基于DNA條形碼的長(zhǎng)江口魚類浮游生物形態(tài)分類研究

劉守海，楊旖祎，何彥龍，季曉，王宇壇，張海景，毛如意，蔣曉山，程祥圣*

( 1.國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，上海 201206；2.自然資源部海洋生態(tài)監(jiān)測(cè)與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201206；3.國(guó)家海洋局東海海洋環(huán)境調(diào)查勘察中心，上海 200137)

1 引言

魚類浮游生物（Ichthyoplankton）是魚卵、仔魚和稚魚的統(tǒng)一簡(jiǎn)稱，魚卵和仔、稚魚是魚類生活史早期發(fā)育的重要階段。作為魚類種群補(bǔ)充的重要來(lái)源，它們的種類分布和數(shù)量變化是評(píng)估海域魚類產(chǎn)卵場(chǎng)、親魚資源量和漁業(yè)資源補(bǔ)充量最直接有效的數(shù)據(jù)資料之一。仔、稚魚既是生物能的消費(fèi)者，又是生物能的轉(zhuǎn)換者，是海洋食物鏈中的重要環(huán)節(jié)之一，基于此，魚類浮游生物已成為海洋生物多樣性與海洋生態(tài)學(xué)的重要研究對(duì)象[1]。準(zhǔn)確鑒定魚類浮游生物是開展這些研究的基礎(chǔ)。魚類發(fā)育過程的形態(tài)變化非常復(fù)雜，因此，如何系統(tǒng)準(zhǔn)確地找出各發(fā)育階段的形態(tài)變化、找出最基本的特征是這一基礎(chǔ)的前提。通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法來(lái)認(rèn)識(shí)魚類早期發(fā)育變化的方法有3種[2]：第1種是人工授精法，通過對(duì)某種成魚進(jìn)行人工授精獲得的樣品與天然采集到的樣品進(jìn)行比較來(lái)鑒別種類[3-4]，這種方法鑒定的種類是絕對(duì)可靠的，但往往受海上條件所限，在海上進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)人工授精是比較困難的；第2種方法是動(dòng)態(tài)研究法，即用大量不同大小的標(biāo)本，按發(fā)育期先、后進(jìn)行追蹤觀察，比較形態(tài)和器官的發(fā)育差異，以形態(tài)進(jìn)行分類[5-8]；第3種方法是靜態(tài)研究法，是以單個(gè)個(gè)體完整性為重點(diǎn)，追尋個(gè)體形態(tài)發(fā)育階段的主要特征，其優(yōu)點(diǎn)是僅用少數(shù)標(biāo)本便可進(jìn)行鑒定分類，但此方法要求鑒定者非常熟悉各科、屬、種的幼體形態(tài)特征[9]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，魚類浮游生物鑒定工作的準(zhǔn)確性得到很大的提升，如掃描電鏡技術(shù)的發(fā)展讓研究者可以通過電子顯微鏡觀察魚卵的卵膜結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行種類的鑒定[10-12]。近年來(lái)，隨著DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)在魚類鑒定研究中廣泛應(yīng)用[13]，更多學(xué)者嘗試?yán)肈NA條形碼對(duì)魚類浮游生物進(jìn)行種類鑒定。Pegg等[14]利用COⅠ基因?qū)Π拇罄麃喣喜看蟊そ傅淖恤~進(jìn)行了鑒定。Valdez-Moreno等[15]利用DNA條形碼對(duì)墨西哥尤卡坦半島附近海域的成魚和仔魚（早期魚類）進(jìn)行種類鑒定研究。Ko等[16]應(yīng)用DNA條形碼評(píng)估了5家研究機(jī)構(gòu)仔魚形態(tài)鑒定結(jié)果的精確度，通過DNA條形碼鑒定到種水平的仔魚占69%。該研究認(rèn)為，DNA條形碼技術(shù)是種類鑒定的最好方法之一。周美玉等[17]將從形態(tài)學(xué)特征鑒定為2種類型魚卵和3種類型仔、稚魚的樣品，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)分析鑒定出魚卵種類為3種、仔、稚魚種類為4種。劉守海等[18]通過DNA條形碼技術(shù)鑒定調(diào)查所獲得的7目10科樣品，鑒定到種的比例高達(dá)94.7%。周曉夢(mèng)等[19]應(yīng)用DNA條形碼和形態(tài)對(duì)短吻紅舌鰨（Cynoglossus joyneri）魚卵、仔魚進(jìn)行了鑒定。以上結(jié)果說明，DNA條形碼應(yīng)用于魚卵和仔、稚魚的鑒定可大大提高種類鑒定結(jié)果的精確性，這些研究大大提高了魚類浮游生物的鑒別準(zhǔn)確性。

長(zhǎng)江口水域由于長(zhǎng)江徑流帶來(lái)了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，孕育了豐富的餌料資源，使之成為多種經(jīng)濟(jì)魚類的產(chǎn)卵、育幼和索餌的重要場(chǎng)所[20]。長(zhǎng)江口的魚類浮游生物研究始于20世紀(jì)80年代[21-24]，長(zhǎng)江口共有魚類浮游生物56科123種，其中鑒定到種為93種，鑒定到屬為6種，鑒定到科為17種，未定種為7種。以上調(diào)查皆通過形態(tài)獲得種類鑒定結(jié)果，且有一定比例的種類未定到種。本文以2016年5月和8月及2017年8月長(zhǎng)江口及其鄰近海域的仔、稚魚樣品為材料，采用形態(tài)學(xué)與DNA條形碼相結(jié)合的形式進(jìn)行魚類浮游生物分類研究，獲得了長(zhǎng)江口春夏季魚類浮游生物種名錄，通過攝影、繪圖等手段，記錄并描述報(bào)道較少種類的魚類早期發(fā)育階段的形態(tài)特征，為河口魚類育幼場(chǎng)的研究提供了科學(xué)依據(jù)，也為魚類早期發(fā)育階段資料的積累探索了新途徑。

2 材料與方法

2.1 樣品采集和形態(tài)學(xué)鑒定

于2016年5月、8月以及2017年8月在長(zhǎng)江口及其鄰近海域設(shè)置采樣站點(diǎn)（圖1），按照《海洋調(diào)查規(guī)范》（GB/T 12763.6-2007）使用淺水Ⅰ型網(wǎng)（網(wǎng)長(zhǎng)為145 cm、網(wǎng)口內(nèi)徑為50 cm、網(wǎng)口面積為0.5 m2、篩絹孔徑為0.505 mm）和大型浮游生物網(wǎng)（網(wǎng)長(zhǎng)為280 cm、網(wǎng)口內(nèi)徑為80 cm、網(wǎng)口面積為0.5 m2、篩絹孔徑為0.505 mm）在站點(diǎn)分別進(jìn)行垂直拖網(wǎng)和水平拖網(wǎng)。采集到的標(biāo)本現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行初步處理，用無(wú)水乙醇保存。

圖1 長(zhǎng)江口海域采樣站位圖Fig.1 Sampling stations in the Changjiang River Estuary

在室內(nèi)Nikon SMZ 25體視顯微鏡（尼康，日本）下，根據(jù)魚卵和仔、稚魚形態(tài)特征，對(duì)樣品進(jìn)行初步鑒定[2,25]。用NIS-Elements D軟件進(jìn)行拍照并獲取體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、眼徑等參數(shù)。從形態(tài)鑒定結(jié)果中，按1～10、10～50、50～100、大于 100的數(shù)量組，分別取1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)、10個(gè)個(gè)體進(jìn)行DNA條形碼分子實(shí)驗(yàn)。

2.2 DNA條形碼分析方法

魚卵取單個(gè)整粒魚卵，體長(zhǎng)小的仔魚取整條，較大的仔、稚魚取尾部。取肌肉約100 mg，使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。使用通用引物F1：TCR ACY AAY CAY AAA GAY ATY GGC AC和 R1：TAG ACT TCW GGG TGR CCR AAG AAT CA擴(kuò)增仔、稚魚的線粒體DNA 的COⅠ部分序列，PCR總反應(yīng)體系為50 μL，其中包括：10×PCR 緩沖液 5 μL、dNTP 4 μL（濃度為2.5 mmol/L）、上下游引物各 2 μL（濃度為 10 mmol/L）、Taq DNA 聚合酶 0.8 μL（濃度為 5 U/μL）、模板 DNA 1 μL，加雙蒸水至總體積 50 μL。樣品在 AG-22331 型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s、52℃ 退火 45 s、72℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司膠回收雙向測(cè)序后拼接。

2.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAStar 軟件包對(duì)測(cè)得的序列和GenBank下載序列進(jìn)行校對(duì)，用Clustal X對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)排序并去除兩端冗余列。將確定有效的COⅠ基因序列在 Bold System（Barcode of Life Data System）數(shù)據(jù)庫(kù)和 GenBank中進(jìn)行BLAST分析來(lái)物種鑒定。采用遺傳相似度不低于99%的為同一物種，92%～99%為同一屬，85%～92%為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本調(diào)查海域的魚類浮游生物進(jìn)行種類鑒定[13,16]，對(duì)于比對(duì)到不同物種上的序列，進(jìn)一步通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹來(lái)確定物種。結(jié)果按照《拉漢世界魚類名典》[26]進(jìn)行同種異名的校正。

3 結(jié)果與分析

3.1 2016?2017 年長(zhǎng)江口及鄰近海域魚類浮游生物種類組成

2016年5 月、8月以及2017年8月，調(diào)查共獲得魚類浮游生物9目19科55種，其中鑒定到種的有45種，鑒定到屬的有5種，鑒定到科的有5種，鑒定到種的比例為81.8%。鱸形目種類數(shù)最多有33種，其次是鯉形目有6種，鯡形目和鰈形目含有相同種類數(shù)都為4種，鯔形目2種，鲀形目2種，鲉形目2種，鰻鱺目1種，仙女魚目1種。在鱸形目中，以蝦虎魚科和石首魚科最多，兩者占鱸形目種類的近80%（表1）。

從種類組成的季節(jié)分布來(lái)看，魚類浮游生物類群的季節(jié)變化不明顯，其中，以鯉形目的鯉科，鯡形目的鳀科，鱸形目的石首魚科和蝦虎魚科為主。但在種類上有明顯的季節(jié)變化，夏季魚類浮游生物種類數(shù)多于春季。在5月和8月均出現(xiàn)的種類僅有鳳鱭（Coilia mystus）、日本鳀（Engraulis japonius）和小黃魚（Larimichthys polyactis）。僅在5月出現(xiàn)的種類有16種，以淡水的鯉科和咸淡水的蝦虎魚科為主，包括鯉科的鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、青魚（Mylopharyngodon piceus）、鳊魚（Parabramis peknensis），蝦虎魚科的斑點(diǎn)竿蝦虎魚（Luciogobius guttatus）、睛尾蝌蚪蝦虎魚（Lophiogobius ocellicauda）、斑尾刺蝦虎魚（Acanthogobius ommaturus）等。僅在8月出現(xiàn)的種類有36種，以蝦虎魚科（14個(gè)）、石首魚科（6個(gè)）和鯉科（3個(gè)）為主。包括鯉科的寡鱗飄魚（Pseudolaubuca engraulis）、銀飄魚（Pseudolaubuca sinensis），石首魚科的棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）、皮氏叫姑魚（Johnius belangerii）、叫姑魚（Johnius grypotus）、鮸（Miichthys miiuy），蝦虎魚科的阿部氏鯔蝦虎魚（Mugilogobius abei）、髭縞蝦虎魚（Tridentiger barbatus）、孔蝦虎魚（Trypauchen vagina）、拉氏狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus lacepedii）等。

3.2 形態(tài)描述

我國(guó)已知海洋魚類已超3 000種，但資料可查的魚卵與仔、稚魚種類不超過300種[2,27]。在傳統(tǒng)方法研究下，一些仔、稚魚常見種或隱存種[18]，如龍頭魚（Harpadon nehereus）、前鱗龜鰉（Chelon affinis），沒有得到認(rèn)識(shí)。仔、稚魚發(fā)育是連續(xù)變化的一個(gè)過程，目前有很多種類只有某個(gè)階段的形態(tài)特征描述及圖譜[28]，如四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）、少鱗鱚等。因此，本文選擇之前報(bào)道較少種類進(jìn)行形態(tài)特征描述，并繪制手繪圖，獲得分類鑒定資料。

3.2.1 龍頭魚Harpadon nehereus（Hamilton 1822 ）

（1）分類地位

仙女魚目Aulopiformes，狗母魚科Synodontidae，龍頭魚屬Harpadon。

（2）參考序列

JX534239，KP112261。

（3）形態(tài)特征

全長(zhǎng)為5.97 mm，體長(zhǎng)為5.82 mm。卵黃囊已全部吸收。頭長(zhǎng)為0.83 mm，占體長(zhǎng)的14.3%，眼徑為0.29 mm，占頭長(zhǎng)的34.9%。眼變黑，口、咽、消化道已經(jīng)相通，消化道細(xì)長(zhǎng)，自胸鰭基至肛門處的消化道背緣兩側(cè)有3對(duì)橢圓形黑色素斑塊，3對(duì)色素斑呈等間隔分布。肛門位于體中央稍后。肛前距為4.11 mm，占體長(zhǎng)的70.6%。肛后尾部腹緣有1個(gè)菊花狀黑色素。尾端脊索平直。背部鰭膜起始于顱頂，然后向后一直延伸到尾部鰭膜，無(wú)色透明，腹部鰭膜起點(diǎn)略低于背部鰭膜（附圖 A1a）。

全長(zhǎng)為 9.75 mm，體長(zhǎng)為 9.24 mm。頭長(zhǎng)為 1.25 mm，占體長(zhǎng)的13.5%，眼徑為0.47 mm，占頭長(zhǎng)的37.6%?？诹言龃?。胸鰭基至肛門前共有5對(duì)橢圓形黑色素斑塊，在原來(lái)第1對(duì)、第2對(duì)之間和原來(lái)第3對(duì)后面，各增加1對(duì)色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為6.84 mm，占體長(zhǎng)的74.0%。肛后尾部腹緣有1個(gè)菊花狀黑色素。脊索向上翹。臀鰭鰭條出現(xiàn)，尾鰭有20～22 鰭條（附圖 A1b）。

全長(zhǎng)為30.55 mm，體長(zhǎng)為26.35 mm。頭長(zhǎng)為3.94 mm，占體長(zhǎng)的15.0%，眼徑為1.31 mm，占頭長(zhǎng)的33.2%。肛門前共有6對(duì)橢圓形黑色素斑塊，胸鰭前增加1對(duì)黑色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為19.34 mm，占體長(zhǎng)的73.4%。肛后尾部腹緣菊花狀黑色素消失。第一背鰭10鰭條，脂鰭出現(xiàn)，腹鰭鰭條形成。尾鰭基底出現(xiàn)4個(gè)較小斑塊狀色素（附圖A1c）。

全長(zhǎng)為40.37 mm，體長(zhǎng)為34.27 mm。頭長(zhǎng)為6.73 mm，占體長(zhǎng)的19.6%，眼徑為1.25 mm，占頭長(zhǎng)的18.6%。兩側(cè)至肛門前共有7對(duì)黑色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為25.81 mm，占體長(zhǎng)的75.3%。第一背鰭12鰭條，脂鰭始點(diǎn)在臀鰭中間位置。腹鰭15鰭條。臀鰭8鰭條。尾鰭基底4個(gè)黑色素塊消失2個(gè)，僅剩2處較小斑塊狀色素（附圖A1d）。

（4）研究概況

有關(guān)龍頭魚早期生活史的研究，Delsman[29]記錄了0.8 mm的龍頭魚魚卵；沖山宗雄[9]對(duì)日本海域體長(zhǎng)為25～30 mm的龍頭魚稚魚的形態(tài)作過描述。本文描述龍頭魚從仔魚到稚魚（體長(zhǎng)為5.82 ～34.27 mm）的個(gè)體發(fā)育形態(tài)，補(bǔ)充了仔、稚魚形態(tài)特征變化的描述。

3.2.2 前鱗龜鰉Chelon affinis(Günther 1861)

（1）分類地位

鯔形目Mugiliformes，鯔科Mugilidae，龜鰉屬Chelon。

（2）參考序列

JF911709。

（3）形態(tài)特征

全長(zhǎng)為26.54 mm，體長(zhǎng)為21.82 mm。頭長(zhǎng)為6.51 mm，占體長(zhǎng)的29.8%，眼徑為2.13 mm，占頭長(zhǎng)的32.7%。上下頜有色素，自頭后至尾柄的體側(cè)中軸以上星狀、樹枝狀和菊花狀色素不規(guī)則分布。臀鰭基部分布樹枝狀和菊花狀色素。肛門位于體中央稍后。肛前距為15.00 mm，占體長(zhǎng)的68.7%。所有鰭條都已形成。背鰭2個(gè)，第一背鰭II鰭棘5鰭條，第二背鰭II鰭棘7鰭條。臀鰭起始位置比第二背鰭起點(diǎn)略靠前，臀鰭II鰭棘 12 鰭條（附圖 A2）。

（4）研究概況

沖山宗雄[9]對(duì)日本海域體長(zhǎng)為4.1～12.0 mm的前鱗龜鰉形態(tài)作過描述。國(guó)內(nèi)未見前鱗龜鰉早期生活史的研究報(bào)道。本文描述了體長(zhǎng)為21.82 mm前鱗龜鰉稚魚的形態(tài)。

3.2.3 四 指 馬 鲅Eleutheronema tetradactylum（Shaw 1804）

（1）分類地位

鱸形目Perciformes，馬鲅科Polynemidae，四指馬鲅屬Eleutheronema。

（2）參考序列

KC878730。

（3）形態(tài)特征

全長(zhǎng)為11.18 mm，體長(zhǎng)為9.88 mm。體前部呈橢圓形，頭較大，頭長(zhǎng)為3.02 mm，占體長(zhǎng)的30.6%，眼徑為0.69 mm，占頭長(zhǎng)的22.8%。吻鈍圓，上頜骨有左右對(duì)稱的1對(duì)黑色素。肛門位置約為體中部，肛前距為5.68 mm，占體長(zhǎng)的57.5%。脊索尾椎骨向上彎曲。背鰭2個(gè)，第一背鰭VI鰭棘，第二背鰭I鰭棘15 鰭條。臀鰭位置與第二背鰭相對(duì)應(yīng)，臀鰭II鰭棘17鰭條。腹部胸鰭下方有1個(gè)黑色素。臀鰭基有1排黑色素，始于臀鰭中部，約10個(gè)附圖（A3）。

（4）研究概況

有關(guān)四指馬鲅早期生活史的研究，多以人工培育下四指馬鲅早期發(fā)育的形態(tài)及生長(zhǎng)的觀察為主[30-32]。王曉東[33]描述了全長(zhǎng)為13.4 mm四指馬鲅稚魚的形態(tài)，各鰭鰭條數(shù)目基本穩(wěn)定，鱗片開始出現(xiàn)。本文較詳細(xì)描述了體長(zhǎng)為9.88 mm四指馬鲅稚魚的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)臀鰭基有1排黑色素，始于臀鰭中部，約10個(gè)。

3.2.4 少鱗鱚Sillago japonica(Temminck et Schlegel 1843)

（1）分類地位

鱸形目Perciformes，鱚科Sillaginidae，鱚屬Sillago。

（2）參考序列

AP017438。

（3）形態(tài)特征

全長(zhǎng)為13.89 mm，體長(zhǎng)為12.71 mm。頭長(zhǎng)為3.35 mm，占體長(zhǎng)的26.4%，眼徑為1.15 mm，占頭長(zhǎng)的34.3%。頭部眼后方有數(shù)個(gè)小塊狀黑色素，下顎、腹部正中線、臀鰭基底有點(diǎn)狀黑色素分布，尾柄背緣、腹緣及體側(cè)正中線有斑塊狀黑色素分布，尾鰭基底出現(xiàn)2叢黑色素。肛門位于體中央略前。肛前距為6.07 mm，占體長(zhǎng)的47.8%。第一背鰭VIII鰭棘，第二背鰭19鰭條，胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭鰭條已形成（附圖A4）。

（4）研究概況

有關(guān)少鱗鱚早期生活史的研究，水戸敏[34-35]對(duì)日本福岡外海的少鱗鱚進(jìn)行了人工授精、孵化實(shí)驗(yàn)，詳細(xì)描述了魚卵和仔、稚魚的發(fā)育與形態(tài)；沖山宗雄[9]對(duì)體長(zhǎng)為2.6～16.5 mm的少鱗鱚仔、稚魚的形態(tài)作過描述；王曉東[33]描述了全長(zhǎng)為6.5～16.5 mm少鱗鱚仔稚魚的形態(tài)。本文描述了體長(zhǎng)為12.71 mm少鱗鱚稚魚的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)尾柄背緣、腹緣及體側(cè)正中線有斑塊狀黑色素分布，尾鰭基底出現(xiàn)2叢黑色素。

3.2.5 日 本 須 鰨Paraplagusia japonica（Temminck &Schlegel 1846）

（1）分類地位

隸屬于鰈形目Pleuronectiformes，舌鰨科Cynoglossidae，須鰨屬Paraplagusia。

（2）參考序列

JQ639066。

（3）形態(tài)特征

全長(zhǎng)為6.08 mm，體長(zhǎng)為5.92 mm。頭長(zhǎng)為1.42 mm，占體長(zhǎng)的24.0%，眼徑為0.36 mm，占頭長(zhǎng)的25.4%。卵黃囊仍未完全消失，卵黃囊下方有一簇色素?？阝g圓，上、下頜及鰓蓋骨形成。顱頂上方棘冠出現(xiàn)2條長(zhǎng)棘條，長(zhǎng)度分別為1.13 mm和1.49 mm。體部背緣有5個(gè)叢狀黑色素，每叢5～6個(gè)樹枝狀黑色素或點(diǎn)狀黑色素，腹緣有1列不規(guī)則排列的黑色素分布。肛門位于體中央略前。肛前距為2.51 mm，占體長(zhǎng)的42.4%。尾部鰭膜上出現(xiàn)彈性絲（附圖A5）。

（4）研究概況

有關(guān)日本須鰨早期生活史的研究，男卓志[36]報(bào)道了日本若狹灣西部及其鄰近海域直徑為0.8 mm左右的日本須鰨卵和體長(zhǎng)為5.95～12.30 mm的日本須鰨仔、稚魚形態(tài)；丘臺(tái)生[37]描述了我國(guó)臺(tái)灣沿海體長(zhǎng)為4.0～7.9 mm的日本須鰨仔稚魚形態(tài)；沖山宗雄[9]對(duì)體長(zhǎng)為10.2～12.3 mm的日本須鰨仔稚魚的形態(tài)作過描述；萬(wàn)瑞景和張仁齋[25]描述了1984年6月采自東海海域的體長(zhǎng)6.80 mm的日本須鰨仔魚形態(tài)，體側(cè)背緣自頭后至尾端有10余個(gè)叢狀黑色素，體側(cè)的腹緣也有9個(gè)叢狀黑色素分布。本文描述了體長(zhǎng)為5.92 mm日本須鰨仔魚的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)體部背緣有5個(gè)叢狀黑色素，每叢5～6個(gè)樹枝狀黑色素或點(diǎn)狀黑色素，腹緣有1列不規(guī)則排列的黑色素分布。

4 討論

DNA條形碼技術(shù)是一項(xiàng)通過標(biāo)準(zhǔn)化的短基因片段的序列差異來(lái)對(duì)物種進(jìn)行鑒定的技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法，DNA條形碼技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于它能準(zhǔn)確鑒定不同發(fā)育階段的個(gè)體、形態(tài)相似度較高的物種和因缺少形態(tài)學(xué)分類數(shù)據(jù)而導(dǎo)致很難進(jìn)行區(qū)分的個(gè)體[38]。這項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用到魚類浮游生物的鑒定中，快速解決了很多傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法無(wú)法解決的問題[28]。物種判別標(biāo)準(zhǔn)是分子鑒定研究中最重要的因素，根據(jù)Ward等[39]、Ko等[16]、周美玉等[17]的研究結(jié)果，本文采用遺傳相似度不低于99%的為同一物種、92%～99%為同一屬、85%～92%為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本調(diào)查海域的魚類浮游生物進(jìn)行種類判定。大多數(shù)的種類能夠準(zhǔn)確鑒定到種（表1）。部分樣品序列因與某一物種相似度不高而未鑒定到種，如有序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的寡鱗飄魚相似度最大為98%，故鑒定到飄魚屬。有些樣品序列與兩個(gè)種類的相似度均為99%～100%，且這些種類在本調(diào)查區(qū)域均有出現(xiàn)[40-41]，故只將其鑒定到科或?qū)俚乃?。如最后鑒定為鯔蝦虎魚屬的序列，其與數(shù)據(jù)庫(kù)中的阿部氏鯔蝦虎魚和粘皮鯔蝦虎魚（Mugilogobius myxodermus）相似度為99%以上，且二者在本調(diào)查海域均有分布記錄。本研究中樣品序列與大鰭彈涂魚（Periophthalmus magnuspinnatus）和青彈涂魚（Scartelaos histophorus）相似度均為99%的序列，因此無(wú)法準(zhǔn)確鑒定，故將其鑒定為蝦虎魚科[42]。此外，本研究鑒定的序列，與數(shù)據(jù)庫(kù)中黑鰓梅童魚（Collichthys niveatus）（HM219223）和小黃魚相似度達(dá)99%以上，根據(jù)Cheng等[43]研究可知，黑鰓梅童魚序列疑為形態(tài)鑒定有誤，故本研究將其鑒定為小黃魚。因此數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性與可靠性對(duì)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

表1 長(zhǎng)江口魚類浮游生物種名錄（2016年春季（5月）、夏季（8月）和2017年夏季（8月））Table 1 List of ichthyoplankton species of Changjiang River Estuary（spring (May),summer (August) 2016 and summer (August) 2017）

長(zhǎng)江口魚類浮游生物在種類上有明顯的季節(jié)變化，而類群無(wú)明顯的季節(jié)變化。本研究中，僅在5月出現(xiàn)的種類有16種，有36種僅在8月出現(xiàn)。在溫帶和亞熱帶河口，魚類浮游生物的數(shù)量在夏季達(dá)到峰值，且具有優(yōu)勢(shì)種種類季節(jié)變動(dòng)模式[23]。本研究中，河口魚類浮游生物主要類群為蝦虎魚科和鯉科，但同一類群里種類有季節(jié)變化，如同為鯉科，5月出現(xiàn)的種類為鰱魚、青魚、鳊魚，8月出現(xiàn)的種類為寡鱗飄魚、銀飄魚。根據(jù)生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)排斥原理，生態(tài)上類似的種很少能共存于一個(gè)生態(tài)位中，因而生活在一起的各個(gè)物種都必須有它們自己獨(dú)特的生態(tài)位[44]，即相同科或者相同屬魚類在時(shí)間上出現(xiàn)明顯的錯(cuò)位分布，因?yàn)樯鷳B(tài)位接近，時(shí)間錯(cuò)位分布可以減少對(duì)空間和食物資源的競(jìng)爭(zhēng)[45]。這一現(xiàn)象在長(zhǎng)江口成魚也有出現(xiàn)，鯧科鯧屬的銀鯧（Pampus argenteus）（出現(xiàn)于 5-8月）和灰鯧（Pampus cinereus）（出現(xiàn)于 8-9 月），尾數(shù)有明顯的時(shí)間錯(cuò)位分布現(xiàn)象[45]。成魚的繁殖策略和產(chǎn)卵區(qū)域水體環(huán)境的季節(jié)變化是河口魚類浮游生物種類季節(jié)變動(dòng)的主要因素之一[46-47]。

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法相結(jié)合的研究思路，在DNA條形碼技術(shù)的輔助鑒定下，收集了魚類浮游生物形態(tài)特征，積累了魚類早期發(fā)育的形態(tài)分類信息[28]。本研究首次描述了隱存種[18]前鱗龜鰉稚魚、河口常見優(yōu)勢(shì)種[48]龍頭魚仔稚魚階段的形態(tài)特征；報(bào)道了少鱗鱚、四指馬鲅和日本須鰨等種類在不同發(fā)育階段或不同體長(zhǎng)的特征。這些工作完善了魚類浮游生物的分類鑒定資料，為魚類早期發(fā)育階段分類資料的積累探索了新途徑。

致謝：何日光、彭小家、陳耀輝等同志在室內(nèi)樣品和數(shù)據(jù)處理等方面做了大量工作，謹(jǐn)致謝忱。特別感謝陳蓮芳研究員對(duì)本文審閱并提出寶貴意見。

續(xù)表1

附錄1

圖 A1 龍頭魚仔稚魚Fig.A1 Larvae and juvenile stages of Harpadon nehereus

圖 A2 前鱗龜鰉稚魚Fig.A2 Juvenile stage of Chelon affinis

圖 A3 四指馬鲅稚魚Fig.A3 Juvenile stage of Eleutheronema tetradactylum

圖 A4 少鱗鱚稚魚Fig.A4 Juvenile stage of Sillago japonica

圖 A5 日本須鰨仔魚Fig.A5 Larvae stage of Paraplagusia japonica