組學(xué)技術(shù)在木質(zhì)素降解酶系挖掘中的應(yīng)用進(jìn)展

李艷，陳復(fù)生，楊趁仙

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州， 450001)

當(dāng)前，人們對化石燃料的過度需求和開發(fā)引起了許多問題，從能源短缺、環(huán)境污染再到不可持續(xù)性發(fā)展，因此，亟需尋找綠色、清潔、可再生能源作為替代[1]。生物質(zhì)資源是指利用環(huán)境中大氣、土壤、水等進(jìn)行光合作用而產(chǎn)生的可再生有機(jī)物質(zhì)，包括農(nóng)作物、樹木等植物及其廢棄物、畜禽糞便等有機(jī)廢棄物，例如草木、秸稈。生物質(zhì)中含有豐富的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)物[2]，是生產(chǎn)清潔能源的主要原料[3]。因此，生物質(zhì)資源將成為石油工業(yè)的重要替代品。我國作為農(nóng)業(yè)大國，糧食作物產(chǎn)量大，而農(nóng)業(yè)廢棄物(如秸稈)年產(chǎn)量高達(dá)7億t[4]。但目前，大部分秸稈廢棄物被就地焚燒，這不僅對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，同時(shí)也是生物質(zhì)資源的極大浪費(fèi)[5]。

在生物質(zhì)資源的利用過程中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素作為天然的物理屏障，將纖維素緊緊包裹，不利于纖維素的開發(fā)和利用，極大的降低纖維素生產(chǎn)能源的效率。近年來，學(xué)者們開始關(guān)注植物生物質(zhì)中木質(zhì)素的降解。目前，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解方法主要包括物理處理(機(jī)械粉碎，熱解等)、物理化學(xué)處理(二氧化碳爆炸，蒸汽爆炸等)、化學(xué)處理(臭氧分解，堿水解等)以及生物法處理(微生物、酶的降解)。但物理和化學(xué)法降解木質(zhì)纖維素通常需要昂貴的設(shè)備，消耗更多的能量甚至?xí)a(chǎn)生有毒有害的廢棄物。與此相比微生物介導(dǎo)的生物催化過程因其反應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡單，在降解木質(zhì)素方面具有較高的優(yōu)勢，為木質(zhì)素的利用提供了更具體有效的替代方法[6]。本文主要對木質(zhì)素降解酶系及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述，尤其總結(jié)了基于組學(xué)技術(shù)挖掘的木質(zhì)素降解酶，旨在全面深入的了解木質(zhì)素降解酶系，對生物質(zhì)資源的高效利用奠定基礎(chǔ)。

1 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

木質(zhì)纖維素是植物生物質(zhì)中細(xì)胞壁的主要成分，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、果膠等[7]。木質(zhì)素由復(fù)雜的芳烴組成，其單元結(jié)構(gòu)是愈創(chuàng)木基(G型)、對羥基苯基(H型)和丁香基(S型)，3種結(jié)構(gòu)單元通過不同的化學(xué)鍵相連構(gòu)成無規(guī)則的3維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難溶于水，不易降解。木質(zhì)素降解的意義在于：(1)木質(zhì)素包裹在纖維素和半纖維素的外部，降解木質(zhì)素可以增加纖維素和半纖維素的利用率，因此木質(zhì)素的有效解聚是打破木質(zhì)纖維素物理屏障對其進(jìn)行生物利用的關(guān)鍵過程[8]；(2)木質(zhì)素是生物圈中含量最豐富的芳香生物聚合物，降解后可用來生產(chǎn)香草酸等芳香族化合物類高附加值化學(xué)品[9]；(3)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中含有甲氧基、羰基、醇羥基等，使其具有抗菌、吸附、抗氧化等潛力，可用來生產(chǎn)木質(zhì)素基樹脂材料、木質(zhì)素基吸附材料。對木質(zhì)纖維素的生物降解進(jìn)行有效了解和控制，將減輕因秸稈焚燒或副產(chǎn)物丟棄造成的環(huán)境污染，同時(shí)木質(zhì)素也可作為生產(chǎn)可再生化合物和高級生物燃料的原料，以滿足對化石燃料衍生能源和材料日益增長的需求。

圖1 植物生物質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of plant biomass

2 木質(zhì)素降解酶系的研究

細(xì)菌、真菌和放線菌是自然界中能夠降解木質(zhì)纖維素的微生物[10]。在木質(zhì)素的降解中，真菌因其具有強(qiáng)大的木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)而起主要作用，例如可產(chǎn)生胞外木質(zhì)素降解酶的白腐菌[11]。與真菌相比，細(xì)菌因其生長快、結(jié)構(gòu)簡單、具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，分泌的酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)以及pH耐受范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，引起了越來越多研究者的注意[12]。除有氧環(huán)境外，木質(zhì)纖維素還被厭氧細(xì)菌降解和轉(zhuǎn)化。低氧濃度真菌降解木質(zhì)素具有抑制作用，但是細(xì)菌表現(xiàn)出對厭氧條件較強(qiáng)的適應(yīng)性，這也是細(xì)菌降解木質(zhì)素成為近年來研究熱點(diǎn)的原因之一[13]。

木質(zhì)素降解通常可以得到高產(chǎn)率的芳香族化合物，尤其是木質(zhì)素單體。木質(zhì)素解聚過程主要包括2個(gè)階段：天然木質(zhì)素的解聚和所得異質(zhì)芳烴的礦化，在不同的降解階段起主要作用的酶不同[14]。

2.1 木質(zhì)素解聚過程相關(guān)酶

木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(Mn-dependent peroxidase，MnP)和多功能過氧化物酶(versatile peroxidase，VP)在木質(zhì)素解聚過程中發(fā)揮著重要的作用[15]。3種木質(zhì)素分解過氧化物酶具有相當(dāng)高的序列同一性，并與二硫鍵和鈣離子共享相似的螺旋形折疊，以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整性。LiP具有高氧化還原電位，可氧化高達(dá)90%的木質(zhì)素非酚結(jié)構(gòu)。它還具有氧化多種芳香族化合物的能力，因此具有在木質(zhì)素酶促降解中的作用。除了非酚類底物的特征性氧化外，LiP還顯示出氧化多種酚類化合物的能力。此外，VP結(jié)合了MnP和LiP的催化特性，具有廣泛的木質(zhì)素分解能力。VP活性的多功能性可能歸因于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)。VP氧化高氧化還原電位化合物的能力與暴露的催化色氨酸有關(guān)，該色氨酸通過遠(yuǎn)端電子轉(zhuǎn)移至血紅素而在酶表面形成自由基[16]。MnP分子結(jié)構(gòu)與LiP相似，也是一種糖蛋白，大多數(shù)的白腐菌和土壤垃圾降解菌具有合成MnP的能力，MnP具有底物特異性，主要催化酚醛類的Cα—Cβ鍵裂解，Cα—H鍵氧化和烷基-芳基的C—C鍵裂解。MnP表現(xiàn)出對Mn2+的依賴，MnP催化通常是將Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+，高氧化活性的Mn3+可將大量的酚類底物氧化[17]。

與上述木質(zhì)素分解過氧化物酶不同，漆酶(laccase,Lac)是一種氧化酶，可以促進(jìn)木質(zhì)素分子的裂解，包括芳香環(huán)的打開，烷基-芳基的破壞和酚羥基的增加，完整的催化反應(yīng)是電子轉(zhuǎn)移氧化，涉及4個(gè)連續(xù)的單電子氧化[18]。一般而言，漆酶蛋白質(zhì)分子中均含有4個(gè)銅離子，分為3種不同類型：1個(gè)Ⅰ型銅，1個(gè)Ⅱ型銅，2個(gè)Ⅲ型銅[19-20]。漆酶氧化木質(zhì)素時(shí)首先從木質(zhì)素中提取1個(gè)電子，利用雙氧作為電子受體，導(dǎo)致底物分子產(chǎn)生自由基，產(chǎn)生的自由基不穩(wěn)定，并且會(huì)發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)，從而導(dǎo)致木質(zhì)素降解。產(chǎn)生的大量自由基經(jīng)歷非酶反應(yīng)[21]，最終，木質(zhì)素大分子解聚為單體，產(chǎn)生了大量的芳香族化合物，漆酶可以將其用作底物以繼續(xù)進(jìn)行酶促水解[22]。

在細(xì)菌中，最早被鑒定的木質(zhì)素降解酶是來自紅球菌RhodococcusjostiiRHA1的過氧化物酶DyPB[23]。DyP型過氧化物酶具有使染料脫色和氧化多種酚類底物的活性[24]。基于序列比對建立系統(tǒng)發(fā)育樹后，根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的同源性將DyPs分為ABCD 4個(gè)亞型，其中A～C型DyP主要在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，D型大多存在于真菌中。DyPs結(jié)構(gòu)通常表現(xiàn)出二聚體鐵氧還蛋白樣折疊，構(gòu)成具有由α-螺旋外圍連接的4個(gè)β鏈的反平行β-折疊[3, 25]。DyPs的特異性比較低，主要在酸性pH下具有活性，顯示出非常廣泛的底物分布，比如一些典型的過氧化物酶底物：ABTS、剛果紅；DyPs能夠降解不同的染料，尤其是一些不易降解的蒽醌染料；此外還能降解單酚化合物、β-胡蘿卜素，木質(zhì)素模型化合物[26-27]。YU等[28]從Saccharomonosporaviridis中克隆了編碼SviDyP的基因，在大腸桿菌中異源表達(dá)，然后純化，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，SviDyP屬于DyPs的A型，與來自A型的其他DyPs相比，純化的SviDyP具有顯著的廣泛底物特異性，SviDyP重組蛋白顯示出顯著的耐熱性和耐堿性，并且可以直接有效地降解木質(zhì)素。

2.2 木質(zhì)素礦化過程相關(guān)酶

木質(zhì)素解聚衍生的異質(zhì)低分子質(zhì)量芳烴的礦化作用主要受細(xì)菌的控制[14]。降解木質(zhì)素的細(xì)菌通常形成聚合體共同降解木質(zhì)素，Sphingobiumsp.SYK-6具有同化各種聯(lián)芳基的能力[29]，包括β-芳基醚，聯(lián)苯甲基以及單芳基如阿魏酸酯、香蘭素，在細(xì)菌分解代謝途徑中，各種芳香族化合物通過各種酶促反應(yīng)例如醚裂解、雙鍵裂解、側(cè)鏈裂解、脫羧和氧化作用分別轉(zhuǎn)移到香草醛、丁香酸酯和對羥基苯甲酸酯中，然后這些化合物都轉(zhuǎn)化為兒茶酚衍生物，芳環(huán)被裂解產(chǎn)物通過幾種不同的途徑進(jìn)入三羧酸循環(huán)[30-31]。

細(xì)菌β-醚酶系統(tǒng)可以降解木質(zhì)素中的β-芳基醚結(jié)構(gòu)(β-O-4)。β-醚酶家族首先在Sphingobiumsp.SYK-6中鑒定出來，該細(xì)菌具有降解含有β-O-4結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素二聚體的能力，并生成香草酸、丁香酸等中間體化合物[32]。Sphingobiumsp.SYK-6對木質(zhì)素中β-O-4鍵的降解包括：Cα脫氫酶(LigD、LigL、LigO、LigN)、醚酶(LigE、LigF、LigP)和谷胱甘肽裂解酶(LigG)。LigDFG系統(tǒng)催化以下反應(yīng)主要分為3步：(1)在NAD+存在下，LigD將底物中Cα的羥基氧化形成酮基，使木質(zhì)素底物由醇氧化為相應(yīng)的酮；(2)LigF通過還原型谷胱甘肽攻擊Cβ而破壞醚鍵；(3)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶LigG在另一種還原型谷胱甘肽的輔助下，從底物中釋放出氧化的二聚體谷胱甘肽和芳香族單體，生成最終產(chǎn)物。在β-芳基醚催化途徑中，需要多種Lig酶共同作用才能將木質(zhì)素中的β-醚鍵斷裂。其中，LigL、LigO、LigN和LigD作用相似，LigE、LigP也能催化與LigF相同的反應(yīng)。

芳香族裂解雙加氧酶代表一組細(xì)胞內(nèi)酶，主要將木質(zhì)素衍生的芳香族化合物解構(gòu)為線性形式，可以進(jìn)一步代謝為三羧酸循環(huán)中間體。因此，雙加氧酶被認(rèn)為是酶降解木質(zhì)素利用芳香族化合物作為碳源和能源的重要組成部分。兒茶酸雙加氧酶和兒茶酚雙加氧酶是最常見的催化雙氧依賴性環(huán)裂變的酶。

2.3 其他相關(guān)酶類

除Lip、MnP和漆酶以外，也有一些其他酶類與木質(zhì)素降解過程密切相關(guān)。芳醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase，AAO)是一種提供細(xì)胞外H2O2的酶，在酶促木質(zhì)素解聚，特別是在木質(zhì)素聚合物的氧化中起著重要作用。AAO底物可包括木質(zhì)素衍生的化合物和芳香族真菌代謝產(chǎn)物，還可減少木質(zhì)素降解過程中漆酶產(chǎn)生的苯氧基，防止木質(zhì)素在酶的作用下聚合[33]。AAO能夠?qū)⒎枷阕宕嫁D(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛，并提供細(xì)胞外H2O2來降解木質(zhì)素。在幾種降解木質(zhì)素的真菌中，從1株Trichodermareesei中檢測到了AAO活性[34]。RASHID等[35]從Sphingobacteriumsp.T2 鑒定出2種細(xì)胞外錳超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(MnSOD1和MnSOD2)，催化雙氧與活性氧超氧化物和過氧化物的相互轉(zhuǎn)化。它們以重組形式對有機(jī)溶劑木質(zhì)素的氧化均具有高活性，產(chǎn)生多種反應(yīng)產(chǎn)物，并且在存在雙氧而不是H2O2的情況下Sphingobacteriumsp.T2具有更高的木質(zhì)素氧化活性。

3 組學(xué)在木質(zhì)素生物降解酶系挖掘中的應(yīng)用

3.1 基因組學(xué)在木質(zhì)素降解過程中的應(yīng)用

基因組學(xué)是應(yīng)用DNA的重組、測序以及生物信息學(xué)的組裝對基因的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。全基因組測序可以將木質(zhì)素降解體系中含有的多種微生物進(jìn)行分析[36]。LIU等[37]通過PacBio測序技術(shù)對TrometestrogiiS0301基因組進(jìn)行了測序，并進(jìn)行高質(zhì)量注釋，確定T.trogiiS0301具有潛在的環(huán)境木質(zhì)素降解和適應(yīng)能力，為研究Trametes屬真菌對木質(zhì)素的降解提供有價(jià)值的基因組資源。KUMER等[38]對Pandoraeasp.ISTKB進(jìn)行基因組學(xué)分析揭示了負(fù)責(zé)木質(zhì)素降解和聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)合成的各種潛在基因的存在，確定了木質(zhì)素降解的主要途徑，包括芬頓反應(yīng)以及輔酶A介導(dǎo)的苯乙酸和苯甲酸酯的降解。RIYADI等[39]測定Streptomycessp.S6的基因組草圖顯示細(xì)菌過氧化物酶的存在(例如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和DyP型過氧化物酶)，并且可參與在木質(zhì)素的初始解聚階段，基因特征表明Streptomycessp.S6具有堿木素降解能力，同時(shí)可生產(chǎn)各種低分子質(zhì)量木質(zhì)素衍生的化合物，具有明顯的酶促活性(LiP、Lac和AAO)。宏基因組是將環(huán)境中的所有木質(zhì)素降解微生物的遺傳信息作為一個(gè)整體直接提取基因組，將基因組學(xué)原本對于單個(gè)木質(zhì)素降解微生物的研究擴(kuò)大到與環(huán)境的研究。MORAES等[40]進(jìn)行了LigMet的基因組組裝和整體功能注釋，從宏基因組數(shù)據(jù)集重建基因組草圖，在LigMet中鑒定出與木質(zhì)素降解代謝途徑相關(guān)的幾種微生物和酶，并且分析了木質(zhì)素降解和香蘭素生產(chǎn)所涉及的生物催化劑和途徑。ZHU等[41]使用PacBio RS II平臺(tái)通過SMRT方法獲得了ComamonasserinivoransSP-35的全基因組序列，鑒定出94個(gè)可能與木質(zhì)素降解和代謝有關(guān)的基因，并且發(fā)現(xiàn)可能與β-芳基醚的裂解有關(guān)的酶基因，預(yù)測了菌株C.serinivoransSP-35的芳香族中間代謝物的代謝途徑(表1)。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在木質(zhì)素降解過程的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用主要通過先提取能夠有效降解木質(zhì)纖維素的微生物樣品的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行高通量測序與生物信息學(xué)分析[42]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在堆肥、青貯、動(dòng)物瘤胃及腸道等環(huán)境微生物研究領(lǐng)域加以應(yīng)用。LIU等[37]從T.trogiiS0301菌絲體中提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)大量的CAZymes編碼基因顯示出下調(diào)趨勢，結(jié)合基因組與酶活分析探索木質(zhì)纖維素降解酶及其編碼基因?qū)δ举|(zhì)纖維素底物的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖耗盡的同時(shí)，木質(zhì)素降解酶與MnP、LiP，纖維素酶和木聚糖酶活性同時(shí)增加。吳小峰[43]以麝牛為試驗(yàn)動(dòng)物，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)去除rRNA的Ribozero RNA進(jìn)行高通量測序，研究真菌、原蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌等微生物的編碼基因表達(dá)以及對小黑麥秸稈中木質(zhì)纖維素的降解作用，探討了秋季麝牛瘤胃對小黑麥秸稈木質(zhì)纖維素的降解機(jī)制(表1)。

利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對木質(zhì)纖維素降解微生物代謝進(jìn)行研究，可以說明其基因是否表達(dá)以及表達(dá)量的多少，確定木質(zhì)纖維素降解微生物是否能產(chǎn)生所需的降解酶，填補(bǔ)了宏基因組學(xué)中僅能說明木質(zhì)纖維素降解微生物中是否存在產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶的基因，而不能對基因是否轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析的研究空間。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在木質(zhì)素降解過程的應(yīng)用

對木質(zhì)纖維素降解的傳統(tǒng)研究是先篩選出降解能力較強(qiáng)的菌株，再對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使相關(guān)基因過表達(dá)得到足量的目標(biāo)產(chǎn)物，最終有效降解木質(zhì)素，但這種方法無法全面了解和掌握木質(zhì)素降解過程的酶系組成以及變化情況。蛋白質(zhì)組學(xué)可以分析木質(zhì)素降解過程中的酶系組成和表達(dá)量，為全面深入地研究酶對木質(zhì)素的降解途徑和降解機(jī)制提供了新方法。

在木質(zhì)素降解方面可以利用生物質(zhì)譜分析及絕對定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantification，iTRAQ)找差異蛋白表達(dá)，并對其功能進(jìn)行分析，例如對細(xì)菌、真菌的分泌蛋白組進(jìn)行分析以確定木質(zhì)素降解過程中的相關(guān)酶類以及模型化合物。KUMER等[38]應(yīng)用無標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法來鑒定香草酸和堿木素的表達(dá)譜，利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了DyP型過氧化物酶、乙醇酸氧化酶、醛氧化酶、漆酶、雙加氧酶、谷胱甘肽依賴性醚酶、脫氫酶以及各種還原酶等功能活躍，確定它們在木質(zhì)素或芳香族化合物的降解中起重要作用。馮茜[44]采用同位素的相對和絕對定量技術(shù)探究AspergillusfumigatusG-13降解3種木質(zhì)素模型化合物的產(chǎn)酶規(guī)律，鑒定得到了41個(gè)參與木質(zhì)纖維素降解的酶，篩選出酶活表達(dá)差異最大的兩組進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確定差異蛋白主要富集于NADH-泛醌氧化還原酶、菌絲過氧化氫酶相關(guān)蛋白質(zhì)，且主要富集于碳源和能量、核苷酸代謝相關(guān)途徑。ADAV等[45]利用不同的天然木質(zhì)纖維素生物質(zhì)作為主要碳源，以基于相對和絕對定量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，以及高通量等壓標(biāo)記進(jìn)行纖維素水解蛋白、半纖維素水解蛋白、木質(zhì)素解聚氧化還原酶蛋白、肽酶和其他蛋白質(zhì)的鑒定和絕對定量的分析，以量化比較木質(zhì)纖維素分解蛋白及其可變的底物誘導(dǎo)的表達(dá)。RASHID等[35]對來自Sphingobacteriumsp.T2細(xì)胞外部分的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出2種細(xì)胞外錳超氧化物歧化酶，它們以重組形式對有機(jī)溶劑木質(zhì)素的氧化具有很高的活性，產(chǎn)生多種反應(yīng)產(chǎn)物，據(jù)此提出了錳超氧化物歧化酶與木質(zhì)素相互作用的2種可能假設(shè)(表1)。

表1 組學(xué)技術(shù)在研究木質(zhì)素降解酶中的進(jìn)展Table 1 Progress of omics technology in the study of lignin degrading enzymes

4 總結(jié)與展望

木質(zhì)纖維素通過酶的降解可以產(chǎn)生一系列芳香族化合物，能夠取代諸如多種石油基化合物高價(jià)值藥物和化妝品等貴重物品的新型平臺(tái)化學(xué)品。通過對木質(zhì)纖維素降解體系的研究，可以探索木質(zhì)素衍生芳香族化合物生產(chǎn)的新途徑及關(guān)鍵酶類，擴(kuò)大木質(zhì)素的應(yīng)用范圍，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物降解和發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。