棉花轉(zhuǎn)錄因子GhSPL1生物信息學(xué)分析*

楊笑敏，謝業(yè)濤，李永旗，孫亮慶

(江西省棉花研究所，江西 九江 332105)

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物和戰(zhàn)略儲備物資，棉纖維是紡織工業(yè)的基本原料。衣食住行穿衣居于首位，隨著人民生活水平的不斷提高，人民對紡織品的需求達到了發(fā)達國家水平[1]。我國作為14億的人口大國，擁有960萬平方千米國土，可耕地面積為124.8萬平方千米，其中棉花的耕種面積為4.9萬平方千米，主要分布在長江流域、黃河流域及新疆。近幾年，由于棉花高投入，低收益，農(nóng)民植棉積極性降低，內(nèi)地植棉面積大幅度少，國產(chǎn)棉花產(chǎn)量難以滿足人們對棉花產(chǎn)量的需求，棉花的供求出現(xiàn)失衡，矛盾日益突出[2-3]。棉花纖維的品質(zhì)，決定棉花的價格，決定農(nóng)民的收益。隨著棉花全基因組測序的完成[4-7]，挖掘功能基因，從分子層面提高棉花品質(zhì)，培育優(yōu)良品種已成為研究的熱點。

棉花品種布局、土壤和栽培技術(shù)等因素通過影響棉花生長發(fā)育而影響纖維品質(zhì)[8]。研究發(fā)現(xiàn)SPL在植物的整個生命周期中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與植株的形態(tài)建成[9]，調(diào)控植株發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變[10]，調(diào)控葉片發(fā)育[11]，促進植物開花[12-13]，參與果實的發(fā)育成熟過程[14-15]，應(yīng)答生物與非生物脅迫[16-17]，參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]多個生理生化過程。SPL1基因是SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)家族中的一員，編碼植物中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[19]。SPL蛋白具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[20]。SPL轉(zhuǎn)錄因子最早是在金魚草中鑒定出來的，隨后在擬南芥[21]、玉米[22-23]、水稻[24-25]、小麥[26]、蘋果[27]、番茄[28]等植物中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。植物間隔期的長短能夠反映其葉原基分化速率及其葉片形成的快慢。過表達AtSPL9和AtSPL10的擬南芥，葉片間隔期增加，葉片的生成速率降低，從而使植株整個生命周期中葉片總量減少，單個葉面積增加[29]，過表達AtSPL13的擬南芥幼苗，與對照相比第1片真葉的形成所用時間更長[30]。玉米沉默LG1會使葉片不能正常發(fā)育，形成異常的葉舌與葉耳[31]。過表達OsSPL14的水稻，分蘗數(shù)減少，增加花序分枝、穗粒數(shù)、千粒重，通過調(diào)控水稻的株型提高產(chǎn)量[32]。過表達AtSPL3擬南芥開花期提前，如果受到光照增強、光照時間增加，擬南芥的花和花序無法正常發(fā)育[33-34]。過表達LeSPL3載體轉(zhuǎn)化煙草后，會導(dǎo)致花柄離區(qū)離層細胞層數(shù)增加，花容易從植株上脫落[35]。過表達OsSPL16的水稻，與對照相比籽粒更寬，單粒種增加，籽粒更加飽滿充實；降低OsSPL16的水稻，籽粒寬降低，變得細長，胚乳透明度增加，水稻堊白度降低，稻米外觀明顯改變[36-37]。沉默AtSPL8的擬南芥植株，主要是對植株花和果實產(chǎn)生影響，會導(dǎo)致花藥變小，花粉量減少，果莢變短小，出現(xiàn)半不育表型[38-39]。

通過比較GhSPL1在棉花生長發(fā)育過程中的FKPM值，發(fā)現(xiàn)GhSPL1在棉花胚珠形成過程中的數(shù)值較高，具有較高的表達，本研究對GhSPL1進行了基因結(jié)構(gòu)分析，對GhSPL1進行了蛋白的親水性/疏水性分析、跨膜結(jié)構(gòu)分析、信號肽預(yù)測、亞細胞位置預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、同源建模，對物種之間的親緣關(guān)系進行分析，對棉花胚珠發(fā)育過程中的表達情況進行了分析，為進一步驗證GhSPL1的功能奠定了基礎(chǔ)。SPL參與調(diào)控棉花整個生長發(fā)育周期，但本課題沒有針對GhSPL1進行的深入研究和挖掘GhSPL1的功能，有特于以后進一步擴展。

1材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析

從cottonFGD中下載GhSPL1的基因序列、蛋白序列、基因組序列。在Cell-PLoc2.0中進行亞細胞定預(yù)測；GhSPL1的蛋白序列在ExPASY、ProtScale、TMHMM、SignalP4.0、GOR IV、SMART、Phyre2中進行生物信息學(xué)分析。

1.2進化分析

分別以GhSPL1的CDS序列和氨基酸序列為目標序列，在cottonFGD網(wǎng)站用Blastn比對檢索，獲得海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉三個棉種的同源序列，在Phytozome用Blastp比對檢索，得到柏樹、楊樹、可可、茄子、擬南芥、玉米、水稻、炭蘚中的同源序列，用SMART對比對獲得的基因進行基因結(jié)構(gòu)域進行分析，留下含有一個SBP結(jié)構(gòu)域，2個ANK結(jié)構(gòu)域，1個跨膜區(qū)域的基因。把最終得到的氨基酸序列輸入Clustal W 軟件進行多重序列比對，在MEGA7. 0 軟件中選擇 Neighbor-Join 法，設(shè)定Bootstrap的值為1000，構(gòu)建物種系統(tǒng)進化樹。

1.3表達分析

從Gossypium Resource And Network Database網(wǎng)站中的Expression Visualization中下載GhSPL1基因胚珠發(fā)育過程中的FPKM值(Fragments Per Kilobase Million)。

FRKM值越大，基因表達量越高，F(xiàn)RKM值越小，基因的轉(zhuǎn)錄水平越低。利用Excel工具得到基因表達柱形圖。

2結(jié)果與分析

2.1 GhSPL1蛋白生物信息學(xué)分析

本研究在cottonFGD(https://cottonfgd.org/profiles/gene)網(wǎng)站中獲得GhSPL1基因序列和其編碼的蛋白序列，GhSPL1基因位于D12染色體上的43027984～43035100處，基因長度為7117 bp，CDS長度為2964 bp。利用GSDS軟件(http://gsds.gao-lab.org/)對繪SPL1基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖1，GhSPL1基因含有10個外顯子。在Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)中對GhSPL1蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示GhSPL1蛋白在細胞核上。

圖1 GhSPL1基因的結(jié)構(gòu)分析

在ExPASY網(wǎng)站ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)程序中對GhSPL1基因編碼的蛋白質(zhì)進行蛋白組分分析，結(jié)果顯示GhSPL1基因編碼987個氨基酸分子，其中精氨酸(arg)和賴氨酸(lys)是帶正電的氨基酸殘基有113個，天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)是帶負電的氨基酸殘基有129個。

GhSPL1蛋白的相對分子質(zhì)量是109667.79 kDa，預(yù)測的等電點(PI)是6.02，GhSPL1蛋白的分子式是C4783H7564N1380O1487S46，GhSPL1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是49.67，脂肪系數(shù)為81.80，總平均親水性是-0.425，預(yù)測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

利用在線網(wǎng)站ProtScale(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測了GhSPL1蛋白的親疏水性，將GhSPL1的蛋白序列輸入ProtScale，選擇默認的Hphob. / Kyte & Doolittle，滑窗大小為9，線性加權(quán)模型，預(yù)測結(jié)果如圖2，結(jié)果表明：第227位精氨酸(R)的所測分值最低為-3.578，則S親水性最強，第960位纈氨酸(V)的所測分值最高為3.311，則F疏水性最強，GhSPL1蛋白序列中親水性氨基酸的總分大于疏水性氨基酸的總分，該蛋白為親水性蛋白。綜上所述，GhSPL1蛋白是一種親水性的不穩(wěn)定蛋白。

圖2 GhSPL1蛋白的親水性/疏水性分析

通過在線網(wǎng)站TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對GhSPL1進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析(圖3)，結(jié)果表明：1～964的氨基酸位于細胞膜外部，942～964的氨基酸為跨膜區(qū)，965～987的氨基酸位于細胞膜內(nèi)部，該蛋白存在跨膜區(qū)域，屬于跨膜蛋白。

圖3 GhSPL1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用SignalP4.0網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP-4.0/)預(yù)測GhSPL1蛋白的信號肽，結(jié)果如圖4所示：信號肽區(qū)域處，S值較高，GhSPL1蛋白的S值變化相對比較平穩(wěn)，波動不大，在第1個蛋氨酸(Met)處是最大值，分值為0.168；GhSPL1蛋白的C值(剪切位點值)在第54位天冬氨酸(Asp)處是最大值，為0.453，GhSPL1蛋白的Y值(綜合剪切位點值)在第54位天冬氨酸(Asp)處是最大值，為0.212，D值為0.155。綜上所述，GhSPL1不是分泌蛋白。

圖4 GhSPL1蛋白的信號肽預(yù)測

利用GOR IV軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)對GhSPL1的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α螺旋、延伸連構(gòu)成，其中α螺旋有297個氨基酸，占30.09%；延伸連有148個氨基酸，占14.99%；無規(guī)則卷曲有542個氨基酸，占54.91%。

圖5 GhSPL1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對GhSPL1蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)構(gòu)如圖6：該蛋白從156位氨基酸開始到230為氨基酸結(jié)束，編碼植物蛋白中發(fā)現(xiàn)的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBP，該結(jié)構(gòu)域含有2個鋅指結(jié)構(gòu)；從754位氨基酸開始到783位氨基酸，811位氨基酸到841位氨基酸，編碼兩個錨蛋白重復(fù)序列區(qū)域，即ANK結(jié)構(gòu)域；從942位氨基酸開始到964為氨基酸是TMHMM程序檢測到的跨膜螺旋區(qū)域。

利用軟件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2)對GhSPL1蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行建模，結(jié)果如圖7所示，GhSPL1蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α螺旋構(gòu)成，預(yù)測分析結(jié)果與GhSPL1蛋白二級分析結(jié)果一致。

圖7 GhSPL1蛋白的三維建模

2.2系統(tǒng)進化分析

在cottonFGD網(wǎng)站中用Blastn程序檢索，獲得海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉的同源序列，在Phytozome在Blastp程序中檢索，獲得柏樹、楊樹、可可、茄子、擬南芥、玉米、水稻、炭蘚的同源序列，用軟件SMART工具分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，篩選出于GhSPL1基因所含有的結(jié)構(gòu)域相同的基因序列，共獲得25個基因，其中海島棉有5個基因，亞洲棉有2個基因，雷蒙德氏棉有2個基因，柏樹有2個基因、楊樹有3個基因、可可有2個基因、茄子有1個基因、擬南芥有2個基因、玉米有2個基因、水稻有1個基因、炭蘚有3個基因。通過MEGA7.0構(gòu)建進化樹如圖8所示：可可的基因與棉花中的基因在同一個分支上，所以可可與棉花的親緣關(guān)系較近，該基因在水稻、玉米、茄子等中都含有該類型的基因，所以基因出現(xiàn)在單子葉植物和雙子葉植物分化之前。

圖8 GhSPL1蛋白的三維建模

2.3基因表達分析

從網(wǎng)站Gossypium Resource And Network Database(http://grand.cricaas.com.cn/home)下載GhSPL1基因在胚珠發(fā)育過程中的FPKM值，該值可以代表基因的表達情況。如圖9所示：GhSPL1基因在整個胚珠形成過程都有較高的表達，在胚珠形成的第20天有較高的表達，在第25天表達量較低。

3討論與結(jié)論

SPL是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、次生代謝、響應(yīng)生物與非生物脅迫。GhSPL1作為SPL家族中的一個成員，含有一個在進化上高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域是DNA結(jié)合區(qū)域。本研究在海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉、柏樹、楊樹、可可、茄子、擬南芥、玉米、水稻、炭蘚中鑒定出GhSPL1的同源基因，但是由于很多的物種基因測序工作還沒有開展，所以GhSPL1基因的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、進化機制、生物學(xué)功能還不明確，有待進一步研究。

花是植物的繁殖器官，開花是植物營養(yǎng)生長與生殖生長的分水嶺，開花受到光照、溫度、植物激素、生物脅迫、非生物脅迫及自身內(nèi)部情況等多種因素的影響。棉花開花的已知途徑有光周期誘導(dǎo)途徑，春花途徑，赤霉素途徑，自主途徑，GhSPL1在棉花胚珠發(fā)育過程中有較高的表達，由于GhSPL1在植株的開花過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，猜測GhSPL1可能參與棉花開花誘導(dǎo)過程，但是其具體作用機制還不清楚，仍需進一步驗證挖掘GhSPL1的基因功能。