QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腌臘肉中四種常用香料

李林竹，馬凱，楊昌彪，黃永橋，王媛媛，范金旭，陶光燦*

1(貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽，550014)2(貴州省檢驗(yàn)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽，550014)

腌臘肉制品是具有代表性的肉類菜肴，因其顏色、香氣、味道和獨(dú)特造型而具有一定的市場。風(fēng)味是一個(gè)重要的感官指標(biāo)，是影響消費(fèi)者購買的決定性因素之一[1]。近年來，一些不良商販為了賦予腌臘肉制品生動(dòng)的原滋味，加強(qiáng)其中的香味[2-4]，將食品增香劑如乙基麥芽酚、香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素等大量使用在腌臘肉制品生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域。經(jīng)歐盟專家委員會(huì)研究，大劑量食用香蘭素可導(dǎo)致頭痛、呼吸困難，甚至肝腎損傷；同時(shí)麥芽酚具有弱致突變活性和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的毒性作用[5]。腌臘肉作為傳統(tǒng)飲食佳品，長期食用這些人工合成的香料會(huì)對(duì)人體造成潛在性危害，且目前缺少相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此建立腌臘肉制品中香料的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，針對(duì)香料檢測(cè)的方法主要有電化學(xué)分析法[6]、比色法[7]、氣相色譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-12]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。電化學(xué)分析法特異性差、靈敏度低、定性能力較差；比色法操作比較繁雜，分析測(cè)得的結(jié)果往往偏高；液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可用于大多數(shù)香料的分析，具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。特別是超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-MS-MS，UPLC-MS/MS)，因其具有選擇性良好和檢測(cè)通量大等優(yōu)點(diǎn)，已成為痕量化合物分析的首選方法。張凱等[14]采用QuEChERS作為前處理技術(shù)，建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測(cè)羊肉中8種抗真菌藥的檢測(cè)方法；曲寶成等[15]采用UPLC-MS/MS作為檢測(cè)設(shè)備，建立植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢測(cè)方法。目前，針對(duì)當(dāng)前腌臘肉制品中香料物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)缺失，缺乏相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。QuEChERS萃取作為一種樣品前處理凈化方法，具有“快速、簡單、便宜、有效、穩(wěn)定、安全”的特點(diǎn)[16-18]，可用來分析畜禽肉類等物質(zhì)中的痕量物質(zhì)[19-20]。

本研究以腌臘肉為研究對(duì)象，采用QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立測(cè)定腌臘肉制品中4種香料的分析方法，并對(duì)前處理基質(zhì)效應(yīng)和建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。為腌臘肉制品香料的質(zhì)量控制提供一種更加快速、簡便的檢測(cè)方法，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌臘肉樣品購自貴陽市觀山湖區(qū)農(nóng)貿(mào)超市；甲醇、乙腈、乙酸乙酯(均為分析純)、無水硫酸鈉(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，德國默克公司；乙基麥芽酚、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；十八烷基鍵合硅膠C18吸附劑(粒徑40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)吸附劑(粒徑40～63 μm)，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6470超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；GM200刀式研磨粉碎儀，德國Retsch公司；LT2002電子天平，常熟市天量儀器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；L-550離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取乙基麥芽酚、香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素各10 mg(精確至0.1 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱避光保存6個(gè)月。臨用前用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品前處理

稱取均質(zhì)后的腌臘肉樣品2 g(精確到0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸乙腈溶液，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，于多管旋渦混合器中渦旋振蕩10 min，然后以4 500 r/min離心5 min。移取2 mL上清液于預(yù)先加有25 mg PSA吸附劑、25 mg C18吸附劑及500 mg無水硫酸鈉的離心管中，渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min離心5 min。取出上清液，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜，使用UPLC-MS/MS分析。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A:0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；流動(dòng)相B:乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min(10% B)，0.5～5 min(10%～40% B)，5～7 min(40%～45% B)，7～7.5 min(45%～90% B)，7.5～8.0 min(90% B)，8.0～8.5 min(90%～10% B)，8.5～10 min(10% B)。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI+)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；霧化器壓力45 psi；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速10 L/min；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理及圖表繪制

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的MassHunterB.07數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0、Microsoft Excel 2019和Origin 2018進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

研究采用超高效液相色譜，選取100 mm×1.8 μm的超高壓色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫，此色譜可承受更高的壓力，得出的峰形更好。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行了對(duì)比，分別比較了甲醇-水(體積比1∶1)、甲醇-甲酸(體積比999∶1)水溶液、乙腈-水(體積比1∶1)、乙腈-甲酸(體積比999∶1)水溶液的流動(dòng)相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-甲酸(體積比999∶1)水溶液為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的離子化效率較高，峰形較好，質(zhì)譜響應(yīng)最優(yōu)。另外，研究還對(duì)25、30、40、50 ℃不同柱溫進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值在40 ℃時(shí)最好，因此確立了最佳色譜條件。圖1是4種香料在此分析條件下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

圖1 四種香料的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of the four kinds spices

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

4種香料物質(zhì)在質(zhì)譜上有比較強(qiáng)的正離子響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)將質(zhì)量濃度為30 μg/L的乙基麥芽酚、香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素4種香料標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，分別得到其母離子，優(yōu)化其錐孔電壓。母離子通過碰撞氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析[21]，同時(shí)優(yōu)化錐孔電壓，對(duì)得到的母離子進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)較好且穩(wěn)定的2種碎片離子作為定性定量離子對(duì)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，本研究4種香料的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

乙腈、甲醇作為提取溶劑，其極性范圍寬，提取速度快，溶解作用強(qiáng)。乙酸乙酯的極性相對(duì)較弱，毒性較低。三者均是較為理想的提取溶劑。本研究針對(duì)腌臘肉樣品，分別比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、0.1%(體積分?jǐn)?shù)，后同)甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇和0.1%甲酸-乙酸乙酯6種提取溶劑對(duì)4種目標(biāo)化合物的提取效率。結(jié)果表明，乙酸乙酯對(duì)乙基麥芽酚和香蘭素的提取效率不理想，增加0.1%甲酸后，含0.1%甲酸的乙酸乙酯對(duì)這2種化合物的提取效率仍無明顯改善，可以看出，乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯在乙基麥芽酚中的平均回收率差異不顯著(P>0.05)，平均回收率均小于20%，在香蘭素中的平均回收率差異顯著(P<0.05)，平均回收率為49.07%、73.82%，但均小于80%。乙腈和0.1%甲酸-乙腈的提取效果明顯高于甲醇和0.1%甲酸-甲醇，在4種香料中，乙腈、0.1%甲酸-乙腈與甲醇、0.1%甲酸-甲醇的平均回收率相差大，差異均顯著，乙基麥芽酚(102.83%、105.51%、81.67%、83.65%，P<0.05)、香蘭素(113.56%、118.64%、49.80%、59.18%，P<0.05)、甲基香蘭素(107.70%、109.51%、63.72%、60.89%，P<0.05)、乙基香蘭素(90.66%、92.56%、79.86%、85.17%，P<0.05)，使用乙腈和0.1%甲酸-乙腈作為提取溶劑時(shí)，4種香料的平均回收率均大于90%，其中0.1%甲酸-乙腈的提取效率略高于乙腈(圖2)。故選取0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對(duì)腌臘肉樣品中4種香料回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of the four spices in cured meat samples(n=3)注：圖中不同字母表示不同香料間平均回收率差異顯著(P<0.05)(下同)

實(shí)驗(yàn)采用了渦旋振蕩器對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取。在此基礎(chǔ)上，對(duì)渦旋振蕩提取時(shí)間(5，10、15 min)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增加，提取效率也逐步提升，在10 min提取效率達(dá)到最佳，10 min之后基本趨于穩(wěn)定，故選取10 min作為最佳渦旋振蕩提取時(shí)間。

2.3.2 凈化方式的優(yōu)化

腌臘肉樣品中存在脂肪、色素、甾醇等雜質(zhì)，要達(dá)到既能有效除去腌臘肉中雜質(zhì)，又不會(huì)吸附目標(biāo)物的目的，關(guān)鍵是吸附劑的選擇。常見的QuEChERS 吸附材料有PSA、C18、石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)等[22-24]。為了選擇合適的吸附劑，研究對(duì)PSA、C18、PSA+C18及Oasis PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為500 μg/kg水平時(shí)，使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化，小柱內(nèi)填料基本把香蘭素目標(biāo)物吸附，平均回收率接近40%，可以看出，香蘭素和其他3種香料的平均回收率差異均顯著(P<0.05)。使用單種吸附劑PSA、C18凈化時(shí)，目標(biāo)物損失較少，4種香料的平均回收率都在70%以上。其中，乙基麥芽酚PSA、C18平均回收率差異比較顯著(P<0.05)，PSA的平均回收率高于C18；香蘭素PSA、C18平均回收率差異不顯著(P>0.05)，兩者回收率均大于70%；在甲基香蘭素和乙基香蘭素中PSA、C18平均回收率差異均顯著(P<0.05)。其中，凈化效果最好的是PSA+C18混合吸附劑，平均回收率更高(圖3)，PSA含有2個(gè)氨基，可有效吸附糖類、色素、脂肪酸和其他極性有機(jī)酸，C18含有十八烷基官能團(tuán)，屬于非極性吸附劑，可以吸附脂肪和一些礦物質(zhì)。PSA+C18混合吸附劑在4種香料中的平均回收率差異均顯著，平均回收率差異較大，乙基麥芽酚(82.48%、98.28%、118.85%、113.55%，P<0.05)、香蘭素(71.81%、72.68%、100.22%、36.50%，P<0.05)、甲基香蘭素(102.40%、97.75%、116.89%、110.90%，P<0.05)、乙基香蘭素(108.10%、102.85%、116.04%、104.83%，P<0.05)。因此，研究最終選用PSA+C18混合吸附劑作為樣品的凈化方式。

圖3 不同凈化方式對(duì)腌臘肉樣品中4種香料回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different purification methods on the recoveries of the four spices in cured meat samples(n=3)

研究進(jìn)一步對(duì)C18粉的用量(25、50、100 mg)和PSA吸附劑的用量(25、50、100 mg)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，使用25 mg C18粉和25 mg PSA吸附劑時(shí)，凈化效果最好，目標(biāo)物損失最少。同時(shí)對(duì)無水硫酸鈉的用量也進(jìn)行了考察，確定其使用量為500 mg。綜上，實(shí)驗(yàn)使用500 mg無水硫酸鈉、25 mg C18粉和25 mg PSA吸附劑作為樣品前處理方法。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算參考相關(guān)文獻(xiàn)[25-26]，即基質(zhì)效應(yīng)=A/B。實(shí)驗(yàn)用空白樣品提取液配制1 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，得出空白樣品基質(zhì)中4種香料的響應(yīng)值A(chǔ)；再用純?nèi)軇┡渲仆瑵舛人降幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液，得出純?nèi)軇┲?種香料相同濃度的響應(yīng)值B。若A/B>1，則表明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若A/B<1，則表明基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)A/B=1，則表明不存在基質(zhì)效應(yīng)。由表2可知，4種香料均存在著基質(zhì)效應(yīng)，香蘭素表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，乙基麥芽酚、甲基香蘭素和乙基香蘭素表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)?；诖?，為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配曲線對(duì)4種香料物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2.4.2 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行了方法學(xué)考察。配制4種香料的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/L，進(jìn)樣量5 μL，以MRM定量離子的峰面積(Y)對(duì)4種香料的質(zhì)量濃度(X，μg/L)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積相當(dāng)于基線噪音的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)計(jì)算樣品的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。結(jié)果表明，4種香料在0.50～50 μg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998，LOD為0.5～5.0 μg/kg，LOQ為2.0～15.0 μg/kg(表2)。

表2 腌臘肉中4種香料的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, R2, LODs, LOQs and matrix effects of the four spices in cured meat

2.5 回收率與精密度

向空白樣品中準(zhǔn)確加入4種香料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備加標(biāo)水平分別為5、10、50 μg/kg的樣品各6份，按1.4步驟對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并進(jìn)行LC-MS/MS分析，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和精密度。結(jié)果表明，腌臘肉樣品中4種香料的平均加標(biāo)回收率為82%～103%，精密度為1.6%～13.5%(表3)。

表3 三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率及精密度(n=6)Table 3 Average recoveries and repeatabilities at three spiked levels(n=6)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的方法對(duì)購自市場上的60份腌臘肉樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，其中，3批次樣品檢出乙基麥芽酚，含量分別為3.77、5.25、8.36 μg/kg，其余樣品均未檢出目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS凈化技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合，建立了一種簡便、快捷測(cè)定腌臘肉樣品中4種常用香料的分析方法。研究通過優(yōu)化QuEChERS方法的提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間和凈化材料，確立以0.1%甲酸-乙腈作為提取劑，渦旋振蕩作為提取方式，10 min作為樣品提取時(shí)間，以及500 mg無水硫酸鈉、25 mg C18粉和25 mg PSA吸附劑作為樣品凈化材料。結(jié)果表明，4種香料質(zhì)量濃度為0.50～50 μg/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限為0.5～5.0 μg/kg，在5、10、50 μg/kg這3個(gè)添加水平，目標(biāo)分析物的精密度均小于15%。該方法靈敏高效，回收率優(yōu)良，重復(fù)性好，適用于腌臘肉樣品中香料的檢測(cè)，同時(shí)可為此類化合物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支撐。