菊花不同提取物代謝組學分析及其抗氧化活性功效物質成分篩選

嚴 淘，楊敏敏 ，施 琳,3,4, ，高若曦，劉天啟，張 妍，衛(wèi)鈺成，張華峰,3

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安 710119；2.陜西師范大學，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西西安 710119；3.陜西師范大學，中俄食品與健康科學國際聯(lián)合研究中心，陜西西安 710119；4.陜西師范大學，西安市特色水果貯藏與保鮮重點實驗室，陜西西安 710119）

菊花（Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvelev）為菊屬（Dendranthema （DC.）Des Moul.）的干燥花，在我國被廣泛種植，是藥食兼優(yōu)食品的典型代表。杭白菊（Chrysanthemum morifoliumcv.Hangju）被譽為八大名菊之一，作為中藥被收錄于《中國藥典》（2010年版），也在2002年被衛(wèi)生部收錄進第一批藥食同源食品名錄。杭白菊中主要含有酚類、黃酮類、萜類、有機酸類等多種成分，具有抗氧化、抗衰老、增加機體免疫力等生理活性作用[1]?，F(xiàn)有研究表明，菊花中所含的多酚、黃酮類化合物是它發(fā)揮抗氧化功效的重要物質。雷康藤等[2]發(fā)現(xiàn)6種不同產地菊花均具有一定的抗氧化活性，且它們的黃酮化合物種類及含量存在一定差異；楊璐齊等[3]測定了6種不同種類菊花的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其中黃金菊的抗氧化活性最強，總酚含量也最高。然而，目前對不同方法提取的菊花抗氧化活性研究報道較少，且現(xiàn)有研究大都認為菊花的抗氧化活性主要歸功于其總酚和黃酮類化合物，忽略了菊花本身是一種富含多種活性物質、多種成分共存互作的復雜體系，以偏概全地將一種或數(shù)種成分來代表、預測包含成百上千種化學成分的復雜系統(tǒng)，研究缺乏整體性。

高通量代謝組學以組群指標分析為基礎，以高靈敏度檢測和高維數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標，從宏觀角度研究機體變化，可實現(xiàn)對植物化學物質監(jiān)控或者評價[4]，具有評價菊花等藥食同源植物的營養(yǎng)價值和個性化用藥的潛力[5]。代謝組學研究技術主要包括核磁共振（NMR）、液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）等[6?8]。其中LC-MS以其靈敏、快速、高效、檢測范圍廣泛等特點，在植物源活性成分的分析檢測、植物品種和產地區(qū)分、不同產地藥材的品質差異分析等方面得到廣泛應用[4,9?11]。多元統(tǒng)計分析是一種綜合分析方法，它能夠在多個對象和多個指標互相關聯(lián)的情況下分析它們的統(tǒng)計規(guī)律，是進行復雜體系中的成分分析和差異代謝物篩選等研究的主要手段[12?14]。Zou等[15]通過代謝組學技術分析了不同顏色藥用菊花代謝水平的差異，發(fā)現(xiàn)代謝通量的改變導致黃菊總黃酮含量的增加；韓正洲等[16]分析了栽培型與野生型野菊花藥材的主要差異代謝物，篩選出香葉木素-7-O-蕓香苷等區(qū)分栽培型和野生型野菊花的特征性成分。

因此，本研究采用植物非靶向LC-MS代謝組學檢測不同方法提取的富硒杭白菊中多元、多維化學物質成分，首次運用基于雙重復交叉驗證的無偏遞歸式的變量選擇統(tǒng)計方法（偏最小二乘和隨機森林模型）探索菊花抗氧化功效物質組分，評價菊花中營養(yǎng)物質的提取工藝，打破傳統(tǒng)以偏概全地用一種或數(shù)種含量最多、最顯著的成分來代表、預測包含成百上千種化學成分的復雜系統(tǒng)營養(yǎng)功效的局限，以期為富硒杭白菊靶向功能性物質提取工藝優(yōu)化提供新的思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒杭白菊 安康聚源實業(yè)有限公司提供，選擇大小均一、無機械損傷的菊花頭狀花序，用去離子水清洗后烘干，研磨后密封保存[17]；沒食子酸 純度≥99%，成都市科龍化工試劑廠；福林酚試劑、ABTS、DPPH分析純，美國Sigma公司；蘆丁純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司；過硫酸鉀 分析純，天津市天利化學試劑有限公司；抗壞血酸（VC） 純度≥99%，天津市天利化學試劑有限公司。

Multiskan Go全波長酶標儀 美國熱電公司；AB Triple TOF 5600/6600質譜儀AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀Agilent公司；低溫高速離心機 Eppendorf5430R公司；色譜柱ACQUITY UPLC BEH Amide（1.7μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm） 美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備 參考文獻[18]中的方法制備菊花不同工藝提取物。

1.2.1.1 水煎提取物Boiling water extract（BWE）的制備 精密稱取菊花樣本50 g，用400 mL超純水浸泡30 min。電爐煎煮，沸騰后保持微沸1 h；放冷后用紗布過濾，濾渣中再加入300 mL水，煎煮30 min，重復此步驟3次；將3次水煎液合并，抽濾，于旋轉蒸發(fā)儀50℃恒溫加熱濃縮，直至稠膏狀。

胖子也出聲安慰：“錯不在你，誰知道隨手開個箱子，世界就亂套了呢。”說完轉頭繼續(xù)看向老道，“這么說，這些法器還挺邪乎啊。”

1.2.1.2 熱回流水提物（Reflux water extract，RWE）的制備 精密稱取菊花樣本25 g，轉移至250 mL圓底燒瓶中，用200 mL超純水浸泡20 min。置于電熱套上65℃加熱回流提取60 min，放冷后過濾，濾渣再加入200 mL水，重復提取3次。將3次提取的濾液合并，抽濾，于旋轉蒸發(fā)儀50℃濃縮至稠膏狀。

1.2.1.3 超聲波輔助水提物（Ultrasonic assisted water extract，UWE）的制備 精密稱取菊花樣本25 g，置于300 mL密封玻璃瓶中，加入200 mL 75%乙醇溶液，搖勻后浸泡20 min。設置超聲波清洗機參數(shù)為40 k Hz，90 W，45℃，提取30 min，重復3次。將3次提取的濾液合并，抽濾，于旋轉蒸發(fā)儀50℃濃縮至稠膏狀。

1.2.1.4 超聲波輔助醇提物（Ultrasonic assisted ethanol extract，UEE）的制備 精密稱取菊花樣本25 g，置于300 mL密封玻璃瓶中，加入200 mL超純水，搖勻后浸泡20 min。設置超聲波清洗機參數(shù)為40 kHz，90 W，45℃，提取30 min，重復3次。將3次提取的濾液合并，抽濾，于旋轉蒸發(fā)儀50℃濃縮至稠膏狀。

1.2.1.5 超聲波輔助醇提取水煎剩余物（Ultrasonic assisted ethanol extract-Waste boiling water extract，UEE-Waste）的制備 收集1.2.1.2水煎法提取后的濾渣（Waste-BWE），曬干后置于烘箱60℃烘干15 h。精密稱取濾渣25 g，置于300 mL密封玻璃瓶中，加入200 mL無水乙醇溶液，搖勻后浸泡20 min。設置超聲波清洗機參數(shù)為40 kHz，90 W，45℃，提取30 min，重復3次。將3次提取的濾液合并，抽濾，于旋轉蒸發(fā)儀50℃濃縮至稠膏狀。

1.2.2 代謝組學實驗方法 本研究采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOFMS）技術，結合數(shù)據(jù)依賴采集方式對樣本進行分析，獲得一級質譜和二級質譜數(shù)據(jù)，采用XCMS[19]對數(shù)據(jù)進行峰提取和代謝物鑒定。

1.2.2.1 樣本預處理 水提浸膏組樣本（BWE、RWE、UWE、UEE、UEE-Waste）精密稱量60 mg，分別加入200μL水進行勻漿；Waste-BWE樣本在液氮中研磨后精密稱量60 mg，加入1 mL甲醇乙腈水溶液（2:2:1，v/v）。將上述處理后樣本渦旋60 s，低溫超聲30 min，重復2次，?20℃放置1 h沉淀蛋白，過濾管過濾后在3000 r/min和4℃條件下離心20 min，取上清冷凍干燥，?80℃保存樣本。

1.2.2.2 色譜-質譜分析 樣品采用超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱進行分離；柱溫25℃；流速為：0.3 mL/min；流動相組成為A：水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，B從95%線性變化至65%；7～8 min，B從65%線性變化至40%；8～9 min，B維持在40%；9～9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1～12 min，B維持在95%；整個分析過程中樣品置于4℃自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續(xù)分析，并在檢測隊列中插入質控樣品監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性。

樣本檢測完畢后，采用質譜儀對代謝物進行鑒定，采集樣品的一級、二級譜圖。ESI源條件如下：離子源氣體1（Gas1）：40，離子源氣體2（Gas2）：80，氣簾氣（CUR）：30，源溫度：650℃，電壓浮動（ISVF）±5000 V（正負兩種模式）；二級質譜采用信息依賴獲?。↖DA）獲得，并且采用高靈敏度模式，去簇電壓（DP）：±60 V（正負兩種模式），碰撞能量：35±15 eV，IDA設置如下：排除4 Da之內的同位素，每個周期監(jiān)測候選離子數(shù)：10。數(shù)據(jù)采集是按質量范圍進行分段：50～300、290～600、590～900、890～1200，從而擴大二級譜圖的采集率，每個方法每段采集四個重復。所采集獲得的數(shù)據(jù)，分別使用自建MetDDA和Lip DDA方法進行代謝物的結構鑒定。

1.2.3 總酚和總黃酮含量測定

1.2.3.1 總酚含量測定 參照國標GB/T 8313-2018[20]測定總酚含量。沒食子酸標準品溶液濃度在1.760～7.040μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為：y=0.0584x+0.0617，R2=0.9976。

1.2.3.2 總黃酮含量測定 參照深圳市標準化指導性技術文件SZDB/Z 349-2019[21]測定總黃酮含量。準確稱取0.02 g的蘆丁標準品，用60%乙醇溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻后作為蘆丁標準溶液。用移液槍準確吸取0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mL蘆丁標準溶液于8個25 mL具塞比色管中，用60%乙醇溶液補充至6.0 mL，加1 mL亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入1.5 mL硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL氫氧化鈉溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min。在波長510 nm處測定吸光度，以吸光度值對應含量繪制標準曲線。蘆丁標準品溶液濃度在2.000～48.000μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為：y=0.0058x+0.0446，R2=0.9976。

1.2.4 抗氧化活性實驗方法

1.2.4.1 菊花不同提取物對DPPH自由基的清除能力 參照李璐等[22]的實驗步驟測定DPPH自由基清除能力。用無水乙醇配制0.04 mg/mL的DPPH溶液。配制不同濃度梯度的樣品溶液。實驗設樣品組和對照組。樣品組：1 mL樣品液（精密稱取菊花不同提取物浸膏，分別用蒸餾水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL不同濃度梯度的溶液）+2 mL DPPH無水乙醇溶液；第一對照組：1 mL蒸餾水+2 mL DPPH無水乙醇溶液；第二對照組：1 mL樣品液+2 mL無水乙醇；混勻后避光反應30 min，立即在517 nm波長下測定吸光度。VC作為陽性對照品，測定方法同上。自由基清除率的計算公式為：

式中，I為不同提取物對自由基的清除率，%；A1為第一對照組吸光度；A2為第二對照組吸光度；AX為樣品組吸光度。以樣品濃度為橫坐標x，自由基清除率為縱坐標y，進行擬合后得到擬合方程，根據(jù)方程計算出相對半效劑量（EC50）。

1.2.4.2 菊花不同提取物對ABTS+自由基的清除能力 參照李璐等[22]的實驗步驟測定ABTS+自由基清除能力。將等體積的7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液均勻混合，避光反應12 h后稀釋得到ABTS溶液。實驗設樣品組和對照組。樣品組：1 mL樣品液（精密稱取菊花不同提取物浸膏，分別加蒸餾水配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL梯度溶液）+4 mL ABTS溶液；第一對照組：1 mL蒸餾水+4 mL ABTS溶液；第二對照組：1 mL樣品液+4 mL無水乙醇；混勻后避光反應6 min，立即在734 nm波長下測定吸光度。VC作為陽性對照品，測定方法同上。自由基清除率計算公式同1.2.4.1。以樣品濃度為橫坐標x，自由基清除率為縱坐標y，進行擬合后得到擬合方程，根據(jù)方程計算出相對半效劑量（EC50）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

如圖1所示，對不同提取方式菊花的組間單個化合物進行差異倍數(shù)分析，并采用ANOVA單因素分析對其代謝組學測定結果進行顯著性檢驗，最終結果以Bonferroni校正后的P值為準。MUVR（Multivariate methods with Unbiased Variable selection in R）算法是由Shi等[23]為計算及預測變量和相應變量之間關系而開發(fā)的一種新型算法，主要通過在重復的雙重交叉驗證（repeated double cross-validation，rd CV）過程中執(zhí)行遞歸變量消除來實現(xiàn)最小最優(yōu)變量選擇。采用MUVR算法對不同提取方式菊花的代謝物組建立偏最小二乘（PLS）模型和隨機森林（RF）模型進行變量選擇分析，找出最能夠表征不同提取方式區(qū)別的差異代謝物，在展示差異的同時從上千化合物中篩選出最優(yōu)預測差異的代謝物組成，并結合體外抗氧化活性的測定結果篩選出最優(yōu)表征抗氧化活性差異的代謝物。以上分析采用R（V 3.6.1）軟件進行，運用R包“mix Omics”[24]、“MUVR”[23]和“ggplot2”[25]。

圖1 統(tǒng)計分析流程圖Fig.1 Statistical analysis flowchart

2 結果與分析

2.1 菊花不同方法提取物代謝輪廓差異

采用基于LC-MS技術的代謝組學方法對樣本進行了代謝輪廓變化分析，得到的典型總離子流色譜圖（Total Ions Chromatograph，TIC）圖譜（圖2）。其中正離子模式共下可檢出418種代謝物，負離子模式下可檢出358種代謝物。其中包括1,3-二咖啡?；鼘幩帷⒙仍岬却碱惢蚨嘣?，甜菜堿、精氨酸等氨基酸多肽類化合物，抗壞血酸6-棕櫚酸酯、乙酰肉毒堿等脂肪酸脂類化合物，葡萄糖、甘露糖等糖類化合物，三羥黃酮、芹菜素-7-葡糖苷等黃酮苷類化合物等。結果表明，在兩種模式下不同方式提取的菊花代謝物組成均有很大差異?，F(xiàn)有研究表明，菊花眾多代謝物中存在不同的功效物質組分，但對于不同提取方式菊花代謝物差異的比較鮮有研究。李孟等[26]從懷菊花和懷菊莖葉共鑒定出69種成分，并發(fā)現(xiàn)其主要功能成分為亞麻酸、棕櫚酸、亞油酸等。鄭璐璐等[27]采用小鼠血管通透性實驗和小鼠耳腫脹實驗驗證了野菊花的抗炎藥效組分為綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷。

圖2 正離子模式和負離子模式下不同提取方式菊花樣品TIC圖Fig.2 TIC of Chrysanthemum samples with different extraction methods in positive and negative ion mode

2.2 三種水提物代謝物組和抗氧化活性差異

分別在正離子模式和負離子模式下對BWE、RWE和UWE三組不同方式水提菊花樣品代謝物進行差異倍數(shù)分析（圖3A、圖3B）。分別計算RWE組、UWE組代謝物與BWE組代謝物的差異倍數(shù)并進行顯著性檢驗，取差異倍數(shù)的log2對數(shù)值以縮小差異倍數(shù)數(shù)值間的差距。結果表明，UWE組與BWE組間代謝物差異相較于RWE組與BWE組之間差異顯著（Bonferroni-P<0.05）且部分代謝物差異倍數(shù)更大，說明超聲波輔助水提與普通水煎水提的差別更大，而熱回流水提與普通水煎水提更為接近。差異代謝物能夠作為區(qū)分三種水提方式的關鍵信息（圖3C、圖3D）?；贛UVR-PLS模型優(yōu)化結合ANOVA多重假設檢驗分析篩選得到33個顯著區(qū)別三種不同方式水提菊花的差異代謝物（Bonferroni-P<0.05，圖4A）。差異代謝物相對含量在不同組間分布的聚類熱圖所示（圖4A），30個代謝物在BWE組中含量高于其他兩組，而在RWE組中含量最低；麥角硫因和天冬氨酸在RWE組中含量最高，在BWE組中含量最低。

圖3 三種菊花水提物的差異倍數(shù)分析和多元統(tǒng)計分析Fig.3 Fold change and multivariatestatistical analysis of Chrysanthemum water extracts

三組不同方式水提菊花提取物對DPPH和ABTS+自由基清除率EC50差異顯著（P<0.05,圖4B、圖4C，表1，表2）。從對DPPH自由基清除的結果來看，EC50大小為VC

表1 菊花不同提取物對DPPH自由基清除活性及其量效關系數(shù)學模型Table 1 DPPH radical-scavenging activity and mathematical model of dose-effect relationship of different Chrysanthemum extracts

表2 菊花不同提取物對ABTS+自由基清除活性及其量效關系數(shù)學模型Table 2 ABTS+· radical-scavenging activity and mathematical model of dose-effect relationship of different Chrysanthemum extracts

用MUVR-RF模型篩選能夠最優(yōu)表征三組水提組對ABTS+自由基清除效果的差異代謝物（圖4G、圖4H、圖4I）。結合單因素分析和多元統(tǒng)計分析的結果，篩選出三個具有抗氧化活性的物質麥角硫因、芹菜素和磷脂酰膽堿，并發(fā)現(xiàn)它們在BWE、RWE和UWE中的含量，與其對ABTS+自由基清除效果呈顯著正相關（P<0.05）。前期研究發(fā)現(xiàn)，麥角硫因作為一種神經保護劑，通過其強大的抗氧化活性來保護HT 22海馬神經元免受H2O2誘導的神經毒性[31]；芹菜素在自由基清除系統(tǒng)中具有較強的抗氧化能力，并在細胞和分子水平上保護HPBL免受輻射所致的氧化損傷[32]；磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺影響脫脂花生油和塊狀花生油氧化的穩(wěn)定性，它們能通過減少過氧化和碳中心自由基的生成來減緩塊狀花生油的氧化[33]。

圖4 菊花水提組代謝物和抗氧化活性分析Fig.4 Analysisof metabolites and antioxidant activity of Chrysanthemum water extracts

2.3 超聲水提和超聲醇提代謝物組和抗氧化活性差異

為了對富硒杭白菊中代謝物的全面檢識，進一步分析水提與醇提樣本代謝物組，并對照探究兩種提取方式對抗氧化活性的潛在影響。對UWE和UEE兩組超聲提取的菊花樣品的代謝物進行差異倍數(shù)分析（圖5A、圖5B）發(fā)現(xiàn)UWE組和UEE組的代謝物差異顯，差異代謝物能夠將它們完全區(qū)分開（圖5C、圖5D）。

圖5 菊花超聲提取組的差異倍數(shù)分析和多元統(tǒng)計分析Fig.5 Fold changeand multivariate statistical analysisof Chrysanthemum ultrasonic assisted extracts

基于MUVR-PLS模型優(yōu)化結合ANOVA多重假設檢驗分析篩選得到35個顯著區(qū)別兩組超聲提取的菊花的差異代謝物（Bonferroni-P<0.05，圖6A）。35個代謝物中多數(shù)在UEE組中含量顯著（P<0.05）高于UWE組；而咖啡酸和腺嘌呤等少數(shù)則在UWE組中含量顯著（P<0.05）高于UEE組。

兩組超聲提取菊花樣品的DPPH自由基清除率EC50差異顯著（P<0.05），而ABTS+自由基清除率無顯著差異（圖6B、圖6C）。從DPPH自由基清除的結果來看，EC50大小為UEE

圖6 菊花超聲提取組代謝物和抗氧化活性分析Fig.6 Analysisof metabolitesand antioxidant activity of Chrysanthemum ultrasonic assisted extracts

從上述結果來看，探索性的發(fā)現(xiàn)代謝物α-亞麻酸、甜菜堿、β-高脯氨酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯或是區(qū)分UWE和UEE組菊花提取物的抗氧化活性功效物質組的成分。

2.4 不同菊花提取物總酚總黃酮含量分析

分別采用Folin-Ciocalteu和NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度法，測定不同提取物總酚和總黃酮含量。結果表明，BWE、RWE、UEE、UWE組中總酚含量分別為13.858%、10.708%、16.644%、20.160%（圖7A），總黃酮含量分別為26.401%、15.984%、27.299%、40.769%（圖7B）。

圖7 不同菊花提取物總酚總黃酮含量Fig.7 Content of total phenols and flavonoids in different Chrysanthemum extracts

總酚和總黃酮能夠抑制體內自由基的產生，減少組織損傷程度，并且通過抑制免疫細胞釋放炎癥因子和細胞因子達到緩解炎癥的作用，具有很好的抗炎和抗氧化、免疫調節(jié)、肝保護、抗衰老、抗腫瘤、抗瘧原蟲和防治心腦血管疾病等多種藥理功能[39?42]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)杭白菊提取物總酚、總黃酮含量并不能很好的反應其體外抗氧化能力。這一結果表明探索特定表征抗氧化活性的物質的必要性?？寡趸钚缘漠a生并不是所有的酚類和黃酮類化合物都發(fā)揮作用，而是某種或數(shù)種特定的成分共存互作達到的效果。Gong等[43]對杭白菊酚類化合物進行分析后檢測到14種酚類化合物，發(fā)現(xiàn)“胎菊”比“多菊”具有更高的咖啡?？鼘幩岷亢透鼜姷目寡趸钚?，且二者顯著相關。這與本實驗的發(fā)現(xiàn)相一致。

2.5 菊花水煎提取過程成分變化

在兩種模式下對BWE、Waste-BWE和UEEWaste三組不同水煎過程菊花樣品代謝物進行差異倍數(shù)分析（圖8A、圖8B）。BWE組與Waste-BWE組間代謝物差異巨大，檢驗結果顯著，說明通過水煎法能夠充分提取菊花樣品中的代謝物，造成水提物與濾渣間的差異；而UEE-Waste組與Waste-BWE組的代謝物也有一定差異，檢驗結果比較顯著，說明將水煎法提取物濾渣再用超聲波輔助乙醇提取，能提取出部分水煎法無法提取的代謝物。通過MUVE-PLS模型發(fā)現(xiàn)差異代謝物能夠作為區(qū)分BWE、Waste-BWE和UEE-Waste組的關鍵信息（圖8C、圖8D）。

圖8 菊花水煎提取過程的差異倍數(shù)分析和多元統(tǒng)計分析Fig.8 Fold changeand multivariate statistical analysisof the processof Chrysanthemum water extraction

基于MUVR-PLS模型優(yōu)化結合ANOVA多重假設檢驗分析篩選得到50個顯著區(qū)別三組不同水煎提取過程菊花樣品的差異代謝物（Bonferroni-P<0.05，圖9）。大部分代謝物在BWE組中含量顯著高于另外兩組；然而有9種化合物在UEE-Waste組中含量顯著高于其他兩組，說明超聲波輔助醇提可以從水煎的殘渣中有效富集這些物質。在這些代謝物中，包括了前面提到的黃豆黃素和α-亞麻酸，都被報道有很好的抗氧化活性。

圖9 水煎提取過程菊花樣品的差異代謝物熱圖Fig.9 Differential metabolites heat map of the process of Chrysanthemum water extraction

3 結論

本研究采用高通量植物液相質譜代謝組學技術及多元統(tǒng)計分析，對不同提取方法（BWE、RWE、UWE和UEE）杭白菊提取物代謝物組化學成分差異進行研究，篩選出最優(yōu)表征其抗氧化活性的代謝物。建立MUVR-PLS模型對差異代謝物進行篩選，得到區(qū)別BWE、RWE和UWE三種不同方式水提菊花提取物的70個差異代謝物，其中33個經過ANOVA多重假設檢驗分析Bonferroni校正后差異顯著；得到區(qū)別UWE和UEE兩組超聲菊花提取物的126個差異代謝物，其中35個差異顯著；得到BWE、Waste-BWE和UEE-Waste三組不同水煎過程菊花樣品的140個差異代謝物，其中50個差異顯著。分別以蘆丁和沒食子酸為對照品，測定不同方式菊花提取物總黃酮和總酚的含量。結果表明，總黃酮含量和總酚含量均為UEE>UWE>BWE>RWE，而且總黃酮含量明顯高于總酚含量。通過測定ABTS和DPPH自由基清除率來評價不同提取物的抗氧化活性。從DPPH自由基清除的結果來看，水提組抗氧化活性大小為UWE