HS-SPME-GC/MS分析3種牡丹花瓣揮發(fā)性成分

趙夢(mèng)瑤，張立攀，王春杰，關(guān)炳峰，李 冰，王俊朋，王 永

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450000）

牡丹（Paeonia sufruticosaAndr.），又名富貴花、百兩金等，是我國(guó)傳統(tǒng)木本觀賞植物，為毛茛科芍藥屬灌木。牡丹顏色艷麗，雍榮華貴，歷來有“國(guó)色天香”、“花王”的美譽(yù)，被譽(yù)為“花中之王”[1]。牡丹原產(chǎn)于我國(guó)，資源豐富，品種繁多，在洛陽(yáng)、菏澤和蘭州等多個(gè)地區(qū)都有大面積種植，有著極佳的觀賞、研究?jī)r(jià)值。牡丹花中含有維生素、氨基酸、糖類、礦物質(zhì)以及黃酮等多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)元素和功能性成分，使其還具有很高的食用、藥用保健價(jià)值[2?4]。在牡丹產(chǎn)地，人們有食用牡丹花的歷史，常將其制作為茶飲、粥品、牡丹花餅、牡丹花醬等。2013年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)‘丹鳳’牡丹花成為新食品原料，開啟了牡丹花食品產(chǎn)業(yè)的嶄新鏈條。

香味是衡量食品質(zhì)量的重要指標(biāo)，人們?cè)谶x擇食品的過程中，常常會(huì)將香味作為主要的參考依據(jù),食品的香味誘人，能夠在很大程度上提升其受歡迎程度。因此，現(xiàn)代食品工業(yè)中，科學(xué)使用香精是一項(xiàng)非常重要的手段[5?6]。目前市場(chǎng)上牡丹相關(guān)食品多存在牡丹特征風(fēng)味不足的問題，在很大程度上影響和限制了牡丹花食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，急需進(jìn)行牡丹花香精的開發(fā)。解析牡丹香味組分，確定香味組分構(gòu)成是研制香精產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。但目前對(duì)牡丹的研究，多集中于牡丹苗木育種、籽油、丹皮的生產(chǎn)和精油的提取工藝[7?10]，關(guān)于牡丹香氣組分的研究相對(duì)較少。

固相微萃取是在固相萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新型樣品前處理技術(shù)，興起于上世紀(jì)90年代，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體[11?13]。其分析過程簡(jiǎn)單、快速，分析結(jié)果與原始?xì)馕陡咏咏?，近年來被廣泛用于揮發(fā)性物質(zhì)的分析[14?15]。本研究采用HS-SPME-GC/MS分析手段，對(duì)‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’3種品種的牡丹花瓣揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，從分子水平對(duì)牡丹花的香氣物質(zhì)進(jìn)行解析，闡明不同品種牡丹花瓣香氣組分，并結(jié)合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找3種品種牡丹花瓣香氣差異成分，為研制牡丹香精提供依據(jù)，更好地促進(jìn)牡丹花食品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹（‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’） 采自河南省洛陽(yáng)祥和牡丹科技有限公司牡丹種植基地；正構(gòu)烷烴C5～C25美國(guó)o2si 標(biāo)準(zhǔn)品公司；甲醇（HPLC級(jí)）北京迪馬科技有限公司。

電子天平（FA 2004） 上海衡際科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋（DF101S） 江蘇科析儀器有限公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、萃取纖維（65μmPDMS/DVB）美國(guó)Supelco公司；7890A-7000GC/MS Triple Quad 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹花瓣揮發(fā)性成分的提取 準(zhǔn)確稱取3 g新鮮花瓣置于40 mL頂空瓶中密封，50°C水浴下平衡20 min，將老化過的固相微萃取進(jìn)樣針插入密閉的頂空瓶中，推出萃取頭在50°C下吸附30 min，取出后立即插進(jìn)氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口中，解析5 min。平行進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果求平均值。

1.2.2 GC-MS分析條件 色譜柱為HP-5MS（30 m×250μm×0.25μm），采用程序升溫模式，起始溫度為40°C，保持1 min，以3°C/min速率升至100°C，保持2 min，再以2 °C/min速率升至110 °C，保持2 min，再以10°C/min速率升至270°C。流速1 mL/min。進(jìn)樣口溫度250°C；以He（99.999%）為載氣，流速1.0 mL/min；分流比為5:1。

離子源溫度230 °C，電離方式EI，電離能量70 eV；四極桿溫度150°C，傳輸線溫度250°C，無溶劑延遲，質(zhì)量掃描范圍為33～450 amu，采用全掃描模式。

C5～C25正構(gòu)烷烴采取分流模式進(jìn)樣1μL，分流比為20:1。其他進(jìn)樣條件與樣品進(jìn)樣一致。計(jì)算保留指數(shù)（retention index，RI）如下:

式中：lgtn和lgtn+1分別為碳數(shù)為n，n+1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間的對(duì)數(shù)；lgti是出峰在n和n+1的正構(gòu)烷之間的i化合物的保留時(shí)間的對(duì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過GC-MS工作站自帶的NIST 17譜庫(kù)進(jìn)行檢索，再結(jié)合文獻(xiàn)和人工解析，以及通過正構(gòu)烷烴計(jì)算保留指數(shù)，與文獻(xiàn)進(jìn)行核對(duì)，進(jìn)行定性分析，采用面積歸一化法，求出化合物的相對(duì)含量。通過SPSS22.0進(jìn)行ANOVA分析，SIMCA 14.1進(jìn)行PCA和OPLSDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花瓣香氣成分HS-SPME-GC/MS分析

‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’花瓣中揮發(fā)性成分的GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1。

圖1 ‘丹鳳’（A）、‘香玉’（B）和‘海黃’（C）花瓣GC/MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of GC/MSfor Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang (A), Paeonia suffruticosa‘Xiang yu’(B)and ‘P.High Noon’(C)

表1為‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’花瓣香氣成分GC-MS分析的結(jié)果，通過HP-5MS色譜柱的分析，根據(jù)檢索NIST 17譜庫(kù)，與文獻(xiàn)核對(duì)保留指數(shù)、查閱相關(guān)文獻(xiàn)鑒定化合物。3種品種牡丹花瓣中共檢測(cè)鑒定出115種化合物，包括醛類20種、酮類3種、醇類27種、酸類2種、酯類22種、烷烴類13種、烯烴類17種和其他類11種。

表1 ‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’花瓣HS-SPME-GC/MS分析結(jié)果Table 1 Analysisresultsof Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang , Paeonia suffruticosa‘Xiang yu’and ‘P.High Noon’ by HS-SPME-GC/MS

繪制3種牡丹花瓣揮發(fā)性成分的維恩圖如圖2所示。

圖2 3種花瓣揮發(fā)性成分維恩圖Fig.2 Venn diagram of the volatile components in three Paeonia petals

從圖2可以更加直觀地看出3種牡丹花瓣揮發(fā)性成分之間的相互關(guān)系。在檢測(cè)鑒定出的115種化合物中，共有成分有33種，重合率僅為28.7%，說明3種牡丹花瓣成分差異較大?！P’和‘香玉’的共有成分有44種，‘丹鳳’和‘海黃’的共有成分有58種，‘香玉’和‘海黃’中的共有成分有36種?！P’中有15種成分為其他兩種牡丹花瓣中所不具有的，為其特征揮發(fā)成分。‘香玉’中有12種特征揮發(fā)成分。‘海黃’中有16種特征揮發(fā)成分。

從單獨(dú)的牡丹花品種來看，‘丹鳳’中共鑒定出84種，‘香玉’中58種，‘海黃’中77種?！P’中含量較高的主要化合物由高到低為醛類、醇類、其他類、烷烴類和烯烴類，含量前十的化合物為橙花醇、1,3,5-三甲氧基苯、檸檬醛、橙花醛、（E）-肉桂醛、香茅醇、β-羅勒烯、（E）-2-壬烯醛、十五烷、十七烷?！阌瘛泻枯^高的主要化合物由高到低為醇類、其他類、烷烴類、酯類和烯烴類，含量前十的化合物為香茅醇、1,3,5-三甲氧基苯、十五烷、苯甲酸乙酯、大牛兒烯、十七烷、十三烷、β-羅勒烯、順-9-十四碳烯、十四烷。‘海黃’中含量較高的主要化合物由高到低為烯烴類、醇類、醛類、烷烴類、酯類。芳樟醇、（1S,4aR,8aS）-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氫萘、（E）-肉桂醛、十七烷、苯甲酸乙酯、二環(huán)大根香葉烯、橙花醛、檸檬醛、石竹烯、7-甲基-3-亞甲基-6-辛烯-1-醇。

從不同品種間來看，‘丹鳳’花瓣中醛類的含量為遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于‘香玉’和‘海黃’。其中3種牡丹花瓣中均有的化合物為己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E）-2-壬烯醛、橙花醛和檸檬醛，含量之間均有顯著性差異（P<0.05）。‘丹鳳’中橙花醛和檸檬醛含量很高，分別為8.67%和9.43%，顯著（P<0.05）高于‘香玉’和‘海黃’。檸檬醛具有檸檬的清香，存在于檸檬等多種芳香植物中[16?17]。橙花醛是一種常見的香氣物質(zhì)，是檸檬醛的同分異構(gòu)體[18]。（E）-肉桂醛也存在于肉桂精油中，具有抗菌功效[19]。（E,Z）-2,6-壬二烯醛具有典型的黃瓜清香。苯甲醛具有杏仁味的氣味。

續(xù)表1

續(xù)表1

酮類共檢測(cè)鑒定出3種，在3種牡丹花瓣中含量都比較低。

醇類物質(zhì)中3種牡丹花共同含有的化合物為3-甲基-1-丁醇、苯甲醇、芳樟醇、1-壬醇、順-9-十四碳烯-1-醇。‘海黃’中芳樟醇的含量很高，為24.23%，顯著高于另外兩種牡丹花。芳樟醇具有青甜的花香氣息，是薰衣草、蘭花、茉莉花香氣的主要揮發(fā)性成分，也是綠茶香氣的主要成分，是目前食物、日化香精香料的主要來源[20?21]。橙花醇只在‘丹鳳’和‘海黃’中鑒定出，且在‘丹鳳’中含量很高，為15.14%。橙花醇具有較強(qiáng)的玫瑰和橙花香氣，作為一類貴重香料廣泛用于食品和化妝品等領(lǐng)域。香茅醇只在‘丹鳳’和‘香玉’中鑒定出，在‘香玉’中含量高達(dá)51.19%。有研究表明香茅醇是芍藥花揮發(fā)性物質(zhì)中的特質(zhì)成分。香茅醇具有淡甜的玫瑰味，可抑制霉菌飽子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，在儲(chǔ)糧保鮮和驅(qū)除害蟲上具有很好的效果[22]。醇類物質(zhì)在3種牡丹花中含量都比較高，對(duì)牡丹花香氣貢獻(xiàn)較大。袁琴琴等[23]在研究牡丹花茶湯的風(fēng)味物質(zhì)時(shí)，結(jié)果顯示，醇類是含量最多的化合物，對(duì)香氣有著較大貢獻(xiàn)。

酸類物質(zhì)僅檢測(cè)鑒定出了苯甲酸和橙花酸兩種。橙花酸可由花瓣中的橙花醇經(jīng)氧化產(chǎn)生。

酯類物質(zhì)中3種牡丹共同鑒定出的化合物有5種，分別為苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸異戊酸、十二酸乙酯和十六酸乙酯。苯甲酸乙酯的含量相對(duì)較高，在‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’中的含量分別為2.37%、3.54%和3.90%。酯類多具有花香、水果香氣，由醇類和酸類通過酯化反應(yīng)生成。苯甲酸乙酯具有似依蘭油的花香氣息[24]，是調(diào)配花香香精的常用香料物質(zhì)。酯類物質(zhì)對(duì)牡丹的香氣具有重要貢獻(xiàn)。

鑒定出的烷烴類物質(zhì)多為3種牡丹花共有物質(zhì)。其中十五烷和十七烷的相對(duì)含量較高。烯烴類物質(zhì)中，在‘丹鳳’和‘香玉’中含量較高的為β-羅勒烯和大牛兒烯。β-羅勒烯在‘丹鳳’和‘香玉’中分別為5.32%和1.35%，大牛兒烯分別為1.93%和3.35%。這兩種化合物在‘海黃’中均未檢測(cè)到。在‘海黃’中含量較高的烯烴類物質(zhì)為（1S,4aR,8aS）-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氫萘、二環(huán)大根香葉烯、石竹烯、葎草烯、δ-杜松油烯，含量分別為22.8%、2.84%、2.14%、1.62%、1.07%。烯烴類化合物中鑒定出的化合物多為萜烯類物質(zhì)，這是一類以異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單位的天然化合物，多存在于植物中。萜類參與多種植物激素的合成，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等生物學(xué)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[25]。部分萜烯類化合物具有揮發(fā)性，對(duì)植物的香氣起重要貢獻(xiàn)作用，如石竹烯具有辛香、木香、柑橘氣味、丁香香氣[17]，這些香氣物質(zhì)多為植物精油的重要組分，[26]。

其他類化合物中，僅1,3,5-三甲氧基苯在3種牡丹花中均鑒定出，其含量在丹鳳’和‘香玉’中較高，分別為11.34%、15.25%，而在‘海黃’中僅為0.12%。1,3,5-三甲氧基苯具有發(fā)酵后熟茶的甘醇沉香氣息。以間苯三酚為最初的底物，經(jīng)過3個(gè)酶催化形成最終芳香產(chǎn)物1，3，5-三甲氧基苯[27?28]。但反式-芳樟醇氧化物（呋喃型）僅在‘海黃’中檢測(cè)出，含量為1.98%。草蒿腦具有大茴香樣香氣，常存在于芳香植物中。2-戊基呋喃具有青香、豆香，在茶葉香氣中常檢測(cè)到[29]。

2.2 主成分分析（PCA）

主成分分析能從總體上反映3種牡丹花瓣的成分差異及3種牡丹花之間的變異度大小。使用SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Par處理（即對(duì)數(shù)據(jù)中心化后除以列變量標(biāo)準(zhǔn)差的算術(shù)平方根）后進(jìn)行自動(dòng)建模分析見圖3。

圖3 3種牡丹花瓣香氣成分PCA 分析Fig.3 PCA analysis of volatilecompoundsin three Paeonia petals

由圖3所示，R2X=0.972，Q2=0.940，Q2≥0.5，說明模型擬合度較好。PCA模型能從總體上反映各組樣本之間的總體差異及變異度，可用做分析3種牡丹花的聚集、離散程度。從圖3可以明顯看出3組牡丹花的分布及區(qū)間距離差異，說明品種間區(qū)別較明顯，3種牡丹花瓣所含有的揮發(fā)成分差異較大。

2.3 不同牡丹花瓣中的差異成分分析

OPLS-DA作為一種有監(jiān)督的降維、判別分析方法，通過正交化將數(shù)據(jù)信息中與類別信息無關(guān)（正交）的數(shù)據(jù)剔除，更容易排除與分類無關(guān)的自變量，篩選出各類樣本的特征變量[30]。變量投影重要性（VIP）是一種篩選信息變量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，反映了OPLSDA模型對(duì)各個(gè)化合物的評(píng)分。一般認(rèn)為，當(dāng)VIP>1時(shí)，則表明該變量對(duì)于模型中類別的分類有著較為重要的意義[31]。采用OPLS-DA模型的主成分1的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）大于1來尋找差異成分，3種牡丹花的差異成分見表2。

如表2所示，‘丹鳳’和‘香玉’之間的差異成分有12種，‘香玉’和‘海黃’之間差異成分有10種，‘丹鳳’和‘海黃’之間有12種差異成分。‘丹鳳’和‘香玉’差異成分中醛類物質(zhì)較多，有5種，這些物質(zhì)主要呈現(xiàn)青香、花香。這與‘丹鳳’花瓣較‘香玉’花瓣青香味較重相一致?！阌瘛汀｜S’之間的差異成分中含有2種醛、3種醇、2種烯烴。其中，（E）-肉桂醛具有肉桂的香氣，使得‘海黃’的香氣更加溫潤(rùn)，柔和。醇類物質(zhì)多具有甜香，差異成分中醇類物質(zhì)較多，這與‘海黃’比‘香玉’在甜香香韻上較為突出有較大關(guān)系?！P’和‘海黃’之間差異成分中含有烯烴物質(zhì)3種，醇類2種。差異成分中的兩種醇為香茅醇和芳樟醇，分別具有淡玫瑰香氣和青甜的花香氣息，‘海黃’中芳樟醇含量遠(yuǎn)高于‘丹鳳’，其香甜氣也重于‘丹鳳’。

表2 3種牡丹花香氣物質(zhì)差異成分Table 2 Differential components of three Paeonia petals

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC/MS手段對(duì)‘丹鳳’、‘香玉’和‘海黃’3種不同品種牡丹花瓣中的香氣物質(zhì)進(jìn)行了分析，共鑒定出115種化合物，發(fā)現(xiàn)牡丹花瓣主要揮發(fā)性組分為醛類、醇類、酯類和烯烴類物質(zhì)。3種品種中‘丹鳳’是化合物種類最為豐富的品種。PCA、OPLS-DA分析從3種品種牡丹花瓣香氣組分中共篩選出19種差異成分，分別為（E,Z）-2,6-壬二烯醛、（E）-2-壬烯醛、橙花醛、（E）-肉桂醛、反式-芳樟醇氧化物（呋喃型）、芳樟醇、7-甲基-3-亞甲基-6-辛烯-1-醇、檸檬醛、橙花醇、香茅醇、十五烷、3-苯基-2-丙烯-1-醇、反-草酸甲酯、1,3,5-三甲氧基苯、石竹烯、β-羅勒烯、大牛兒烯、（1S，4aR，8aS）-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氫萘、二環(huán)大根香葉烯。三種牡丹花中，‘丹鳳’青香味較重，‘海黃’甜香香韻較為突出，‘香玉’青香和甜香均比較適中。

通過分析可知，3種品種牡丹花瓣香氣成分在化合物種類和含量上都存在很大差異，綜合表現(xiàn)在香氣上，形成了不同品種牡丹獨(dú)特的香氣特點(diǎn)。對(duì)不同牡丹花瓣香氣成分進(jìn)行解析，找到構(gòu)成香氣的關(guān)鍵組分并確定其含量比例，對(duì)香精研制至關(guān)重要，但由于香氣物質(zhì)組成復(fù)雜，含量較低。有些香氣物質(zhì)雖然含量極微，但氣味閾值很低，對(duì)香氣貢獻(xiàn)很大。因此，有待進(jìn)一步采用嗅聞分析等手段篩選關(guān)鍵香氣物質(zhì)，以期開發(fā)出香氣逼真的牡丹香精產(chǎn)品，促進(jìn)牡丹食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。