高壓濕熱法改性玉米醇溶蛋白膜的工藝優(yōu)化及性能分析

董 爽，李曉宇，桑煒才，陳 野，李宏軍,

（1.山東理工大學農業(yè)工程與食品科學學院，山東淄博 255000；2.天津科技大學食品科學與工程學院,天津 300457）

玉米醇溶蛋白（zein）作為工業(yè)上生產玉米淀粉的主要副產物，其含量約占玉米總蛋白的50～60%[1?3]。玉米醇溶蛋白含有較多非極性氨基酸，具有較強的疏水作用力[4]。此外，分子結構中含硫氨基酸比重較大，分子間及分子內通過二硫鍵緊密相連[5]。玉米醇溶蛋白在醇水溶液中以無規(guī)則線團形式存在[6]，當溶劑蒸發(fā)后，蛋白質分子間通過疏水作用力、二硫鍵和氫鍵自組裝形成網絡狀結構，即玉米醇溶蛋白膜[7]。玉米醇溶蛋白膜透明，有光澤，且具有安全無毒、隔氧、阻油、抗紫外線、防靜電、可降解等特性[8?9]，在包裝材料、藥物遞送、細胞組織支架材料、果蔬保鮮等領域有著較大的應用潛力[10?12]。

針對玉米醇溶蛋白的研究多集中在提高其機械性能[13]、抗菌性[14]以及溶解性[15]。Dong等[16]分別通過自組裝單分子層法（SAM）和蒸發(fā)誘導自組裝法（EISA）誘導制備高疏水性玉米醇溶蛋白膜。研究證明通過調節(jié)玉米醇溶蛋白濃度和蒸發(fā)時間可以控制蛋白膠束粒徑。通過提高膜表面粗糙度，接觸角最高可達126°。徐慧等[17]通過電場對玉米醇溶蛋白進行誘導成膜，研究發(fā)現乙醇體積分數90%時膜靜態(tài)接觸角可達到最大值為62.46°，通過調節(jié)溶劑濃度可獲得具有一定疏水特性和機械強度的薄膜。雖然對于提高玉米醇溶蛋白膜疏水性的研究較為廣泛，但這些研究多集中于膜表面疏水特性的改善，提高玉米醇溶蛋白膜整體耐水性方面的研究較少。與其他兩親性蛋白質類似，未經改性的玉米醇溶蛋白膜耐水性較差[18]，在水相環(huán)境中易吸水溶脹，進而引起透明度的下降。這些不足限制了玉米醇溶蛋白在作為食品包裝材料或作為基材進行細胞培養(yǎng)觀察時的實際應用性，亟需找到合適的改性方法以提高其功能特性。

前期實驗研究發(fā)現，通過對玉米醇溶蛋白膜進行高壓濕熱改性處理后，其阻水能力有明顯改善。高壓濕熱法無有毒試劑殘留，清潔環(huán)保，操作簡單，在蛋白基食品包裝材料領域相比于其他化學改性法、物化改性方法具有較好的應用潛力。

本文通過單因素實驗考察成膜液體積、處理溫度和處理時間對玉米醇溶蛋白膜吸水率和透明度的影響，通過正交試驗優(yōu)化確定最佳改性條件。在此基礎上，對改性前后玉米醇溶蛋白膜的機械性能、抗酶解性以及紅外二級結構進行綜合表征。本研究為高耐水性蛋白基材料的開發(fā)提供數據基礎，有助于拓展玉米淀粉副產物的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米醇溶蛋白 高郵市日星藥用輔料有限公司；無水乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司；丙三醇（甘油） 天津市致遠化學試劑有限公司；胰蛋白酶（≥2500 U/mg） 杭州聯科生物科技有限公司。

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；756PC紫外-可見分光光度計 中國普銳斯儀器有限公司；TA.XT-plus質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白膜的制備 稱量一定量的玉米醇溶蛋白粉末溶解于80%（v/v）乙醇溶液，配制成濃度為15%（w/v）的蛋白溶液，向溶液中加入蛋白質量20%（w/w）的甘油作為增塑劑，磁力攪拌（轉速為300 r/min）30 min直至完全溶解。隨后，在60℃水浴中加熱10 min，趁熱倒入模具，于室溫（25±0.5℃）下自然干燥48 h后揭膜。將制得的玉米醇溶蛋白膜樣品存放于溫度25±0.5℃，相對濕度50%±2%環(huán)境中平衡一周待用[19]。

1.2.2 高壓濕熱改性處理 采用高壓蒸汽滅菌鍋作為高壓濕熱環(huán)境發(fā)生器（相對濕度100%），將樣品膜置于玻璃平皿中，按照1.2.3中的處理條件對玉米醇溶蛋白膜進行高壓濕熱改性。待樣品處理后恢復室溫，放置于相對濕度50%±2%環(huán)境中平衡一周待測。

1.2.3 單因素實驗 固定高壓濕熱改性處理的基本條件為玉米醇溶蛋白成膜液體積7 mL，處理溫度為121℃，處理時間為30 min。在基本參數下分別考察玉米醇溶蛋白成膜液體積（3、5、7、9、11 mL）、高壓濕熱處理溫度（105、115、121、126℃）、高壓濕熱處理時間（10、20、30、40、50 min）對膜吸水率和浸水后透明度兩個指標的影響。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗 根據單因素實驗結果，以綜合得分（S）為評價指標，選擇適宜的水平進行L9（34）正交優(yōu)化試驗并確定高壓濕熱處理的最佳工藝條件。按如下公式計算樣品膜的綜合得分：

式中，S為樣品的綜合得分，S1為樣品的吸水率，%；S2為樣品的透明度。

根據單因素實驗結果設計Box-Behnken Design實驗，設定不同漂燙溫度、漂燙時間、切片厚度和冷凍時間實驗設計結果如表4所示。根據表4試驗結果進行主成分分析。

正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factorsand levelsof orthogonal experiments

1.2.5 吸水率 將樣品裁切成10 mm×25 mm矩形條，50℃烘干至恒重，精確稱量其質量，記為W1；稱重后放入玻璃平皿中，加入40 mL去離子水，室溫下浸泡24 h。隨后取出用濾紙吸附薄膜表面水分，精確稱量此時膜的質量，記為W2；再次將薄膜烘干到恒重，精確稱量其質量，記為W3。通過如下公式計算吸水率（%）[20]：

1.2.6 厚度和透明度 參考Ramos等[21]的方法但有所修改，用電子數顯卡尺精準測量玉米醇溶蛋白膜的厚度，精確度為0.01μm。每個樣品隨機選取三個位置進行測量，取平均值用于透明度的計算。將薄膜裁剪成1.0 cm×2.5 cm的矩形條，將樣品置于石英比色皿中測定波長600 nm處的吸光度，按如下公式計算薄膜的透明度：

1.2.7 力學特性 采用質構儀測定薄膜的抗拉強度（MPa）和斷裂伸長率（%），將樣品裁切成1 cm×6 cm矩形條，初始夾具間距為30 mm，機械十字頭初始間隙為50 mm，探針測試速度為50 mm/min。

1.2.8 體外酶解率 將樣品裁切成2 cm×4 cm的矩形條并放入玻璃平皿中，置于50℃烘箱中干燥至恒重，取出后稱量其質量，記為W1；量取10 mL 0.25%胰蛋白酶的PBS緩沖溶液（p H7.4）加入樣品中，保證樣品完全浸泡，置于37℃生化培養(yǎng)箱中酶解4 h。隨后取出，用濾紙除濾干表面液體，50℃烘箱中干燥至恒重，精確稱量其質量，記為W2。按如下公式計算膜體外酶解率[22]：

1.2.9 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR） 掃描采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR）對玉米醇溶蛋白膜的特征峰和二級結構進行表征，以空氣為空白背景，掃描次數為32，透射模式下對波數4000～675 cm?1進行光譜掃描。采用OMNIC 8.2軟件對酰胺I區(qū)（1700～1600 cm?1）光譜進行基線校正、傅里葉自去卷積（FSD）和二階求導等數據處理，計算出蛋白質中各二級結構單元的相對含量（%）[23]。

1.3 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 成膜液體積 圖1為成膜液體積對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜吸水率和浸水后透明度的影響。由結果可知，隨著成膜液體積的增加，玉米醇溶蛋白膜吸水率整體呈現先降低后升高趨勢，當成膜液體積為9 mL時吸水率達到最低值13.62%±2.04%，同時，浸水后透明度達到最大值168.67±6.54。由圖1可知，透明度的變化與吸水率呈現相反趨勢，吸水率越高表明玉米醇溶蛋白膜的溶脹越嚴重，透明度受其影響也相應下降[24]。

圖1 成膜液體積對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜吸水率和透明度的影響Fig.1 Effect of zein film-forming solution volume on the WAR and transparency of HPHM modified zein film

在薄膜制備過程中，成膜液體積與膜厚度理論上呈正相關關系。實驗測得成膜液體積為3、5、7、9、11 mL時薄膜厚度分別為91.68±4.64、151.33±5.34、198.57±5.41、235.25±16.58、269.17±18.98 μm。成膜液體積較小時制成的玉米醇溶蛋白膜相對較薄。在玉米醇溶蛋白膜干燥過程中，隨著成膜液體積的增加，有更多的玉米醇溶蛋白分子參與到極性自組裝過程[25]，形成了牢固的蛋白網絡結構，其耐水性能相應較強。但當成膜液體積達到11 mL時，吸水率反而有所提高，透明度也相應下降。其原因包括兩個方面：一是實驗中薄膜制備模具尺寸固定，過量的成膜液會影響乙醇-水溶劑的揮發(fā)速率，進而降低薄膜的均勻性，導致吸水率小幅度上升。11 mL樣品較大的厚度標準偏差值（18.98μm）可以反映出薄膜的均勻性差。二是玉米醇溶蛋白膜的厚度對力學性質影響顯著，郭興鳳等[25]研究發(fā)現在一定厚度范圍內，玉米醇溶蛋白膜越厚，抗拉強度越小。因此，成膜液體積通過厚度間接影響薄膜力學強度以及在高壓濕熱處理環(huán)境中的耐受度，進而造成吸水率不降反升。結合上述結果，選擇7、9、11 mL作為正交試驗的優(yōu)化水平。

2.1.2 高壓濕熱處理溫度 圖2為高壓濕熱處理溫度對玉米醇溶蛋白膜吸水率和浸水后透明度的影響。由結果可知，吸水率呈現先降低后升高的趨勢，透明度相應地呈現相反趨勢。處理溫度為121℃時，吸水率達到最低值16.67%±1.68%，此時透明度為最大值112.56±5.35，顯著高于其他處理溫度樣品（P<0.05）。在固定其他條件不變的前提下，隨著高壓濕熱處理溫度的增加，反應腔內的壓力隨之增加。處理溫度為121℃時，反應腔內壓力可達到103.4 kPa。高壓濕熱環(huán)境誘導玉米醇溶蛋白膜舊化學鍵斷裂，生成新鍵。蛋白膜分子間形成了新的二硫鍵使蛋白網絡結構更緊密[24?25]，有利于限制水分子浸潤。然而，當進一步提高處理溫度，較高的溫度加劇了分子熱運動[26]，使蛋白質與水之間親和力增強，導致吸水率不降反升。結合上述結果，選擇115、121、126℃作為正交試驗的優(yōu)化水平。

圖2 高壓濕熱處理溫度對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜吸水率和透明度的影響Fig.2 Effect of treatment temperature on the WAR and transparency of HPHM modified zein film

2.1.3 高壓濕熱處理時間 圖3為高壓濕熱處理時間對玉米醇溶蛋白膜吸水率和浸水后透明度的影響。由結果可知，隨著高壓濕熱處理時間的延長，玉米醇溶蛋白膜的吸水率和透明度變化相對較小。雖然在30 min處理時的吸水率達到最低值，但在統(tǒng)計分析上并沒有顯著差異（P>0.05）?？梢娤啾扔诹硗鈨蓚€因素，高壓濕熱處理時間對玉米醇溶蛋白膜的吸水率和透明度影響較小。結合圖3結果，選擇20、30、40 min作為正交試驗的優(yōu)化水平。

圖3 高壓濕熱處理時間對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜吸水率和透明度的影響Fig.3 Effect of treatment time on the WAR and transparency of HPHM modified zein film

2.2 正交試驗

在單因素實驗基礎上，以綜合得分（S）為優(yōu)化指標進行L9（34）正交試驗，進一步優(yōu)化玉米醇溶蛋白膜的高壓濕熱法改性工藝，正交試驗設計及結果如表2所示。由表2中極差值R可知，各因素對玉米醇溶蛋白膜吸水率和透明度影響的主次順序為A（成膜液體積）>B（處理溫度）>C（處理時間）。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Orthogonal experimental scheme and results

對正交試驗結果進行方差分析，結果如表3所示。由結果可知，成膜液體積對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜的影響最大，達到顯著水平（P<0.05），與極差分析結果一致。

表3 正交試驗方差分析Table3 Analysis of variance of orthogonal experiment

結合正交試驗和方差分析結果可知，最優(yōu)組合為A2B2C3，即玉米醇溶蛋白成膜液體積9 mL、處理溫度121℃、處理時間40 min。在此條件下進行三次驗證試驗，測得改性玉米醇溶蛋白膜的吸水率為11.35%±0.74%，透明度為181.30±3.29。而未處理的玉米醇溶蛋白膜吸水率為148.23%±2.56%，透明度為47.51±1.30。為了直觀反映高壓濕熱處理對玉米醇溶蛋白膜浸水后透明度的影響，對未處理和最佳改性處理條件下的玉米醇溶蛋白膜進行拍照觀察，結果如圖4所示。由圖4可以看出，高壓濕熱改性前后玉米醇溶蛋白膜的透明度有較大差異。未處理的膜樣品下圖片較為模糊，而經過改性處理后的蛋白膜下方圖像仍清晰可辨。上述結果證明，高壓濕熱處理能夠有效降低玉米醇溶蛋白膜的吸水率，提高浸水后的透明度。

圖4 高壓濕熱處理前后玉米醇溶蛋白膜的透明度Fig.4 Transparency of zein film beforeand after HPHM modification

2.3 高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜的機械特性和抗酶解性

以未處理的玉米醇溶蛋白膜作為對照，對高壓濕熱改性玉米醇溶蛋白膜的機械特性和抗酶解性進行表征，結果如表4所示。由機械特性結果可知，高壓濕熱改性后玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度有所提高，由未處理14.82±1.57 MPa提高至16.51±2.13 MPa，這表明改性后玉米醇溶蛋白膜的力學強度有所增強。改性后斷裂伸長率值由3.61%±0.46%降低至3.20%±0.18%，這可能是由于高壓高溫環(huán)境致使作為增塑劑的甘油部分析出所導致的。

表4 高壓濕熱改性對玉米醇溶蛋白膜機械特性和抗酶解性的影響Table 4 Effect of HPHM modification on mechanical and enzymatic resistant propertiesof zein film

理想的細胞培養(yǎng)基材應具有較高的抗酶解特性以抵抗胰蛋白酶的消化作用[27]。由結果可知，改性前后玉米醇溶蛋白膜的體外酶解率由17.15%±0.27%降低至14.92%±0.58%。這表明高壓濕熱改性可提高玉米醇溶蛋白膜的抗酶解特性。

2.4 FT-IR光譜

通過FT-IR光譜分析高壓濕熱改性前后玉米醇溶蛋白膜的特征峰和二級結構的變化，結果如圖5所示。由圖5（a）可知，未處理的玉米醇溶蛋白膜與最佳改性條件下的膜樣品FT-IR譜圖整體上無較大差異。由局部放大圖5（b）可知，玉米醇溶蛋白膜經過高壓濕熱改性后在3300 cm?1處的吸收峰有明顯增強，該處對應著O-H的伸縮振動結構，這是由于高壓濕熱處理中的樣品處于高濕度環(huán)境，膜樣品自身極性增強所導致的。圖5（c）中1480～1200 cm?1區(qū)間對應C-H及N-H振動以及酰胺結構的異構體，是蛋白質的指紋區(qū)[28]，由結果可以看出，改性后的圖譜在1437 cm?1和1238 cm?1處的峰值強度都略高于未處理。這說明高壓濕熱能誘導玉米醇溶蛋白氫鍵作用增強，部分分子發(fā)生重排，蛋白質多肽鏈進一步折疊和卷曲，形成更緊密的空間結構。酰胺I區(qū)（1700～1660 cm?1）主要是由于C=O伸縮振動產生，歸屬于N-H彎曲和C-H伸縮振動。圖5（d）中改性后的玉米醇溶蛋白峰位和峰高均無明顯差異，僅峰面積略有增加。這表明高壓濕熱改性處理對玉米醇溶蛋白的主體結構沒有顯著影響。

圖5 玉米醇溶蛋白膜紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrogram of zein film

根據譜峰歸屬[29]將酰胺I區(qū)中復雜的重疊譜帶區(qū)分為四種二級結構單元：β-折疊1640～1610 cm?1、無規(guī)卷曲1638～1640 cm?1、α-螺旋1648～1659 cm?1、β-轉角1660～1697 cm?1，對峰面積進行Gaussian-Lorentzian函數擬合，并計算出各二級結構單元的相對百分含量[30]，結果如表5所示。與未處理相比，改性后玉米醇溶蛋白中的β-轉角的相對含量由47.45%下降至45.64%。無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋相對含量略有增加。這表明高壓濕熱改性導致玉米醇溶蛋白中β-轉角結構向無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋結構轉變。蛋白膜結構中β-折疊和α-螺旋含量的增加反映了膜有序結構的增強，這與吸水率和抗拉強度的結果一致，進一步證明高壓濕熱改性能夠促使玉米醇溶蛋白網絡結構更為緊密，膜結構強度也會有所增加。此外，緊密的蛋白質網絡結構使酶的作用位點內嵌，提高了玉米醇溶蛋白的抗酶解性，與2.3結果一致。

表5 高壓濕熱改性對玉米醇溶蛋白膜二級結構相對百分含量的影響Table 5 Effect of HPHM modification on relative percentage of secondary structure of zein film

3 結論

通過單因素和正交試驗確定了最佳高壓濕熱處理條件為：玉米醇溶蛋白成膜液體積9 mL，處理溫度121℃，處理時間40 min。在此條件下玉米醇溶蛋白膜吸水率低至11.35%±0.74%，浸水后透明度為181.30±3.29，高壓濕熱改性處理能有效改善玉米醇溶蛋白膜的耐水性。各因素影響的顯著程度從大到小依次為成膜液體積、處理溫度、處理時間。

高壓濕熱改性后玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度和抗酶解性均有提高。紅外分析表明，高壓濕熱改性導致玉米醇溶蛋白中β-轉角結構向無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋結構轉變。經過高壓濕熱改性后的玉米醇溶蛋白膜網絡結構更緊密，耐水性有顯著改善，有利于提高其在食品包裝材料等領域的應用價值。