生物被膜形成對(duì)豬源沙門氏菌耐藥性和毒力的影響

唐正露，陳傳榮，姚 明，羅聰玉，張 麗，李 郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036)

沙門氏菌(Salmonella)為一種屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性桿菌，存在于溫血?jiǎng)游锘蚶溲獎(jiǎng)游锏哪c道內(nèi)，幾乎具備了一切使其廣泛分布所需要的特性，包括廣泛的動(dòng)物與人宿主、帶菌動(dòng)物與人的糞便排泄物、對(duì)自然環(huán)境的抵抗力及有效利用傳播介質(zhì)(食品、飼料、污染物、運(yùn)輸工具等)，很容易造成在動(dòng)物與動(dòng)物、動(dòng)物與人之間的傳播。如豬的沙門氏菌感染，一是能引起臨床疾病，包括急性敗血癥和慢性胃腸炎等，二是可成為許多豬肉產(chǎn)品的污染源，威脅人類健康。故沙門氏菌不僅是一種重要的人畜共患病原菌，也是眾多國(guó)家引起食源性疾病的首要病原，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生方面均具有重要意義。

細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是細(xì)菌群體被自身胞外多聚物包裹，不可逆地附著于接觸表面而形成的有組織的膜狀物質(zhì)，這是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境有利于生存的一種生命現(xiàn)象。細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性目前已成為全球的醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)及社會(huì)關(guān)注的問(wèn)題，而BF是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要方面。研究表明幾乎所有的細(xì)菌在一定條件下都可以形成BF[1]。BF一旦形成，就會(huì)對(duì)抗生素的殺菌作用和宿主免疫清除作用的抵抗力增強(qiáng)。此外，BF作為細(xì)菌的毒力因子，可參與細(xì)菌侵襲宿主的過(guò)程，在細(xì)菌致病中發(fā)揮作用。近年來(lái)，有關(guān)BF與抗生素及致病性的研究多見(jiàn)于葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌等，針對(duì)沙門氏菌的則較為少見(jiàn)。

為了解BF形成對(duì)沙門氏菌的耐藥性及毒力的影響，本研究采用96孔微量板法、紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)、微量稀釋法和寇氏改良法，對(duì)來(lái)源自腹瀉仔豬的69株沙門氏菌分離株進(jìn)行成膜能力、23種抗菌藥物敏感性、最小抑菌濃度(MIC)及對(duì)小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定，旨在為防治沙門氏菌感染或沙門氏菌病提供臨床參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 69株分離自腹瀉病仔豬的沙門氏菌，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室分離、鑒定和保存(信息見(jiàn)表1)。質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品。

表1 69株受試沙門氏菌分離株信息

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只體重為18 g～22 g清潔級(jí)雌性昆明小鼠，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 藥敏紙片 氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、四環(huán)素(TET)、強(qiáng)力霉素(DOX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢哌酮(CFP)、慶大霉素(GM)、阿米卡星(AN)、甲氧芐啶(TMP)、復(fù)方新諾明(SXT)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、呋喃妥因(FT)、氟苯尼考(FFC)、左氧氟沙星(LVX)、妥布霉素(TM)、加替沙星(GAT)、氨芐西林-舒巴坦(SAM)、氨曲南(AZT)、頭孢吡肟(FEP)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP)、亞胺培南(IPM)、頭孢拉定(RAD)藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要培養(yǎng)基和試劑 水解酪蛋白瓊脂(MHA)、水解酪蛋白肉湯(MHB)、牛肉膏(Beef Extract)、蛋白胨(Peptone)、瓊脂粉(Agar powder)、緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液 (TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽 (XLD)、腸道菌增菌肉湯(EE)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三塘鐵瓊脂(TSI)、胰酪 胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB)、V-P試劑、Kovac試劑、枸櫞酸鹽生化管，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 高速冷凍離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，TECAN公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌成膜能力測(cè)定 采用96孔微量板法[2]。將69株受試沙門氏菌分別接種至LB培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100稀釋至LB培養(yǎng)基中，吸取200 μL稀釋菌液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃靜置培養(yǎng)36 h，棄上清液，加甲醇固定20 min后倒掉，PBS洗滌3次，加10 g/L結(jié)晶紫200 μL/孔進(jìn)行染色，5 min后自來(lái)水沖洗并拍干，330 mL/L冰醋酸作用0.5 h，測(cè)定OD570 nm值。成膜能力判定標(biāo)準(zhǔn)[3]：以陰性對(duì)照OD570 nm平均值加其3倍標(biāo)準(zhǔn)差SD定義為ODc，將待測(cè)菌株OD與ODc比較，若OD4ODc，強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.2.2 沙門氏菌體外成膜生長(zhǎng)曲線測(cè)定 選擇成膜能力不同的8株沙門氏菌，編號(hào)分別為2、45、47(3+)，23、57、68(1+)，55、66(-)，依照1.2.1分別測(cè)定其在6、12、24、36、48、60、72 h的OD570 nm值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD570 nm值為縱坐標(biāo)，繪制體外成膜生長(zhǎng)曲線。每株菌重復(fù)測(cè)定2次。

1.2.3 沙門氏菌藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(KB法)測(cè)定69株沙門氏菌對(duì)23種抗菌藥物的感受性。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI/NCCLS)2015版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.4 沙門氏菌成膜菌與浮游菌最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 選擇3株成膜能力強(qiáng)陽(yáng)性(3+)沙門氏菌，編號(hào)為2、45、47，參考文獻(xiàn)[4]方法制備成膜菌和浮游菌，采用微量稀釋法測(cè)定兩者的MIC。

1.2.5 沙門氏菌成膜菌在不同時(shí)間點(diǎn)的MIC測(cè)定 按照1.2.4分別測(cè)定編號(hào)為2、45、47沙門氏菌在成膜6、12、24、36、48、60、72 h時(shí)的MIC。

1.2.6 沙門氏菌半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定 采用平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定1.5中的8株沙門氏菌在0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h時(shí)的活菌數(shù)(CFU/mL)，每株菌重復(fù)2次，繪制生長(zhǎng)曲線，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期與穩(wěn)定期之間細(xì)菌，采用寇氏改良法進(jìn)行小鼠攻毒試驗(yàn)，測(cè)定LD50。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步處理，再用SAS 9.0軟件進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌成膜能力測(cè)定結(jié)果

在69株受試沙門氏菌中有64株形成生物膜(成膜菌)，成膜陽(yáng)性率為92.8%。其中成膜能力強(qiáng)陽(yáng)性(3+)10株，占比15.6%；中等陽(yáng)性(2+)0株；弱陽(yáng)性(1+)54株，占比84.4%。以(1+)為主。

2.2 沙門氏菌體外成膜生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

在成膜能力不同的8株受試沙門氏菌中，成膜能力最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)除2號(hào)菌為24 h外，其余均為36 h(圖1)。

圖1 8株受試沙門氏菌體外成膜生長(zhǎng)曲線

2.3 沙門氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在69株受試沙門氏菌中，5株未成膜菌對(duì)23種抗菌藥物的敏感率均為100%，而64株成膜菌對(duì)CRO、CFP、AZT、FEP、TZP和IPM 6種抗菌藥物的敏感率為100%，對(duì)TET、DOX的耐藥率最高，分別為76.6%(49/64)和75.0%(48/64)，成膜能力只與TET、DOX的耐藥性呈正相關(guān)(P<0.05)(表2)。在64株成膜菌中有10株對(duì)7種及其以上的抗菌藥物同時(shí)耐藥，多重耐藥率為15.6%，其中耐抗生素7種1株、8種3株、9種2株、10種1株、11種3株；10株多重耐藥菌共呈現(xiàn)9種多重耐藥譜，耐藥模式70%為TET-DOX-AMX-AMP-TMP-SXT-FFC(表3)。

表2 69株受試沙門氏菌對(duì)23種抗菌藥物的耐藥率

表3 10株多重耐藥沙門氏菌的耐藥譜測(cè)定結(jié)果

2.4 沙門氏菌成膜菌與浮游菌MIC測(cè)定結(jié)果

根據(jù)沙門氏菌藥敏試驗(yàn)和成膜能力測(cè)定結(jié)果，選擇CIP、FFC、DOX、RAD 4種抗菌藥物，對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性(3+)成膜菌2、45、47號(hào)進(jìn)行MIC測(cè)定。浮游菌對(duì)CIP的MIC分別為2 048、128、1 024 mg/L，成膜菌為>4 096 mg/L、2 048 mg/L、>4 096 mg/L；浮游菌對(duì)FFC的MIC分別為512、256、512 mg/L，成膜菌為4 096、2 048、4 096 mg/L，而兩者對(duì)DOX和RAD的MIC均>4 096 mg/L，其中成膜菌對(duì)CIP和FFC的MIC較對(duì)應(yīng)浮游菌分別提高2倍～16倍和2倍～8倍。

2.5 沙門氏菌成膜菌在不同時(shí)間點(diǎn)MIC測(cè)定結(jié)果

在強(qiáng)陽(yáng)性(3+)成膜菌2、45、47號(hào)中，2號(hào)成膜能力最強(qiáng)時(shí)間為24 h，此時(shí)對(duì)CIP和FFC的MIC均>4 096 mg/L，大于其他時(shí)間點(diǎn)的MIC。45號(hào)和47號(hào)成膜能力最強(qiáng)時(shí)間均為36 h，此時(shí)對(duì)CIP的MIC分別為2 048 mg/L(45號(hào))、>4 096 mg/L(47號(hào))，對(duì)FFC的MIC分別為2 048 mg/L(45號(hào))、4 096 mg/L(47號(hào))，均大于其他時(shí)間點(diǎn)的MIC。而對(duì)DOX和RAD，該3株受試菌在各時(shí)間點(diǎn)的MIC均大于4 096 mg/L(表4)。

表4 3株受試沙門氏菌在不同時(shí)間點(diǎn)的MIC

2.6 沙門氏菌LD50測(cè)定結(jié)果

在成膜能力不同的8株受試沙門氏菌中，強(qiáng)陽(yáng)性(3+)成膜菌對(duì)小鼠的LD50值最大，與弱陽(yáng)性(1+)成膜菌之間毒力差異顯著(P<0.05)；而弱陽(yáng)性(1+)成膜菌的LD50值與陰性(-)未成膜菌之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(表5)。

表5 8株受試沙門氏菌的LD50

3 討論

在自然界中，細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境常以形成BF的形式存在。BF的形成需經(jīng)物理、生物及化學(xué)等一系列過(guò)程，與多種外界環(huán)境因素的變化密切相關(guān)。Piras F等[5]發(fā)現(xiàn)40株屠宰生豬源沙門氏菌在22℃時(shí)成膜陽(yáng)性率為70.0%，(1+)為62.5%，(2+)為7.5%，而35℃時(shí)成膜陽(yáng)性率為22.5%，全部為(1+)。Manafi L等[6]檢測(cè)29株源自牛羊肉零售店的沙門氏菌，成膜總陽(yáng)性率100.0%，(2+)為24.1%，(3+)為75.9%；其中源自牛肉制品沙門氏菌的成膜陽(yáng)性率為48.3%，(2+)為85.7%，(3+)為14.3%，源自羊肉制品沙門氏菌的成膜陽(yáng)性率為34.5%，(2+)為80.0%，(3+)為20.0%，源自肉品接觸物表面沙門氏菌的成膜陽(yáng)性率為20.7%，(2+)為60.0%，(3+)為40.0%。蹇慧等[7]檢測(cè)了39株豬糞源沙門氏菌，成膜陽(yáng)性率為97.4%，(1+)為35.9%，(2+)為12.8%，(3+)為48.7%；20株豬肉源沙門氏菌，成膜陽(yáng)性率為40.0%，(1+)為30.0%，(2+)和(3+)均為5.0%。Nair A等[8]通過(guò)對(duì)源自臨床、食品、家禽和環(huán)境中40株沙門氏菌的檢測(cè)(成膜陽(yáng)性率為85.0%，(1+)為67.5%，(2+)為17.5%)，提出不同地理區(qū)域和不同來(lái)源之間沙門氏菌的成膜能力無(wú)明顯差異。本研究中，69株源自腹瀉病仔豬沙門氏菌成膜陽(yáng)性率為92.8%，(1+)為78.3%，(3+)為14.5%。綜上表明，沙門氏菌具有普遍的成膜能力，溫度、營(yíng)養(yǎng)等因素均可影響B(tài)F的形成。雖然沙門氏菌的BF形成與其來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性，但源自糞便的沙門氏菌成膜陽(yáng)性率高于其他來(lái)源菌，一方面可能由于沙門氏菌在pH6.0左右的環(huán)境中最易形成BF，而仔豬腸道的pH在5.0～6.0之間有利于BF的形成，另一方面糞便中富含N、P等無(wú)機(jī)元素以及可能存在殘留的抗生素，這些均可促進(jìn)沙門氏菌BF的形成，同時(shí)有助于沙門氏菌BF形成的curli基因能在糞便中被激活。此外，不同來(lái)源沙門氏菌的成膜能力是否主要以(1+)為主，則有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

細(xì)菌一旦形成BF后會(huì)減低對(duì)抗生素的敏感性約100倍～1 000倍，主要基于BF具有阻礙抗生素?cái)U(kuò)散的屏障作用、減弱膜內(nèi)細(xì)菌與抗生素反應(yīng)的限制作用、利于耐藥相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)作用等[9-11]。曾婷等[12]檢測(cè)32株鮑曼不動(dòng)桿菌的藥物感受性，成膜菌對(duì)GM的耐藥率較浮游菌顯著升高(P<0.05)。Gnanadha D P等[13]利用沖擊波將成膜沙門氏菌轉(zhuǎn)變?yōu)楦∮尉?，后者?duì)CIP的MIC下降了100倍～1 000倍。Ju X等[14]在比對(duì)都柏林沙門氏菌對(duì)ERY、ROX、CST、PMB、STR、KAN等25種抗生素的MIC和MBC時(shí)發(fā)現(xiàn)，成膜菌較浮游菌的耐藥性顯著提高了約30 000倍。在本研究的69株沙門氏菌中，5株未成膜菌對(duì)23種抗生素均100%敏感，64株成膜菌則只對(duì)6種抗生素100%敏感，對(duì)TET、DOX耐藥率高達(dá)75.0%，且成膜能力與對(duì)TET和DOX的耐藥性呈正相關(guān)(P<0.05)。雖然64株成膜菌的多重耐藥率不甚高(15.6%)，但其耐藥范圍廣(至少耐7種抗生素)，耐藥譜復(fù)雜(呈現(xiàn)9種多重耐藥模式)。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，成膜菌對(duì)CIP和FFC的MIC較浮游菌分別提高了2倍～16倍和2倍～8倍。由此進(jìn)一步表明，細(xì)菌形成BF后會(huì)降低對(duì)抗生素的敏感性，進(jìn)而由于細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)給臨床藥效提出了挑戰(zhàn)。

目前，在人類的細(xì)菌感染中，約80%源自BF細(xì)菌，BF可作為細(xì)菌的毒力因子在致病性上發(fā)揮作用。然而，在細(xì)菌的致病過(guò)程中，BF可利用細(xì)菌的黏附結(jié)構(gòu)增強(qiáng)自身的黏附性、抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的表達(dá)而減弱細(xì)菌侵襲力、逃避宿主免疫反應(yīng)使細(xì)菌大量增殖、引致細(xì)菌結(jié)構(gòu)變異和某些毒力因子缺失或表達(dá)減弱等方式，影響成膜菌的毒力[15]。Daniela C等[16]研究結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌最弱毒力株的成膜能力是最強(qiáng)毒力株的1.67倍。譚芳等[4]通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)QS相關(guān)基因rhlI、rhlR、rhlA、lasI、lasR、pqsA、pqsR在成膜菌中的表達(dá)量較浮游菌均顯著增高。邱瀟[17]探究了生物膜QS對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子的調(diào)控作用，結(jié)果顯示群感效應(yīng)抑制劑香草醛能有效抑制綠膿菌素的產(chǎn)生，同時(shí)香草醛還能通過(guò)抑制motA基因的表達(dá)抑制細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的泳動(dòng)能力。本研究中利用常規(guī)評(píng)價(jià)細(xì)菌毒力的LD50測(cè)定方法，比較了8株成膜能力不同的沙門氏菌，結(jié)果顯示成膜能力越強(qiáng)，LD50值越大，從理論上講該成膜菌毒力越弱。究其原因，細(xì)菌形成BF后阻礙了毒力因子的釋放并對(duì)宿主的免疫反應(yīng)產(chǎn)生抵抗，從而導(dǎo)致細(xì)菌的毒力減弱，LD50值增大。因此，將后續(xù)進(jìn)行豬源沙門氏菌BF形成對(duì)相關(guān)毒力基因表達(dá)的影響研究。

盡管眾多研究結(jié)果表明BF形成后增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，而對(duì)細(xì)菌毒力的影響作用則呈現(xiàn)增強(qiáng)、減弱或未產(chǎn)生，這可能與細(xì)菌種類、耐藥機(jī)制、毒力因子表達(dá)等不同有關(guān)[4,18]。然而，臨床上許多慢性和難治性細(xì)菌感染與BF相關(guān)聯(lián)。成膜菌侵染宿主時(shí)，BF作為抗原可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性抗體，但由于BF的特殊結(jié)構(gòu)，阻止了特異性抗體滲透以作用于膜內(nèi)細(xì)菌，抗體則與BF表面的可溶性抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，并沉積在感染病灶周圍，吸引大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并釋放蛋白水解酶，從而引起宿主嚴(yán)重的免疫損害、久治不愈，造成持續(xù)性感染，甚至終生帶毒[19]。