李凱龍,陳武瑛,陳同強(qiáng),張 忞,熊志林,王 丹,陳 昂,
(1.湖南省植物保護(hù)研究所/湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境安全評(píng)價(jià)中心,湖南長沙 410125;2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖南長沙 410111)
食品加工不僅可以改變食品的品質(zhì)特性,增加食品附加值,還會(huì)對(duì)食品中農(nóng)藥殘留的水平產(chǎn)生影響[1]。在開展膳食中農(nóng)藥殘留暴露評(píng)估時(shí),考慮加工過程對(duì)農(nóng)藥殘留的影響,對(duì)于正確評(píng)估農(nóng)藥的膳食攝入,保障農(nóng)藥暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的準(zhǔn)確性具有重要意義[1?3]。國內(nèi)外研究表明蔬菜加工過程能減少農(nóng)藥殘留水平,而不同加工過程和加工方式對(duì)減少農(nóng)藥殘留效果有所不同[4],包括清洗方式[5]、清洗劑[6]、烹飪方式[7?10]、儲(chǔ)存方式[11]和消毒方式[12?14]等對(duì)農(nóng)藥殘留影響。大多數(shù)加工過程可在很大程度上降低食品中的農(nóng)藥殘留水平,如清洗、去皮、榨汁等;但有些加工過程,如干燥或濃縮,由于受食品中水分揮發(fā)等因素的影響,使得某些農(nóng)藥的殘留水平升高[15]。而對(duì)于腌制蔬菜的加工過程對(duì)于蔬菜農(nóng)藥殘留的影響研究較少,特別是無氧環(huán)境下的腌制過程。
剁辣椒作為一種典型的無氧腌制加工蔬菜,其傳統(tǒng)加工方法是利用乳酸菌的自然發(fā)酵和食鹽保存作用進(jìn)行加工處理[16]。剁辣椒的家常加工制作過程為經(jīng)水洗、去蒂、晾干、切碎的辣椒及輔料放入高鹽無氧密封的條件下,利用食鹽抑制辣椒生理作用使其熟化,同時(shí)利用辣椒表面附著或后來添加的微生物發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味而制成受人喜愛的剁辣椒[17]。國內(nèi)學(xué)者在剁辣椒發(fā)酵工藝、發(fā)酵微生物、風(fēng)味品質(zhì)等方面進(jìn)行了大量研究[18?20],但對(duì)剁辣椒加工過程中農(nóng)藥殘留動(dòng)態(tài)的研究尚未見報(bào)道。鑒于此,本研究選擇辣椒種植過程中常用的吡蟲啉(imidacloprid)、啶蟲脒(acetamiprid)、精甲霜靈(metalaxyl-M)、嘧菌酯(azoxystrobin)和苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)5種農(nóng)藥(結(jié)構(gòu)式見圖1),同時(shí)吡蟲啉和啶蟲脒也是檢出率較高的農(nóng)藥[21?22]。通過沉積農(nóng)藥處理后,研究在水洗、晾干、切碎、加鹽腌制加工工藝過程中5種農(nóng)藥的殘留變化情況及其加工因子,結(jié)合農(nóng)藥的理化參數(shù)探索加工因子的變化規(guī)律。研究結(jié)果可為更科學(xué)的膳食評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐,也可結(jié)合農(nóng)藥的理化特性合理指導(dǎo)農(nóng)藥的規(guī)范使用和為生產(chǎn)健康安全的辣椒制品提供參考。
圖1 5種農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of 5 insecticides
供試紅線椒(Capsicum annuumL.) 購自長沙市農(nóng)貿(mào)市場;5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于95%) 購自德國Dr.Ehrenstorfe公司,理化性質(zhì)見表1;70%吡蟲啉水分散粒劑 德國拜耳公司;20%啶蟲脒水分散粒劑 河北野田農(nóng)用化學(xué)有限公司;10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、39%精甲霜靈·嘧菌酯懸乳劑 瑞士先正達(dá)公司;乙腈、甲醇 色譜純,德國MERCK默克公司;氯化鈉 優(yōu)級(jí)純,上海國光試劑有限責(zé)任公司;超純水 美國Millipore公司超純水器。
表1 5種農(nóng)藥的理化性質(zhì)、施用劑量及最大殘留限量Table 1 Physicochemical properties,dose ratesof application and MRL of five pesticides
AB SCIEX 4500 QTRAP液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配ESI源 美國AB Sciex公司;Elix5超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;SK-1快速混勻器 浙江省金壇市科析儀器有限公司;移液槍 德國eppendorf公司;T18-B-S25勻漿儀 德國IKA公司;TP-402天平 美國Denver公司。
1.2.1 樣品預(yù)處理 分別稱取一定量的5種農(nóng)藥制劑于20 L超純水中,配制成50 mg/L的混合溶液。稱取10.0 kg辣椒樣品置于該混合溶液中浸泡30 min后撈出、濾干,于通風(fēng)處靜置24 h,即為沉積農(nóng)藥后的樣品P0,用于試驗(yàn)。
1.2.1.1 水洗(P1) 取沉積農(nóng)藥后的辣椒樣品,在水流速為5.0 L/min的狀態(tài)下沖洗5 min,或者在清水中浸泡水洗5 min后濾干水,取300 g樣品(3份,100 g/份)粉碎備用。
1.2.1.2 晾干(P2) 分別取經(jīng)水洗后的辣椒樣品置于陰涼處吹干水氣,之后從中取300 g樣品(3份,100 g/份)粉碎備用。
1.2.1.3 切碎(P3) 分別取經(jīng)水洗、晾干后的辣椒樣品用干凈的刀具、砧板將辣椒切碎,取300 g樣品(3份,100 g/份)備用。
1.2.1.4 加鹽腌制(P4) 分別取經(jīng)水洗、晾干、切碎后的9.0 kg辣椒樣品,加入0.9 kg食鹽,充分?jǐn)噭?,放? min,待辣椒腌出汁來,取300 g樣品備用,再分裝于3個(gè)密封壇子中腌制,分別在腌制后的2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和21 d取300 g樣品(3份,100 g/份)備用。
1.2.2 樣品的提取、凈化與檢測 參照文獻(xiàn)中的QuEChERS方法[23],并進(jìn)行改進(jìn)后,進(jìn)行提取和凈化。稱取均質(zhì)的辣椒樣品5.00 g(精確至0.1g)于50 mL塑料離心管中,再加入10.0 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液、600.0 mg無水MgSO4和1.0 g氯化鈉,振蕩提取10 min后在5000 r/min下離心5 min,取出乙腈層于100 mL雞心瓶中,再加10 mL乙腈重復(fù)提取1次,均質(zhì)離心后合并乙腈層,將提取液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL。少量多次加入乙腈渦旋溶解并定容至10.0 mL,取5.0 mL于預(yù)先加入200.0 mg C18填料的離心管中,渦旋提取15 s,在5000 r/min下離心5 min,取上層提取液1.0 mL,過0.45μm有機(jī)相濾膜后,上機(jī)分析測定。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作溶液的配制 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100.0μg/mL)的配制:取適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈稀釋成100.0μg/mL的儲(chǔ)備液,于?20℃冰箱避光保存。準(zhǔn)確吸取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈定容,得到5種農(nóng)藥1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液,于?20℃冰箱避光保存?;|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的配制:稱取5.0 g空白辣椒樣品共7份,進(jìn)行樣品1.2.2的前處理過程后,由此獲得空白基質(zhì)溶液。準(zhǔn)確吸取一定量的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)中間液或標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1.0 mL容量瓶中,用空白基質(zhì)液定容,配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用,以峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,采取外標(biāo)法定量。
1.2.4 檢測條件 色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8μm),流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈,流速0.4 mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量1.0μL。流動(dòng)相梯度洗脫條件:0~0.8 min,90%A;0.8~2.8 min,90%A~50%A;2.8~4.8 min,50%A~10%A;4.8~6.8 min,10%A;6.8~7.8 min,10%A~90%A;7.8~10.0 min,90%A。
質(zhì)譜條件:離子化電壓5.5 k V,離子源溫度500℃,氣簾氣壓力40 psi,噴霧氣壓力45 psi,5種農(nóng)藥均采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式測定,具體參數(shù)分別見表2。
表2 5種農(nóng)藥的LC-MS/MS分析參數(shù)Table2 Experimental parametersand LC-MS/MSconditionsof the pesticidesstudied.
采用Excel表格進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖,利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩個(gè)處理數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,兩個(gè)以上處理數(shù)據(jù)采用兩因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行比較,P值<0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。
加工因子PF(processing factor)是指產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量與原料中的農(nóng)藥殘留量比值[24],本研究用加工因子來衡量剁辣椒不同加工工序處理后農(nóng)藥殘留量的變化情況,其計(jì)算公式如下:
式中:c0表示加工前樣品中農(nóng)藥含量平均值;c表示經(jīng)過加工處理后樣品中農(nóng)藥含量平均值。單位均以mg/kg計(jì)。
農(nóng)藥暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算:
其中IEDI(International Estimated Daily Intake)為國際日攝入估計(jì)(mg/kg bw),STMRi(Supervised Trials Median Residue)、Ei、Pi和Fi分別指農(nóng)藥殘留的中位數(shù)水平、食品可食部分因子、食品的加工因子和膳食消費(fèi)量[25]。為了簡化評(píng)估過程,中位數(shù)STMRi采用初始樣品中的測定值(mg/kg),Ei=1,Pi為試驗(yàn)的加工因子,F(xiàn)i為引用汪曉銀等的數(shù)據(jù),計(jì)算我國城市人口每天蔬菜的平均消費(fèi)量為335 g[26];ADI為每千克體重的農(nóng)藥日允許攝入量(mg/kg),bw為我國人均體重,一般按60 kg計(jì)算。
常用的分散固相萃取的凈化吸附劑主要有選擇離子交換吸附劑(primary secondary amine,PSA)、惰性吸附劑(C18)和石墨化炭黑,研究發(fā)現(xiàn)石墨化炭黑吸附劑能去除食品基質(zhì)中的色素和甾醇的影響,但本研究中發(fā)現(xiàn)石墨化炭黑對(duì)精甲霜靈和嘧菌酯的吸附作用較大,添加回收率較低(43.2%~56.7%),不宜采用;故選用對(duì)多糖、肽類(包括氨基酸)和色素有強(qiáng)吸附作用的PSA和對(duì)色素和油脂等弱極性雜質(zhì)有較強(qiáng)保留作用的C18作為固相萃取劑進(jìn)行凈化處理[27]。本實(shí)驗(yàn)比較了40 mg/mL PSA、80 mg/mL PSA、40 mg/mL C18和80 mg/mL C18四組凈化劑對(duì)空白基質(zhì)中添加水平為0.1 mg/kg的5種農(nóng)藥凈化效率的影響,結(jié)果表明,在1.0 mL待凈化液中添加80 mg凈化劑后5種農(nóng)藥的回收率較添加40 mg凈化劑低,而添加40 mg PSA和40 mg C18對(duì)5種農(nóng)藥的回收率沒有顯著差異(5種農(nóng)藥回收率平均值分別為91.4%和92.3%),但C18凈化得到的色譜峰基質(zhì)影響更小,凈化效果要優(yōu)于PSA,因此選擇C18作為本試驗(yàn)的固相萃取材料。
吡蟲啉、啶蟲脒、嘧菌酯、精甲霜靈和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照1.2.4節(jié)LC-MS/MS方法進(jìn)行分析,每個(gè)基質(zhì)標(biāo)曲濃度進(jìn)樣3次,以質(zhì)量濃度為x軸,峰面積為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到上述5種化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,上述5 種化合物的線性回歸系數(shù)R2在0.99699~0.99950之間,能滿足定量分析要求。
以0.01、0.1和1.0 mg/kg 3個(gè)水平添加混合標(biāo)準(zhǔn)液到空白辣椒樣品中,然后按1.2.2節(jié)方法對(duì)樣品進(jìn)行分析,每個(gè)添加水平做10次平行,計(jì)算辣椒中各農(nóng)藥的回收率及變異系數(shù),結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,辣椒中5種農(nóng)藥的平均回收率在85.4%~100.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%~8.3%之間。表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求[28],能夠滿足實(shí)際樣品的殘留檢測分析,空白基質(zhì)A、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液B和加藥剁辣椒樣品C中5種農(nóng)藥的總離子色譜圖見圖2。
圖2 5種農(nóng)藥的總離子色譜圖(TIC)Fig.2 Total ion chromatogram (TIC)of 5 pesticides
表3 辣椒中5種農(nóng)藥的線性回歸系數(shù)、加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table3 Regression coefficients(R2),recovery and relative standard deviation (RSD)in linearity conditionsfor the pesticides studied in lettuce
吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑5種農(nóng)藥的log Kow值在0.57~4.36之間,從表4可以看出,沖洗處理方式較浸泡水洗方式對(duì)5種農(nóng)藥的去除效果均較好,不同農(nóng)藥在水洗過程中,農(nóng)藥的log Kow值越大,水洗處理對(duì)該農(nóng)藥的去除效果越差,且隨著加工時(shí)間的增加PF的變化幅度越小。苯醚甲環(huán)唑的logKow值為4.36,隨時(shí)間的增加,PF值雖有減小的趨勢,但減小的幅度較小,而吡蟲啉和啶蟲脒的log Kow值均小于1,隨時(shí)間的增加PF值減小程度較大,在沖洗10 min后,吡蟲啉和啶蟲脒的PF值可分別達(dá)到0.54和0.59。從浸泡和沖洗方式對(duì)5種農(nóng)藥的去除效果看,吡蟲啉的去除效果最為明顯,而苯醚甲環(huán)唑的去除效果最差,且沖洗方式較浸泡方式對(duì)農(nóng)藥的去除效果明顯。
表4 剁辣椒不同水洗方式和不同時(shí)間對(duì)5種農(nóng)藥的加工因子Table 4 Processing factors of five pesticide residues with different treatments in chopped pepper
剁辣椒在未加工和不同階段加工過程中農(nóng)藥殘留水平見圖3。結(jié)果表明,在農(nóng)藥沉積實(shí)驗(yàn)中,在用藥劑量相同的情況下,5種農(nóng)藥在辣椒中的初始沉積量具有較大差異,特別是苯醚甲環(huán)唑的初始沉積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他4種農(nóng)藥,說明不同藥劑在辣椒中的殘留水平有差異,這可能與苯醚甲環(huán)唑的高log Kow值和高滲透性等有關(guān)。初剁辣椒不同加工階段對(duì)所有農(nóng)藥的影響有相似之處,5種農(nóng)藥殘留在經(jīng)過整個(gè)剁辣椒加工工序后的農(nóng)藥殘留均有大幅下降,且在用水沖洗時(shí)均出現(xiàn)明顯下降,不同洗滌方式(包括水浸泡5 min和水沖洗5 min)去除的農(nóng)藥殘留有差別,且用水沖洗去除農(nóng)藥殘留效果更好。不同清洗方式對(duì)豇豆種農(nóng)藥殘留的影響研究中也發(fā)現(xiàn),沖洗和振動(dòng)清洗較浸泡清洗對(duì)農(nóng)藥殘留的清除效果好[8]。而不同農(nóng)藥的降解率的差異可能與農(nóng)藥的理化特性有關(guān),因?yàn)檗r(nóng)藥的log Kow值越高越容易進(jìn)入農(nóng)產(chǎn)品表面的蠟質(zhì)層,清洗時(shí)不易溶解在清洗液中而被去除,故很難降低農(nóng)產(chǎn)品上這些農(nóng)藥的殘留量[29]。
圖3 剁辣椒加工過程中的農(nóng)藥殘留水平Fig.3 Pesticide residues in chopped pepper during processing
剁辣椒水洗后的晾干和切碎過程對(duì)5種農(nóng)藥殘留的去除作用不明顯,表5結(jié)果表明,晾曬過程5種農(nóng)藥的加工因子在0.91~1.03之間,而切碎過程5種農(nóng)藥的加工因子在0.88~0.99之間。加鹽腌制過程對(duì)5種農(nóng)藥的殘留影響有差異,log Kow值小于2的吡蟲啉、啶蟲脒和精甲霜靈三種農(nóng)藥,加鹽腌制2 h的加工因子分別為0.91、1.00、0.96;而logKow值大于2的嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑,加鹽腌制2 h的加工因子分別為0.71和0.47,說明農(nóng)藥的log Kow值越大,加鹽腌制處理對(duì)該農(nóng)藥的去除效果越好,這與水洗過程中的加工因子關(guān)系相反。黃瓜加工過程對(duì)農(nóng)藥加工因子影響也有類似現(xiàn)象,吡蟲啉(log Kow值=0.57)加鹽腌制2 h的加工因子為0.91,而氯氰菊酯(log Kow值=6.30)加鹽腌制2 h加工因子為0.68[30]。這些規(guī)律為降低log Kow值較高農(nóng)藥的殘留量提供了一種加工處理方式的新思路。
表5 剁辣椒不同加工階段對(duì)5種農(nóng)藥的加工因子Table 5 Processing factors of five pesticide residues with different treatmentsin chopped pepper
隨著剁辣椒腌制時(shí)間的增加,在腌制0~7 d農(nóng)藥的殘留量下降較快,但7 d后殘留量下降很緩慢,特別是14 d后5種農(nóng)藥的加工因子均大于0.85,說明在剁辣椒腌制后期這5種農(nóng)藥的降解速率變慢了。剁辣椒在加鹽腌制后是一種由有氧環(huán)境逐漸變?yōu)闊o氧環(huán)境的過程,剁辣椒中的好氧微生物逐漸被厭氧乳酸菌所代替,而這可能是在腌制后期剁辣椒中農(nóng)藥降解速率變慢的原因。
盡管剁辣椒整個(gè)加工過程中5種農(nóng)藥在不同加工階段的加工因子有所不同,但從整個(gè)加工過程分析發(fā)現(xiàn),加工全過程對(duì)5種農(nóng)藥的殘留去除效果均比較明顯,剁辣椒加工全過程(至腌制21 d止),吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑的全過程加工因子分別為0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。
在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中一般用農(nóng)藥殘留攝入的最大理論日攝入估計(jì)(Theoretical Maximum Daily Intake,TMDI)評(píng)估農(nóng)藥的暴露風(fēng)險(xiǎn),但由于以MRL為農(nóng)藥殘留水平,往往高于實(shí)際殘留水平,所以造成過高估計(jì)。所以一般用國際日攝入估計(jì)(International Estimated Daily Intake,IEDI)作為TMDI的評(píng)估校正,農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)越低,說明攝入膳食越安全。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和公式,計(jì)算剁辣椒加工對(duì)食用剁辣椒的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)的影響。從表6可以看出,經(jīng)過剁辣椒家常腌制21 d后5種農(nóng)藥的農(nóng)藥殘留的膳食暴露量大大降低,膳食風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)分別較未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。
表6 試驗(yàn)農(nóng)藥的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)Table6 Risk index of dietary exposure for tested pesticide
綜上所述,吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑的全過程加工隨著加工時(shí)間的增加農(nóng)藥殘留量呈降低的趨勢,全過程加工因子分別為0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。而5種農(nóng)藥在剁辣椒加工不同加工階段的加工因子規(guī)律有所不同,吡蟲啉、啶蟲脒和精甲霜靈的水洗PF值在整個(gè)加工過程中最小,而嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑的加鹽腌制PF值在整個(gè)加工過程中最小。本研究發(fā)現(xiàn)引起剁辣椒不同加工階段對(duì)農(nóng)藥殘留影響的差異可能與農(nóng)藥本身的理化特性密不可分,log Kow(辛醇水分配系數(shù))值小的農(nóng)藥,在水洗處理下的殘留量少,且沖洗處理較浸泡處理去除農(nóng)藥效果好;而log Kow值大的農(nóng)藥,在加鹽腌制處理下的殘留量少,且在剁辣椒腌制的無氧環(huán)境中農(nóng)藥降解速率逐漸變緩。
剁辣椒加工過程可減少農(nóng)藥殘留的膳食風(fēng)險(xiǎn)指數(shù),通過將辣椒產(chǎn)品加工成剁辣椒的方法來降低辣椒中的農(nóng)藥殘留,減少其膳食攝入量。試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過家常剁辣椒加工腌制21 d后5種農(nóng)藥的膳食風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)分別較未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。因此希望有關(guān)部門應(yīng)結(jié)合農(nóng)產(chǎn)品加工工藝和農(nóng)藥的理化特性合理評(píng)估膳食中的農(nóng)藥暴露水平,同時(shí)希望通過不斷優(yōu)化農(nóng)產(chǎn)品加工工藝以減少農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留,保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。