基于分子對(duì)接虛擬篩選含酪氨酸殘基的ACE抑制三肽

孫晨松，陳雯祺，陳盈盈，王 碩，游清徽

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-?converting enzyme，ACE）是一種金屬肽酶，具有調(diào)控人體血壓的特殊作用，在哺乳動(dòng)物各類組織和血漿中大量存在，尤其廣泛分布于肺，腦，腎及雄性動(dòng)物的性器官中[1]。因其在調(diào)節(jié)血壓中具有重要作用，近年來深受研究人員的青睞。ACE抑制劑被報(bào)道能有效控制高血壓，并應(yīng)用于藥物研發(fā)。但目前市面上已被注冊(cè)的ACE抑制劑藥物大多為化工合成，如賴諾普利、卡托普利、貝那普利等，這些藥物成本高、對(duì)環(huán)境不友好，并且效能有限，臨床上經(jīng)常引起味覺障礙、皮疹、腎功能異常等不良反應(yīng)[2]。因此，鑒于對(duì)環(huán)境友好和人體安全考慮，尋找更具優(yōu)勢(shì)的ACE抑制劑刻不容緩。

目前關(guān)于ACE抑制劑研究的焦點(diǎn)是食源性多肽，食源性多肽因強(qiáng)大的生物活性及較低的毒副作用等性質(zhì)而被大量應(yīng)用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，但由于機(jī)體的酶解消化作用使多肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變影響了多肽的穩(wěn)定性，導(dǎo)致食源性多肽的體內(nèi)ACE抑制活性不顯著[3]。腸腔內(nèi)的代謝活性是限制肽類藥物吸收的主要障礙；同時(shí)，機(jī)體的自我更新、調(diào)節(jié)和穩(wěn)定限制了多肽類生物大分子的進(jìn)入，相比之下亞單位足夠小的短肽（二肽、三肽）更容易被機(jī)體吸收[4]更利于機(jī)體各類組織器官的利用。ACE具有同源性高度相似的兩個(gè)活性結(jié)構(gòu)域：C-結(jié)構(gòu)域和N-結(jié)構(gòu)域，且兩者生物活性有所不同[5?6]，C-結(jié)構(gòu)域具有更好的血壓調(diào)節(jié)作用[7]。已有研究表明ACE抑制劑的活性效果與C-結(jié)構(gòu)域前四個(gè)氨基酸序列有重要關(guān)聯(lián)，且C端為Tyr或Cys為最優(yōu)結(jié)構(gòu)[8]，近期已有文獻(xiàn)對(duì)二肽的含酪氨酸殘基ACE抑制劑進(jìn)行虛擬篩選[9]，但其種類相對(duì)較少，參考范圍有限。因此本文為了獲取更廣泛的數(shù)據(jù)支撐，在張欽[9]的研究基礎(chǔ)上，借助NovoPro工具，模擬人體內(nèi)環(huán)境，篩選出C-結(jié)構(gòu)域特異性抑制且含酪氨酸殘基的三肽，對(duì)其體外活性進(jìn)行評(píng)估，并運(yùn)用分子對(duì)接找到其結(jié)合靶點(diǎn)，闡明作用機(jī)制。為ACE抑制劑的研發(fā)提供更全面的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE） 美國Sigma-Aldrich公司；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（FAPGG）、活性肽（純度80%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 上海阿達(dá)瑪斯公司。

SpectraMAX M 2多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；SPX-60BSH生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；XW-80A旋渦混合器 海門市其林貝爾制造有限公司；LeDock分子對(duì)接軟件南京大學(xué)；電子天平AUW120D日本島津公司；紫外檢測(cè)專用酶標(biāo)板 德國Greiner公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C端含酪氨酸的三肽配體庫的建立 在Novopro數(shù)據(jù)庫（https://www.novoprolabs.com/tools/convert-peptide-to-smiles-string）[10]中得到所有末端為酪氨酸的三肽結(jié)構(gòu)SMILES序列，MOE軟件[11]采用Amber10:EHT力場(chǎng)進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化和能量優(yōu)化并得到mol2格式文件，共400種。

1.2.2 分子對(duì)接 通過PBD數(shù)據(jù)庫[12]獲取人ACE-賴洛普利復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（PBD ID:1O86）。首先去除配體結(jié)構(gòu)，水分子和雜原子，再用PDB2PQR軟件[13]和VMD軟件[14]加氫修飾和優(yōu)化，最終根據(jù)默認(rèn)數(shù)值構(gòu)建催化位點(diǎn)的對(duì)接口袋參數(shù)。以C端為酪氨酸的三肽為分子探針，利用LeDock軟件[15]把構(gòu)建的口袋參數(shù)與ACE受體進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)結(jié)合能結(jié)果篩選出ACE抑制的有效肽序列。

1.2.3 生物活性和水溶性預(yù)測(cè) 利用PeptideRanker在線系統(tǒng)[16]預(yù)測(cè)分子對(duì)接篩選評(píng)分高的三肽的潛在生物活性（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php），評(píng)分大于0.5則表示有生物活性，用Innovagen程序（http://www.innovagen.com/proteomics-tools）的“Peptide property calculator”工具預(yù)測(cè)前述有活性三肽的水溶性。

1.2.4 ADMET性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用admetSAR[17?18]預(yù)測(cè)生物活性大于0.5且水溶性好的三肽的ADMET（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/）性質(zhì)，主要包括人體腸道吸收（human intestinalaabsorption，HIA）、血腦屏障穿透（blood-brain barrierpenetration，BBB）和急性口服毒性。將篩選得到具有良好生物活性、水溶性和ADMET性質(zhì)的活性肽與在線數(shù)據(jù)庫BIOPEP-UWM和AHTPDB（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/）中已被收錄的ACE抑制肽進(jìn)行對(duì)比，將未被研究報(bào)道的活性肽進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.5 ACE抑制肽的合成 采用FMOC固相合成[19]法制備肽RWY、FRY、YRY和RFY。所得到的肽純度為80%，均經(jīng)過脫鹽處理。

1.2.6 肽的ACE抑制活性檢測(cè) 利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定ACE抑制活性。以FAPGG作為ACE底物，通過紫外專用酶標(biāo)板在340 nm下測(cè)定吸光值，具體操作方法如駱琳等[20]稍作改進(jìn)，配制緩沖液（80 mmol/L HEPES 300 mmol/L NaCl）并調(diào)節(jié)p H至8.3。配制1mmol/L的FAPGG作為底物，操作步驟如表1。

表1 ACE抑制率的測(cè)定Table 1 Determination of ACE inhibition rate

添加各組組分后立即在340 nm下檢測(cè)第一次吸光值，37℃恒溫培養(yǎng)箱下反應(yīng)30 min后測(cè)第二次吸光值，把對(duì)照組反應(yīng)前后的吸光值差值記為A，抑制組的差值記為B，則肽的ACE抑制率Q（%）=100（A?B）/A×100，測(cè)定不同濃度組分肽的ACE抑制率，每組平行至少做6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)過程，利用Microsoft Excel和Pymol整理數(shù)據(jù)和作圖并用Spss Statistics軟件預(yù)測(cè)三肽IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 C端含酪氨酸三肽對(duì)接結(jié)果及生物活性預(yù)測(cè)

根據(jù)LeDock分子對(duì)接結(jié)合能結(jié)果，選取分值大于?9.5的三肽，在此基礎(chǔ)上根據(jù)ACE-賴洛普利復(fù)合物配體結(jié)合效率淘汰掉打分小于?0.294的三肽，最終得到了77個(gè)與ACE靶點(diǎn)結(jié)合較好的三肽。

PeptideRanker服務(wù)器可預(yù)測(cè)肽是否有生物活性，其評(píng)定結(jié)果越接近1則說明可能擁有用的生物活性越強(qiáng)，其評(píng)定活性的最低標(biāo)準(zhǔn)為0.5。因此，從前述步驟篩選出的77個(gè)三肽中進(jìn)一步淘汰28個(gè)，余下49個(gè)具備生物活性潛能的三肽。利用Innovagen進(jìn)行水溶性的篩選，最終得到12個(gè)水溶性好的三肽結(jié)果見表2。

表2 肽序列打分、配體結(jié)合效率及生物活性評(píng)分Table 2 Peptide sequence score,ligand binding efficiency and biological activity score

2.2 三肽ADMET性質(zhì)預(yù)測(cè)

admetSAR是開源可讀，并且實(shí)時(shí)更新的數(shù)據(jù)庫，它可根據(jù)活性肽的SMILES序列預(yù)測(cè)其吸收、代謝和毒性等與環(huán)境和人類健康相關(guān)的性質(zhì)。預(yù)測(cè)三肽的ADMET特性可作為有效的ACE抑制肽篩選的重要依據(jù)。本次對(duì)三肽的血腦屏障滲透性（BBB）、胃腸吸收性（HIA）、Caco-2通透性、藥物毒性、艾姆斯毒性和致癌物進(jìn)行了預(yù)測(cè)。三肽的ADMET特性的預(yù)測(cè)結(jié)果如表3。

表3 肽序列ADMET性質(zhì)預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of the properties of peptide sequence ADMET

吸收和代謝是影響口服利用度的最重要因素，更好的治療藥物，不僅要有BBB、HIA和Caco-2通透性的正參數(shù)，而且需要5種CYP450的代謝抑制參數(shù)[21]。BBB是保障中樞神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，其對(duì)進(jìn)入腦組織的大部分物質(zhì)具有選擇和限制性，因此所篩選的三肽必須具備良好的血腦屏障滲透性才能有效的發(fā)揮抑制作用[22]。HIA標(biāo)志著三肽在體內(nèi)的吸收利用程度。結(jié)果表明，其中三肽RWY、FRY、YRY、RFY、PRY被標(biāo)記為BBB+，HIA+，表明五種三肽血腦屏障滲透率高且胃腸吸收好。作為腸上皮細(xì)胞系中的重要細(xì)胞，Caco-2細(xì)胞的研究與藥物在機(jī)體內(nèi)的代謝和吸收關(guān)系重大，其滲透性越好，越容易被機(jī)體利用[23]。CYP450是藥物代謝中占據(jù)主導(dǎo)作用的酶，若其被抑制，則藥物代謝減弱甚至對(duì)人體造成不良影響[24]。上述五種三肽的Caco-2滲透性良好，并且根據(jù)CYP450的預(yù)算值推測(cè)其均無毒，此外也未檢測(cè)出艾姆斯毒性和致癌物。最后將五種三肽與數(shù)據(jù)庫BIOPEP（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/）所發(fā)現(xiàn)的活性序列進(jìn)行對(duì)比，只有肽PRY被報(bào)道過是ACE抑制劑IC50值為2.5 μmol/L，其余四種三肽均為首次發(fā)現(xiàn)的ACE抑制肽。經(jīng)FMOC固相合成的肽RWY、FRY、YRY、RFY利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)ACE抑制率，F(xiàn)RY、RWY 、RFY、YRY 的IC50值分別為113.10、228.67、101.00和272.61μmol/L。

2.3 分子對(duì)接機(jī)制

一般而言，根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)和分值評(píng)定的高低不足以作為抑制活性唯一的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)[25]，為進(jìn)一步闡明分子間的相互作用機(jī)制，本文利用Pymol軟件對(duì)篩選出的四個(gè)三肽與ACE之間的相互作用結(jié)果進(jìn)行了分析。

如圖1a結(jié)果所示，三肽RWY分別與Glu162（2.84?/2.91?）、CYX352（2.61?）、CYX370（2.90?）、Asp377（3.58?）、HSD353（3.28?）、Glu384（2.59?）這一系列ACE的氨基酸殘基之間形成了7個(gè)距離不同的氫鍵，其中與Glu162形成了2條重疊的氫鍵，因此未在平面圖顯示完全，CYX為二硫鍵參與的Cys，HSD為His的一種形態(tài)。RWY與Glu384結(jié)合的鍵長最短，鍵能最大，結(jié)合最牢固。

圖1 ACE與RWY分子對(duì)接作用圖Fig.1 Diagram of molecular docking between ACE and RWY

如圖2a所示，三肽FRY與HSD353（2.82?）、Glu384（3.51?/3.02?/3.29?）、HSD387（2.66?）、Glu 411（3.74?/3.12?）、Glu162（3.12?）、Glu376（2.60?）、Asp415（3.22?/2.81?）等這些氨基酸殘基之間形成距離不同的11個(gè)氫鍵，其中Glu384和Asp415殘基分別都有兩條氫鍵重疊。

圖2 ACE與FRY分子對(duì)接作用圖Fig.2 Diagram of molecular docking between ACE and FRY

如圖3a結(jié)果所示，三肽YRY與HSD353（2.63?/2.93?）、Asp377（2.95?）、Glu162（2.95?）、Glu384（3.45?）、Asp453（2.97?）、HSD513（2.94?）等這些氨基酸殘基之間形成7條氫鍵。

圖3 ACE與YRY分子對(duì)接作用圖Fig.3 Diagram of molecular docking between ACE and YRY

如圖4a結(jié)果所示，三肽RFY與氨基酸殘基Glu162（2.64?/3.13?）、Cys370（2.62?/2.89?）、Asp377（3.10?）、Ala356（2.69?）之間形成6條氫鍵，并與His387（3.79?）形成pi-pi共軛鍵。

圖4 ACE與RFY分子對(duì)接作用圖Fig.4 Diagram of molecular docking between ACE and RFY

已有大量研究表明，ACE存在三個(gè)活性口袋，即S1、S2和S1′，氨基酸殘基Ala354、Glu384和Tyr523存在于S1口袋，Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520存在于S2口袋，Glu162存在于S1′口袋[26?28]；此外ACE的活性位點(diǎn)Zn（II）在影響ACE的活性中也起到重要作用，活性中心Zn（II）與His383、His387和Glu411相互協(xié)調(diào)。肽和ACE殘基通過主要的相互作用力（如范德華力）和某些次要的相互作用力（如氫鍵、疏水作用力和靜電作用力）連接在一起，氫鍵是形成穩(wěn)定肽ACE復(fù)合物的主要作用力[29]。RWY和ACE的氨基酸殘基Glu162、HSD353、Glu384之間形成4條氫鍵，說明RWY與S1′口袋、S2口袋和S1口袋均有相互作用，F(xiàn)RY與氨基酸殘基HSD383、HSD387、Glu411、Glu384和Glu162之間形成8條氫鍵，由此可知FRY通過Zn（II）中心、S1和S1′口袋抑制ACE活性，YRY則與殘基HSD353、HSD513、Glu162和Glu384間構(gòu)建5條氫鍵，與S2、S1′和S1口袋存在相互作用，RFY與殘基Glu162形成2條氫鍵，與His387形成pi-pi共軛鍵，則說明RFY和S1′和S1口袋存在相互作用。表4中列出了抑制肽，藥物賴諾普利與口袋中氨基酸殘基之間的相互作用，篩選出的四種抑制肽都與S1′口袋相互作用，且唯一與S1′口袋形成2條氫鍵的RFY表現(xiàn)出最優(yōu)體外ACE抑制活性，說明S1′口袋可能在ACE抑制活性中發(fā)揮重要作用，這與于志鵬等[30]研究結(jié)果相似。雖然這些抑制肽的ACE抑制活性不及陽性藥物賴諾普利（IC50=1.2μmol/L）[31]，但相比于許多已發(fā)現(xiàn)的ACE活性短肽，如IVF（IC50=3390μmol/L）[32]，VKK（IC50=1045μmol/L）[33]篩選出的抑制肽仍具備很大優(yōu)勢(shì)。

表4 賴諾普利、抑制肽與ACE口袋中氨基酸殘基相互作用Table 4 Lisinopril,inhibitory peptidesinteract with amino acid residuesin the ACE pocket

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)手段，以C端為酪氨酸殘基的ACE抑制三肽為研究對(duì)象，進(jìn)行高通量篩選，并對(duì)篩選結(jié)果的生物活性、水溶性和生物毒性進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化得到存在ACE抑制可能性的肽RWY、FRY、YRY、RFY。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證四者都具備良好的ACE抑制活性，IC50值分別為228.67、113.10、272.61、101.00μmol/L，分子對(duì)接結(jié)果顯示ACE活性口袋S1′中的氨基酸殘基Glu162與RWY、FRY、YRY及RFY都存在氫鍵作用力，RFY與Glu162存在2條氫鍵作用力，這可能是RFY表現(xiàn)出相對(duì)較高的抑制活性的原因。雖然與臨床藥物賴諾普利相比這些三肽表現(xiàn)出相對(duì)較低的ACE抑制活性，然而有研究指出食源性ACE抑制肽類相比之下由于較低的副作用而更安全[34]因此應(yīng)用前景極大。本文的篩選方法避免了傳統(tǒng)方法耗時(shí)、低效、盲目等缺點(diǎn)，其有效性也得到了證實(shí)，大大減少了實(shí)驗(yàn)工作量，而實(shí)現(xiàn)抑制肽的高產(chǎn)量制備則是接下來的重點(diǎn)研究方向。