響應(yīng)面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖純化工藝

張小輝，衛(wèi)夢堯，楊永志，黃耀豪，蘇官杰，劉冠希，李 飛，吳子峰，丁金龍

（廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）作為一種傳統(tǒng)名貴的中藥材，是一種具有高藥用價值的食用植物，其主要活性成分有多糖[1?3]、生物堿[4]、類黃酮[5]、多酚[6]、微量元素[7]和氨基酸等[8]，其中多糖含量最高，2020版《中國藥典》記載鐵皮石斛中多糖含量不低于25%[9]。鐵皮石斛多糖具有降血糖、護(hù)肝、抑菌[10?11]、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、保護(hù)腸胃、抗氧化[12?14]和增強(qiáng)免疫力等功效。

目前鐵皮石斛粗多糖主要以水提法提取，一般會含有蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)。目前關(guān)于石斛多糖脫蛋白的方法較多是蛋白質(zhì)變性法[15?16]與酶解法，但這些方法存在操作復(fù)雜、重復(fù)次數(shù)多、脫蛋白率不高[17?18]、多糖損失率大[19?21]等缺點(diǎn)。雙水相萃取相對于傳統(tǒng)的有機(jī)-無機(jī)溶劑萃取是一種新的萃取方法，迄今為止，已用于多種材料的提取和純化，包括多糖[22?25]、蛋白質(zhì)[26]、酶[27]、多肽[28]、氨基酸[29]等。其具有分相時間短、條件溫和、選擇性強(qiáng)、易放大、處理簡單、不易影響萃取物的生物活性[30?32]等優(yōu)點(diǎn)。

目前關(guān)于石斛多糖的雙水相萃取純化研究尚未見報道。本文擬采用乙醇-硫酸銨雙水相體系純化鐵皮石斛粗多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件，以期為鐵皮石斛多糖的純化及其實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥鐵皮石斛莖 購于京東店鋪敏昂養(yǎng)養(yǎng)健康專營店；硫酸銨、無水葡萄糖 分析純，天津致遠(yuǎn)試劑廠；無水乙醇、苯酚、硫酸 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G250國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸 分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠。

SIL102數(shù)顯恒溫電熱套 日本島津儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本島津儀器有限公司；DGU-20A高速臺式離心機(jī) 日本島津儀器有限公司；L6S型紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；XH-C旋渦混勻器 常州越新儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙水相相圖的繪制 稱取20 g硫酸銨固體于錐形瓶中，加入30 g蒸餾水得到澄清溶液，不斷攪拌并滴入無水乙醇至溶液渾濁，記錄加入的乙醇質(zhì)量mi，此時液體總質(zhì)量為Mi，之后再加入一定量的蒸餾水至澄清，記錄加入水的質(zhì)量mj，體系總質(zhì)量為Mj。繼續(xù)滴入無水乙醇至溶液渾濁，之后加入水至溶液澄清，重復(fù)操作，計算每個濁點(diǎn)的乙醇濃度與硫酸銨濃度，繪制乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖。

1.2.2 鐵皮石斛粗多糖的制備 粗多糖的制備方法根據(jù)羅秋蓮[16]的方法進(jìn)行改進(jìn)：取干燥鐵皮石斛莖進(jìn)行打粉，過100目篩，以1:25（g/mL）料液比加入去離子水，90℃浸提2次后過濾，8000 r/min離心10 min，取上清液，減壓濃縮，加入濃縮液4倍體積的95%乙醇，4℃冰箱保存過夜后8000 r/min離心10 min，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得到粗多糖。

1.2.3 構(gòu)建雙水相體系 固定體系質(zhì)量為30.0 g。在50 mL離心管中分別加入一定質(zhì)量的硫酸銨和乙醇溶液，根據(jù)乙醇與硫酸銨加入的質(zhì)量百分比，加入一定量0.5 mg/mL的鐵皮石斛粗多糖提取液（三個組成質(zhì)量百分比之和為100%），置于漩渦混合器上于室溫下混合，靜置至上下相體積不再發(fā)生變化,將雙水相體系兩相分離并進(jìn)行透析（1000 Da）48 h。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以（NH4）2SO4濃度、C2H5OH濃度和萃取溫度為因素，多糖萃取率、除蛋白率為考察指標(biāo)，考察3個因素對多糖萃取率與除蛋白率的影響。

1.2.4.1 （NH4）2SO4濃度對多糖萃取率與除蛋白率的影響 固定雙水相體系30.0 g，在濃度25%（w/w）C2H5OH、萃取溫度25℃的條件下，考察（NH4）2SO4在17%、18%、19%、20%、21%（w/w）下對多糖萃取率和除蛋白率的影響。

1.2.4.2 C2H5OH濃度對多糖萃取率與除蛋白率的影響 固定雙水相體系30.0 g，（NH4）2SO4為19%（w/w），萃取溫度25℃，考察C2H5OH為21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%（w/w）對多糖萃取率和除蛋白率的影響。

1.2.4.3 萃取溫度對多糖萃取率與除蛋白率的影響

固定雙水相體系30.0 g，（NH4）2SO4為19%（w/w），C2H5OH為25%（w/w），考察萃取溫度15、25、35、45、55℃對多糖萃取率和除蛋白率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取（NH4）2SO4濃度、C2H5OH濃度和萃取溫度作為考察因素，以多糖萃取率與除蛋白率為響應(yīng)值，采用三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化，具體見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計Table1 Box-Behnken experimental for factor and level

1.2.6 多糖萃取率的計算

1.2.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法根據(jù)王琳煒等[15]的方法進(jìn)行改進(jìn)：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品放置于65℃干燥箱中烘干至恒重，精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制成每1 mL含90μL的溶液的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用去離子水補(bǔ)齊至1.0 mL。向各試管中加入1.0 mL 5%苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），搖勻后加入5.0 mL濃硫酸，置旋渦振蕩器搖勻，90℃水浴25 min，水浴后流水冷卻3 min，在波長490 nm處測定吸光度值[16]。以吸光值（y）對應(yīng)葡萄糖含量（x）獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=66.356x+0.0021（R2=0.9995）。

1.2.6.2 多糖含量測定 精確取樣品1.0 mL，下相稀釋10倍，上相無須稀釋，精密加1.0 mL 5%苯酚溶液，后加入5.0 mL濃硫酸，置旋渦振蕩器搖勻，90℃水浴25 min，在波長490 nm處測定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖濃度得到多糖萃取率。

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出雙水相體系中上下相的多糖含量，計算出雙水相體系的多糖萃取率。

式中：Y1為多糖在下相中的萃取率；ct1為上相多糖濃度，mg/mL；cb1為下相多糖濃度，mg/mL；Vt為上相體積，mL；Vb為下相體積，mL。

1.2.7 除蛋白率的計算

1.2.7.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法根據(jù)王琳煒等[15]的方法進(jìn)行改進(jìn)：精確稱取牛血清白蛋白10 mg，制成0.1 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250粉末100 mg，用95%乙醇50 mL溶解，加入100 mL 85%的磷酸溶液，再轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中用水定容，制成考馬斯亮藍(lán)試劑。分別吸入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用去離子水補(bǔ)齊至1.0 mL。加考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.0 mL搖勻，放置5 min后，在波長595 nm處測定吸光度值[29]。以橫坐標(biāo)為蛋白含量，縱坐標(biāo)為吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值（y）對應(yīng)蛋白質(zhì)含量（x）獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=20.743x+0.0025（R2=0.9987）。

1.2.7.2 蛋白質(zhì)含量測定 精密取樣品1.0 mL，精密加考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.0 mL，搖勻，放置5 min，在波長595 nm處測定吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)濃度得到除蛋白率。

根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出雙水相體系中上下相的蛋白質(zhì)含量，計算出雙水相體系的除蛋白率。

式中：Y2為除蛋白率（即蛋白質(zhì)在上相的萃取率）；ct2為上相蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；cb2為下相蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；Vt為上相體積，mL；Vb為下相體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面模型的回歸方程與顯著性統(tǒng)計均通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3組進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖的確定

在25℃時，使用濁點(diǎn)法得到乙醇-硫酸銨雙水相體系的相圖如圖1所示。相圖中曲線上方為雙水相區(qū)域，能形成雙水相體系，下方為均相區(qū)，不會分層。因?yàn)榱蛩徜@在有一定濃度的乙醇水溶液中容易析出，因此硫酸銨濃度不宜選擇過高[33]。此相圖為乙醇-硫酸銨雙水相體系分離純化鐵皮石斛多糖提供了理論依據(jù)。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖Fig.1 Phasediagram of ethanol-ammonium sulphate

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 （NH4）2SO4濃度對多糖萃取率和除蛋白率的影響 由圖2可知，隨著硫酸銨濃度增大，多糖萃取率先增加后減少，這可能是隨著硫酸銨濃度增加，體系下相體積增加，利于多糖在下相的富集，而除蛋白率變化幅度較小，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，雙水相體系下相的鹽析作用增強(qiáng)，導(dǎo)致多糖在下相的溶解度降低，從而抑制了多糖在下相的溶解[22,34?35]。（NH4）2SO4濃度為18%時多糖萃取率達(dá)到最大值，與19%時相差不大；但硫酸銨濃度為19%時，除蛋白率達(dá)到最大值，除蛋白率接近90%。綜合考慮下，選取19%濃度的（NH4）2SO4為宜。

圖2 （NH4）2SO4濃度對多糖萃取率與除蛋白率的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentration on the extraction rate of polysaccharides and protein removal rate

2.2.2 C2H5OH濃度對多糖萃取率和除蛋白率的影響 由圖3可知，隨著乙醇濃度增大，多糖萃取率與除蛋白率先增加后減少，乙醇濃度過高時，可能導(dǎo)致得體系中水分子往上相富集，下相體積減小，相比增大，而多糖主要分布于下相，隨著水在下相含量降低，多糖在下相的含量降低[35?36]，乙醇濃度越高多糖萃取率降低幅度變大，不利于多糖與蛋白質(zhì)的分離。在25%濃度時多糖萃取率和除蛋白率最高，故選取25%濃度的C2H5OH為宜。

圖3 C2H5OH濃度對多糖萃取率與除蛋白率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of polysaccharidesand protein removal rate

2.2.3 萃取溫度對多糖萃取率和除蛋白率的影響由圖4可知，隨著萃取溫度升高，多糖萃取率與除蛋白率先增加后減少，這可能是隨著溫度增加，多糖在下相的溶解度增加，有利于多糖溶解在下相，溫度進(jìn)一步升高時，進(jìn)而影響雙水相體系的分配系數(shù)與體系壓力等，使得多糖萃取率與除蛋白率降低[33]。在25℃時多糖萃取率與除蛋白率最高，故萃取溫度選取25℃為宜。

圖4 萃取溫度對多糖萃取率與除蛋白率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides and protein removal rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用軟件Design-Expert8.0.6進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，以（NH4）2SO4濃度、C2H5OH濃度和萃取溫度作為自變量，多糖萃取率與除蛋白率作為響應(yīng)值，共設(shè)計17組試驗(yàn)，如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到二次多元回歸模型為：

多糖萃取率（%）：Y=94.75?1.91A+1.07B+2.34C+0.16AB?2.21AC?2.26BC?5.05A2?5.94B2?3.68C2

除蛋白率（%）：Y=91.76?5.16A?1.90B?4.51C+3.67AB+4.95AC+0.79BC?9.19A2?9.35B2?12.02C2

得到多糖萃取率和除蛋白率的方差分析結(jié)果見表3和表4。

表4 除蛋白率方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of protein removal rate

從表3可以看出，回歸模型的P-Value<0.0001，表明該模型極顯著。模型失擬項(xiàng)的P-Prob=0.1407>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明殘差都是由隨機(jī)誤差引起的。模型確定系數(shù)R2=0.9895，RAdj2=0.9761，說明該模型可以解釋97.61%響應(yīng)值的變化，模型與試驗(yàn)的擬合程度較好。由方差分析表可以看出，硫酸銨濃度（A）、乙醇濃度（B）及萃取溫度（C）對多糖萃取率都有極顯著性影響。根據(jù)F值可知，影響多糖萃取率的三個因素大小順序?yàn)镃>A>B，即萃取溫度>硫酸銨濃度>乙醇濃度。交互項(xiàng)AB不顯著，AC、BC交互作用極顯著。

表3 多糖萃取率方差分析結(jié)果Table 3 Polysaccharideextraction rate analysis of variance results

從表4可以看出，回歸模型的P-Value<0.0001，表明該模型極顯著。模型失擬項(xiàng)的P-Prob=0.0516>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明殘差都是由隨機(jī)誤差引起的。模型決定系數(shù)R2=0.9894，RAdj2=0.9759，說明該模型可以解釋97.59%響應(yīng)值的變化，模型與試驗(yàn)的擬合程度較好。由方差分析表可以看出，硫酸銨濃度（A）、乙醇濃度（B）及萃取溫度（C）對除蛋白率都有極顯著性影響。根據(jù)F值可知，影響除蛋白率的三個因素大小順序?yàn)镃>A>B，即萃取溫度>硫酸銨濃度>乙醇濃度。交互項(xiàng)BC不顯著，AB、AC交互作用極顯著。

2.3.2 各因素相互作用對多糖萃取率和除蛋白率的影響 各個因素之間相互作用如下。根據(jù)試驗(yàn)擬合得到的回歸方程，得出響應(yīng)面圖，圖的等高線和三維圖的陡峭度反映出每個因素的相互聯(lián)系。若等高線圖中心是圓形就表明影響多糖萃取率的兩個因素之間交互作用是不顯著的，橢圓形則表明是顯著的；三維立體圖的曲面越陡，就說明兩因素之間交互作用為顯著。

由圖5、圖6、圖7的響應(yīng)面圖可知，隨著各個因素的增大，多糖萃取率逐漸增大，增加至一定程度時，多糖萃取率達(dá)到最大值，但隨著各個因素繼續(xù)增加，多糖萃取率逐漸降低。等高線圖可看出乙醇濃度（B）與萃取溫度（C）的響應(yīng)曲面走勢最陡峭，其等高線中心呈橢圓形，BC項(xiàng)（P=0.0010）對多糖萃取率有極其顯著影響。硫酸銨濃度（A）與萃取溫度（C）的響應(yīng)曲面走勢陡峭，AC項(xiàng)（P=0.0012）對多糖萃取率也有極其顯著影響。硫酸銨濃度（A）與乙醇濃度（B）的等高線中心趨近于圓形，AB項(xiàng)（P=0.7154）交互作用不顯著。

圖5 硫酸銨濃度、乙醇濃度交互作用對多糖萃取率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.5 Response surface and contour plot of interaction of ammonium sulfate concentration and ethanol concentration on the extraction rate of polysaccharides

圖6 硫酸銨濃度、萃取溫度交互作用對多糖萃取率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.6 Response surface and contour plots of interaction of ammonium sulfate concentration and extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

圖7 乙醇濃度、萃取溫度交互作用對多糖萃取率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.7 Response surface and contour plots of interaction of ethanol concentration and extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

由圖8、圖9、圖10的響應(yīng)面圖可知，隨著各個因素的增大，除蛋白率逐漸增大，增加至一定程度時，除蛋白率達(dá)到最大值，但隨著各個因素繼續(xù)增加，除蛋白率逐漸降低。等高線圖可看出硫酸銨濃度（A）與萃取溫度（C）的響應(yīng)曲面走勢最陡峭，AC項(xiàng)（P=0.0008）對除蛋白率有極顯著影響。硫酸銨濃度（A）與乙醇濃度（B）的響應(yīng)曲面走勢陡峭，AB項(xiàng)（P=0.0043）對除蛋白率也有極顯著影響。乙醇濃度（B）與萃取溫度（C）的等高線中心趨近于圓形，BC項(xiàng)（P=0.4019）交互作用不顯著。

圖8 硫酸銨濃度、乙醇濃度交互作用對除蛋白率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.8 Responsesurface and contour plotsof interaction of ammonium sulfateconcentration and ethanol concentration interaction on protein removal rate

圖9 硫酸銨濃度、萃取溫度交互作用對除蛋白率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.9 Response surface and contour plots of interaction of ammonium sulfate concentration and extraction temperature on protein removal rate

圖10 乙醇濃度、萃取溫度交互作用對除蛋白率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.10 Response surface and contour plots of interaction of ethanol concentration and extraction temperature on protein removal rate

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)選條件驗(yàn)證 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得知，乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取純化鐵皮石斛多糖的最佳工藝條件為：硫酸銨濃度為18.76%，乙醇濃度為24.95%，溫度為24.92℃，在此條件下鐵皮石斛多糖萃取率與除蛋白率分別為94.85%和92.62%。根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，雙水相體系在30.0 g情況下，硫酸銨濃度為18.80%，乙醇濃度為25.00%，萃取溫度為25℃，在該條件下得到的多糖萃取率與除蛋白率94.39%±0.58%和91.36%±0.70%，與模型預(yù)測值基本符合，表明所選模型合理，能夠模擬和預(yù)測該雙水相體系對鐵皮石斛多糖萃取率與除蛋白率的影響。實(shí)驗(yàn)中粗多糖純度為85.20%±0.74%，雙水相純化后多糖的純度為95.96%±0.61%，多糖純度明顯提高。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對鐵皮石斛多糖的乙醇-硫酸銨雙水相萃取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳工藝條件如下:硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.80%，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.00%，萃取溫度為25℃，在該條件下得到的多糖萃取率與除蛋白率分別為94.39%和91.36%，多糖純度由85.20%提高到95.96%。論文研究結(jié)果可為鐵皮石斛多糖的工業(yè)化純化及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)方法與理論依據(jù)，同時也表明雙水相萃取技術(shù)在天然藥物活性成分的純化分離中有著良好的應(yīng)用前景。