骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合柴胡疏肝丸對(duì)大鼠急性肝損傷的作用研究

鄭佳琳，饒子亮，黃小紅，武 昕，黃小瓊，許惠英，鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東佛山 528248）

目前，急性肝損傷在諸多急性臨床病例中屢見(jiàn)不鮮，且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。柴胡疏肝丸主要用于治療肝氣郁滯證，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞療法在肝臟疾病治療領(lǐng)域中占據(jù)了非常重要的位置。因此，本課題研究急性肝損傷藥物四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型，以MSCs 聯(lián)合柴胡疏肝丸對(duì)急性肝損傷進(jìn)行治療，觀察是否具有改善大鼠肝功能的作用，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，100只，體重200～250 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（粵）2018-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK（粵）2018-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：5 只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20℃～26℃，40%～70%，采用10 h:14 h 晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。自由進(jìn)食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

柴胡舒肝丸、四氯化碳（CCl4）、EA3001 系列電子天平、7020 型全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

體外大量培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行給藥治療。

1.4 動(dòng)物造模

將檢疫合格的100 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠按照體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、柴胡疏肝丸組、MSCs 組、聯(lián)合用藥組，每組20 只。除空白對(duì)照組外，其余大鼠以 2 mL/kg 劑量腹腔注射CCl4溶液（CCl4按1:1 比例與橄欖油混合配制成CCl4溶液）1 次，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生急性肝損傷。

1.5 動(dòng)物給藥

造模后次日，MSCs 和聯(lián)合用藥組大鼠一次性尾靜脈注射1.0×107個(gè)/ml 的MSCs；柴胡疏肝丸組和聯(lián)合用藥組大鼠灌胃給予70 g/kg 柴胡疏肝丸，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等量純凈水，每天1 次，連續(xù)給藥7 d。

1.6 肝功能檢測(cè)

開(kāi)始治療后的第1 天、第2 天、第3 天和第7 天，各組隨機(jī)選取5 只大鼠，稱(chēng)重，CO2處死，采血分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肝功能指標(biāo)，即谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）；收集肝臟組織并稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用（±s）表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后大鼠肝指數(shù)變化

結(jié)果顯示，對(duì)模型對(duì)照組大鼠注射CCl4后，模型對(duì)照組大鼠肝指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。柴胡疏肝丸組、MSCs組和聯(lián)合用藥組大鼠肝指數(shù)在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均低于模型對(duì)照組。聯(lián)合用藥組大鼠肝指數(shù)顯著低于模型對(duì)照組（P ＜0.05）。聯(lián)合用藥組肝指數(shù)與柴胡疏肝丸組、MSCs 組比較均有所降低，說(shuō)明MSCs、柴胡疏肝丸對(duì)肝臟重量指數(shù)均起到緩解作用；聯(lián)合治療效果優(yōu)于MSCs 和柴胡疏肝丸單獨(dú)治療的效果。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組肝指數(shù)都有所回落（表1）。

表1 治療后的大鼠肝指數(shù)結(jié)果（±s，%，n=5，♂）

表1 治療后的大鼠肝指數(shù)結(jié)果（±s，%，n=5，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對(duì)照組3.87±0.233.94±0.16 3.87±0.213.88±0.12模型對(duì)照組5.53±0.26*5.41±0.14*5.34±0.21*4.47±0.25*柴胡疏肝丸組5.49±0.28* 5.18±0.26*5.01±0.31* 4.04±0.25△MSCs組5.38±0.21*5.10±0.23*△ 5.07±0.24*3.97±0.22△聯(lián)合用藥組5.21±0.13*△4.74±0.17*△4.52±0.27*△3.92±0.12△

2.2 治療后大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）濃度變化

結(jié)果顯示，在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型對(duì)照組 ALT濃度明顯高于空白對(duì)照組（P ＜0.05），柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯(lián)合用藥組 ALT 濃度明顯低于模型對(duì)照組（P ＜0.05）。在 d7 時(shí)，聯(lián)合用藥組ALT 濃度與空白對(duì)照組基本持平，差異不顯著（P＞0.05），肝功能恢復(fù)較好（表2）。

表2 治療后的大鼠肝ALT 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

表2 治療后的大鼠肝ALT 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對(duì)照組27±529±2 28±528±5模型對(duì)照組377±16*253±13*68±7*57±6*柴胡疏肝丸組352±10*△216±9*△46±6*△39±4*△MSCs組333±15*△195±14*△ 50±9*△38±7*△聯(lián)合用藥組252±16*△161±11*△45±8*△32±5△

2.3 治療后大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）濃度變化

結(jié)果顯示，在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型對(duì)照組 AST濃度明顯高于空白對(duì)照組（P ＜0.05）；除了d1柴胡疏肝丸組與模型對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余時(shí)間點(diǎn)，柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯(lián)合用藥組 AST 濃度明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。在d7 時(shí)，聯(lián)合用藥組AST 濃度與空白對(duì)照組基本持平，差異不顯著（P ＞0.05），肝功能恢復(fù)較好（表3）。

表3 治療后大鼠肝AST 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

表3 治療后大鼠肝AST 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對(duì)照組120±12125±10 123±16122±13模型對(duì)照組297±11*232±21*204±18*180±13*柴胡疏肝丸組286±10* 211±7*△179±12*△161±11*△MSCs組244±19*△195±14*△ 172±15*△157±15*△聯(lián)合用藥組194±12*△146±14*△144±9*△136±14△

3 討論

MSCs 是存在于骨髓中具有自我增值和自我更新能力的一種成體干細(xì)胞，具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴(kuò)增，是肝細(xì)胞重要的肝外來(lái)源[1]。在細(xì)胞治療、基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)證實(shí)，MSCs 對(duì)急性肝損傷的修復(fù)作用，已經(jīng)得到了干細(xì)胞領(lǐng)域和肝病學(xué)領(lǐng)域的公認(rèn)[2]。

急性肝損傷是多因素參與的一個(gè)復(fù)雜病理過(guò)程，病變過(guò)程中多種酶、自由基以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)均發(fā)生著較大的變化，其中氧自由基對(duì)肝細(xì)胞DNA 結(jié)構(gòu)及其他代謝過(guò)程有較大的影響，從而成為了急性肝損傷的重要致病因素[3]。

柴胡疏肝丸中的柴胡能疏肝氣、養(yǎng)肝陰，具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，對(duì)保護(hù)肝細(xì)胞和恢復(fù)肝臟某些功能有一定的作用，白芍養(yǎng)肝柔肝，對(duì)氧自由基有清除作用[4]。這一生物學(xué)特性，使柴胡疏肝丸具有了緩解急性肝損傷病程，抑制肝損傷程度，從而具有了治療急性肝損傷的應(yīng)用潛能。

綜上所述，MSCs 聯(lián)合柴胡疏肝丸對(duì)大鼠急性肝損傷進(jìn)行治療，在修復(fù)肝臟組織和抑制損害程度方面實(shí)現(xiàn)對(duì)受損肝臟組織的修復(fù)和治療，呈現(xiàn)更加顯著的治療效果。