(jié)果見表1。觀察可見模型組小鼠肝組織出現(xiàn)腫大，說(shuō)明造模成功，肝臟指數(shù)的降低說(shuō)明給藥組對(duì)于肝臟腫大有緩解作用。與空白組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)下降高度顯著（P<0.001）；與模型組比，除低劑量組外，五汁飲可顯著（P<0.05或P<0.01）降低小鼠的肝臟指數(shù)，其中以高劑量組的五汁飲降低效果最為顯著（P<0.01）。結(jié)果表明，適宜劑量的五汁飲能夠改善APAP致急性肝損傷小鼠的肝腫脹情況。

表1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響（±s,n=8）Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)

表1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響（±s,n=8）Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)

注：與空白組相比，*表示數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；**表示數(shù)據(jù)差異極顯著，P <0.01；***表示數(shù)據(jù)差異高度顯著，P<0.001；與模型組相比，#表示數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；##表示數(shù)據(jù)差異極顯著，P<0.01；###表示數(shù)據(jù)差異高度顯著，P<0.001；表2、圖1～圖3同。

2.2 五汁飲對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響

ALT和AST是肝損傷的主要指標(biāo)參數(shù)，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，這些生理指標(biāo)會(huì)在血液中發(fā)生變化，二者在血清中的指數(shù)會(huì)有所升高[17?18]。如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中ALT（P<0.001）和AST（P<0.01）活力均顯著升高；給予五汁飲后，與模型組相比，小鼠血清中ALT和AST活力均有不同程度的減少，其中，高劑量的五汁飲給藥組引起小鼠機(jī)體變化，其顯著降低了AP作用于小鼠機(jī)體血清中ALT（P<0.001）和AST（P<0.05）的水平。結(jié)果表明五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致的急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

圖1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平的影響（±s,n=8）Fig.1 Effects of WZY on serum ALTand AST levelsof acute liver-injury miceinduced by AP( ±s,n=8)

2.3 五汁飲對(duì)小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中GSH（還原型谷胱甘肽）含量顯著降低（P<0.001），而五汁飲的中（P<0.01）、高劑量組（P<0.001）不同程度地改善了AP引起的小鼠肝組織中GSH含量的減少。MDA水平顯示組織的脂質(zhì)過(guò)氧化物的多少，含量與細(xì)胞的受損程度有關(guān)[19?20]。與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P<0.001）；與模型組比，中、高劑量的五汁飲顯著降低了小鼠肝組織中MDA的含量（P<0.05）。結(jié)果表明五汁飲能夠提高肝組織抗氧化能力并緩解AP對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

圖2 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠肝組織中GSH和MDA含量的影響（±s,n=8）Fig.2 Effectsof WZY on liver GSHand MDA levelsof acute liver-injury miceinduced by AP(±s,n=8)

2.4 五汁飲對(duì)小鼠肝組織中炎癥因子的影響

肝組織中炎癥因子水平反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱[21?23]。由表2可知，與空白組相比，模型組的炎癥因子含量明顯升高；與模型組相比，五汁飲低、中、高劑量組顯著抑制了組織中炎癥因子的升高（P<0.05或P<0.01）。

表2 五汁飲對(duì)小鼠肝臟中炎癥因子的影響Table 2 Effectsof WZY on inflammatory factors in liver of mice

2.5 五汁飲對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響

如圖3所示，空白組小鼠的肝組織細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中央靜脈周圍多數(shù)融合壞死，且部分壞死面積從III區(qū)擴(kuò)張至II區(qū)，并伴混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，Tunel凋亡染色圖片可看出模型組小鼠肝臟中央靜脈周圍細(xì)胞變性腫脹，大部分肝細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)灶狀壞死[24?25]；經(jīng)過(guò)五汁飲的干預(yù)，小鼠肝組織細(xì)胞的凋亡壞死情況得到不同程度的改善，五汁飲高劑量組細(xì)胞完整，排列整齊，肝組織炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象輕微，顯著減輕了AP引起的小鼠肝細(xì)胞凋亡壞死癥狀，并改善了肝組織的炎癥浸潤(rùn)程度，從而改善肝組織的損傷情況。

圖3 五汁飲對(duì)AP致小鼠肝組織細(xì)胞損傷的影響Fig.3 Effects of WZY on liver tissue pathological changesy of acuteliver-injury miceinduced by AP

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射高劑量對(duì)乙酰氨基酚溶液，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肝臟損傷現(xiàn)象，探討五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，五汁飲高、中劑量組小鼠血清中ALT和AST的水平均有明顯下降，GSH活性提高，MDA水平降低，肝組織切片顯示肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善。說(shuō)明五汁飲具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、防止細(xì)胞膜受損、減輕細(xì)胞腫脹壞死的效果，對(duì)藥物所致肝損傷具有顯著保護(hù)作用。五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與提高抗氧化酶體系活力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、維持肝細(xì)胞膜正常形態(tài)有關(guān)。綜上所述，五汁飲能保護(hù)AP所致的小鼠急性肝損傷，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激、緩解炎癥反應(yīng)有關(guān)，這為五汁飲的研究與開發(fā)提供了理論依據(jù)。