減壓處理對荔枝果實(shí)膜脂代謝和能量代謝的影響

李澤,黃和,鐘賽意,陳小麗,陳建平,任鵬康,劉海

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江，524088)

荔枝是我國盛產(chǎn)的名優(yōu)水果，屬于非呼吸躍變型果實(shí)，是最不耐貯藏的果品之一，荔枝在采摘后基本上每日一變：果皮色澤變褐、果實(shí)香味散失、果肉風(fēng)味變差、直到發(fā)生霉變。新鮮采摘后的荔枝果實(shí)極容易失水，雖然荔枝果肉中的水分含量很高，但是在沒有特定保濕冷凍貯藏環(huán)境下，果皮以及薄膜難以保持果肉中的水分，且果皮不斷失水衰老導(dǎo)致通透性增大，進(jìn)而引起荔枝果實(shí)的褐變和霉變[1]。蘋果切開后發(fā)生褐變的原因主要是由多酚類物質(zhì)引起的，而荔枝果皮中的紅色素降解再加上多酚類物質(zhì)的氧化催化作用，使荔枝果皮非常容易發(fā)生褐變。這種特性導(dǎo)致運(yùn)輸困難，嚴(yán)重制約我國荔枝產(chǎn)業(yè)健康和持續(xù)發(fā)展[2]。

呼吸作用是生物體重要生命活動標(biāo)志，荔枝果實(shí)在采摘后同樣進(jìn)行著必不可少的呼吸作用，利用各種呼吸代謝相關(guān)酶將復(fù)雜有機(jī)物分解為自身能利用的簡單有機(jī)物，同時釋放出能量。荔枝在呼吸代謝過程中用以維持自身生命活動的能量，主要由細(xì)胞中的線粒體產(chǎn)生。與此同時，活性氧也會被釋放出來?；钚匝趵鄯e后容易破壞細(xì)胞膜的通透性，對荔枝的老化有著加速的作用[3]。

目前國內(nèi)外現(xiàn)有的荔枝保鮮技術(shù)主要包括：熏硫技術(shù)、冷藏、涂膜處理和氣調(diào)貯藏，其中熏硫技術(shù)影響果實(shí)風(fēng)味且有殘留問題，對人體有害；氣調(diào)貯藏因使用高純度的惰性氣體，成本較高；因荔枝果皮不光滑，涂膜處理難以完全覆蓋，效果不顯著；冷藏保鮮效果最好，但當(dāng)荔枝轉(zhuǎn)入常溫貨架會迅速褐變，24 h即失去商品價值。

減壓處理是一項(xiàng)新興的物理保鮮技術(shù)，能夠形成低壓、低O2的貯藏環(huán)境，防止有害氣體的侵入，消除田間熱并抑制微生物生長繁殖，防止果實(shí)生理病害的出現(xiàn)[4]。研究表明，減壓處理能夠降低新疆白杏果實(shí)的軟化速率[5]；有效提高水蜜桃的抗氧化體系[6]；可使草莓的呼吸強(qiáng)度減弱，減少丙二醛含量[7]。目前，國內(nèi)外關(guān)于減壓處理技術(shù)在荔枝果實(shí)上的研究未見報道，本實(shí)驗(yàn)試圖通過研究不同減壓處理對采后荔枝果實(shí)在常溫貯藏期間細(xì)胞膜功能與膜脂代謝相關(guān)酶活性的影響，確定最佳貯藏壓力處理?xiàng)l件，初步探討荔枝果實(shí)能量代謝對膜完整性和功能的影響，以及果皮膜脂和能量代謝特性、膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，以揭示膜脂和能量代謝在膜劣變和果皮褐變中的作用，進(jìn)一步了解荔枝果實(shí)細(xì)胞膜功能完整性對荔枝保鮮的重要性。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的荔枝品種為‘妃子笑’，采自湛江市東坡荔枝園，采摘后馬上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，挑選出8成熟、色澤相同、大小均勻、無損傷病蟲害的荔枝果實(shí)，將挑選好的荔枝果實(shí)放入抽濾瓶內(nèi)，每個抽濾瓶裝30顆果實(shí)，利用真空泵進(jìn)行不同減壓處理，壓力分別設(shè)置為40、60和80 kPa，以常壓(101.325 kPa)下不經(jīng)任何處理的荔枝為對照，在常溫(25 ℃)貨架貯藏，進(jìn)行取樣分析，取樣天數(shù)分別為0，2，4，6 d，取樣后復(fù)壓，每組重復(fù)3次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果皮褐變指數(shù)的測定

果皮褐變程度評估參考林河通等[8]的方法。隨機(jī)選取30個荔枝果實(shí)計算褐變指數(shù)。褐變等級按0級：沒有褐變；1級：輕微褐變；2 級：褐變面積<25%；3級：褐變面積在25%～50%；4 級：褐變面積>50%來區(qū)分。褐變指數(shù)計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2 果皮霉變指數(shù)的測定

果皮霉變率計算根據(jù)JIANG等[9]的方法。隨機(jī)選取30個荔枝果實(shí)來計算霉變指數(shù)。霉變程度按0級：沒有霉變；1級：輕微霉變；2級：霉變面積<25%；3級：霉變面積在25%～50%；4級：霉變面積>50%進(jìn)行區(qū)分。霉變指數(shù)計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3 果皮細(xì)胞膜相對滲透率的測定

參考JIANG等[10]的方法。從每組中隨機(jī)取出30個荔枝果皮，打成30個直徑為10 mm的果皮圓片，蒸餾水洗凈濾掉水分，在0.3 mol/L甘露醇中放置30 min后測第1次電導(dǎo)率；將其煮沸冷后開始測第2次電導(dǎo)率。相對滲透率用前后2次之比來表示。

1.2.4 果皮細(xì)胞線粒體的提取

參照譚才鄧[11]的方法。隨機(jī)從30個荔枝果實(shí)中選取10 g果皮進(jìn)行液氮研磨，加入線粒體提取液[0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))半胱氨酸、1 mmol/L EDTA、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚乙烯吡咯烷酮、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白]的燒杯中，4 ℃靜置15 min后過濾，濾液在4 ℃下再次離心，待離心停止，收集沉淀，加入洗滌液[0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白、0.3 mol/L甘露醇]溶解，再經(jīng)過2次離心所得沉淀即為線粒體，懸浮于線粒體提取液中備用。

1.2.5 細(xì)胞膜流動性的測定

反應(yīng)體系(2 nmol/L含熒光偏振探針1, 6二苯基-1, 3, 5己三烯的四氫呋喃溶液，0.3 mol/L甘露醇，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液)，加入上述線粒體懸浮液，振蕩搖勻恒溫加熱20 min。以不加1,6二苯基-1,3,5己三烯(DPH)溶液作對照，在熒光分光光度計發(fā)射波長為432 nm，激發(fā)波長為362 nm下，測定熒光偏振值(P值)。P值越小，則流動性越大。

1.2.6 琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性的測定

參考ACKERLL等[12]和朱廣廉[13]的方法測定。反應(yīng)混合液2.7 mL(pH 7.4 琥珀酸鈉0.2 mol/L、pH 7.4 磷酸鉀緩沖液0.2 mol/L、0.9 mmol/L 2,6-二氯酚靛酚)，0.3 mL線粒體提取液；先量取適量反應(yīng)混合液置于37 ℃水浴鍋中，待水浴5 min后加入線粒體提取液，再加入0.3%甲硫酚嗪(5-methylphenazinium methosulfate，PMS)輕微振蕩搖勻，以2,6-二氯酚靛酚鈉在紫外分光光度計，600 nm處的還原速度表示SDH活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)活性的測定

參照ERREDE等[14]的方法測定。反應(yīng)混合液2.7 mL[pH 7.4磷酸鉀緩沖液0.2 mmol/L、2%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100、蒸餾水]，0.3 mL線粒體提取液。先量取適量反應(yīng)混合液置于37 ℃水浴鍋中，待水浴2 min后加入線粒體提取液和20 mg/mL細(xì)胞色素C，以細(xì)胞色素C在紫外分光光度計，550 nm處被氧化的速度來表示CCO活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 ATP、ADP和AMP含量的測定

參照OZOGUL等[15]的方法提取荔枝果皮中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)。從30個荔枝中取10 g果皮組織進(jìn)行液氮研磨，加入高氯酸提取，離心后的上清液用氫氧化鉀中和至pH 6.8，冰浴中靜置，過濾器過濾，在分析前存放于-20 ℃。按LIU等[16]的方法進(jìn)行。采用Water e2695型高壓液相色譜儀。色譜條件如下：超球體ODS EC(250 mm×4.60 mm)色譜柱，在254 nm處檢測并分析峰，采用連續(xù)梯度洗脫，流動相流速為1.2 mL/min，洗脫12 min，進(jìn)樣體積為20 μL，以確保完全分離并計算能荷(energy charge，EC)，如公式(3)所示：

(3)

1.2.9 果皮透射電鏡的觀察

參照黃旭明等[17]的方法。隨機(jī)選取30個荔枝果皮切成約4 mm×4 mm×1 mm的方塊，用戊二醛固定，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)漂洗樣品；經(jīng)過純包埋劑包埋樣品；加熱固化后即得到包埋好的樣品。通過LEICA-705902型超薄切片機(jī)將樣品切成50 nm的切片，再經(jīng)30 g/L檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾溶液各染色5 min，即可在JEM-1011型透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel整理數(shù)據(jù)、Origin 2017作圖和SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。上述每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 減壓處理對荔枝果皮褐變指數(shù)的影響

采后荔枝果實(shí)不耐貯藏，極易發(fā)生褐變，在常溫貨架期間果皮褐變程度逐漸變深。果皮褐變加劇了荔枝果實(shí)的衰老程度，商品價值驟然下降[18]。由圖1可知，隨著貯藏時間延長，荔枝果實(shí)褐變指數(shù)呈上升趨勢；在0～2 d，荔枝果皮褐變指數(shù)變化趨勢不大；2 d后，荔枝果皮褐變指數(shù)變化趨勢增大，其中對照組、40和80 kPa處理果實(shí)的褐變指數(shù)增大速度較快，而60 kPa處理果實(shí)的褐變指數(shù)增長較緩慢，明顯低于其他處理，說明60 kPa減壓處理明顯延緩了果皮褐變的發(fā)生，效果最佳，與對照組相比，存在差異顯著(P<0.05)。

圖1 減壓處理對荔枝果皮褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effect of reduced pressure treatment on browning index of litchi pericarp

2.2 減壓處理對荔枝果皮霉變指數(shù)的影響

采后荔枝果實(shí)會出現(xiàn)嚴(yán)重的霉變現(xiàn)象，一般是采后果實(shí)表面殘留的微生物引起的，加上在高溫高濕季節(jié)成熟，更有利病源微生物生長，造成對鮮果的侵染，蔓延后霉變加重[19]。如圖2所示，前2 d，荔枝果實(shí)并沒有發(fā)生霉變，2 d后，對照組、40和80 kPa減壓處理組果實(shí)霉變指數(shù)增加較快，而60 kPa處理組果皮的霉變指數(shù)始終處于較低水平，在貯藏第6天時，對照組果皮的霉變指數(shù)是60 kPa處理組果實(shí)的3.5倍，說明與對照組和其他減壓條件處理，60 kPa處理明顯抑制采后荔枝果皮霉菌的生長(P<0.05)。

圖2 減壓處理對荔枝果皮霉變指數(shù)的影響Fig.2 Effect of reduced pressure treatment on mildew index of litchi pericarp

2.3 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜相對滲透率的影響

細(xì)胞膜滲透性是分析細(xì)胞膜完整性的關(guān)鍵指標(biāo)，它的大小能夠反映果實(shí)衰老和損傷程度，一般用相對電導(dǎo)率表示[20]。如圖3所示，在整個貯藏期間，對照組果皮中的電導(dǎo)率遠(yuǎn)高于減壓處理組；貯藏第4天，對照組、40和80 kPa處理組的電導(dǎo)率均出現(xiàn)峰值；在常溫貨架期間，60 kPa處理組果皮中的細(xì)胞膜滲透率基本趨于平穩(wěn)，與對照組相比，兩者之間具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜相對滲透率的影響Fig.3 Effect of reduced pressure treatment on relative permeability of litchi pericarp cell membrane

2.4 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜流動性的影響

當(dāng)細(xì)胞膜流動性下降，膜脂通透性增強(qiáng)，膜脂中飽和脂肪酸含量增加時，意味著膜脂系統(tǒng)劣變[21]。如圖4所示，在貯藏期間，對照組果皮中細(xì)胞膜流動性P值高于減壓處理組，4組果皮中細(xì)胞膜流動性P值隨著常溫貨架期的延長而不斷增長；前2 d，全部呈緩慢上升趨勢；在2～6 d，開始呈直線迅速上升；到第6天，均出現(xiàn)峰值，且對照組荔枝果皮中細(xì)胞膜流動性P值(P<0.05)顯著高于60 kPa處理組，說明減壓處理能有效維持荔枝果皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其中60 kPa處理組效果較好。

圖4 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜流動性的影響Fig.4 Effect of reduced pressure treatment on cell membrane fluidity of litchi pericarp

2.5 減壓處理對荔枝果皮中SDH活性的影響

SDH是果皮細(xì)胞線粒體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶。如圖5所示，在0～2 d時，對照組的SDH活性呈下降趨勢，而減壓處理組的SDH活性逐漸上升，酶活性較對照組要高，對照組的荔枝果實(shí)呼吸作用受到抑制。在2～6 d時，對照組的SDH活性有所增加，而60 kPa處理組的SDH活性趨于平穩(wěn)，使線粒體的功能維持在一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。

圖5 減壓處理對荔枝果皮中SDH活性的影響Fig.5 Effect of reduced pressure treatment on SDH activity in litchi pericarp

2.6 減壓處理對荔枝果皮中CCO活性的影響

CCO活性的高低影響組織細(xì)胞的好氧速率，能反映出荔枝果實(shí)的有氧呼吸狀態(tài)。由圖6可知，在貯藏期間，減壓處理組的CCO活性遠(yuǎn)高于對照組，在荔枝新鮮采摘后的前期0～2 d，細(xì)胞的CCO活性均呈上升趨勢，此時荔枝果實(shí)的有氧呼吸代謝旺盛。第2天后開始下降，對照組的CCO酶活性迅速下降，在第4 天下降到最低后又開始上升，減壓處理組CCO活性趨于平穩(wěn)。在貯藏過程中，60 kPa處理組線粒體膜CCO活性顯著(P<0.05)高于對照組。說明60 kPa處理下的荔枝果實(shí)能保持較為穩(wěn)定的有氧呼吸水平，并對荔枝果實(shí)細(xì)胞膜脂代謝起到一定的抑制作用。

圖6 減壓處理對荔枝果皮中CCO活性的影響Fig.6 Effect of reduced pressure treatment on CCO activity in litchi pericarp

2.7 減壓處理對荔枝果皮ATP、ADP、AMP和EC的影響

如圖7-a所示，在貯藏期間，ATP 含量均有不同程度下降，在貯藏后期(4～6 d)下降較快，60 kPa處理荔枝果皮ATP 含量顯著(P<0.05)高于對照處理，為對照的1.38倍。

如圖7-b所示，在采收當(dāng)天，減壓處理荔枝果皮ADP含量略高于對照處理。在貯藏期間，ADP含量整體呈先上升后下降的趨勢，在前2 d開始上升，之后快速下降，到第6天，減壓處理組荔枝果皮ADP含量遠(yuǎn)高于對照組，分別是對照組的1.76、1.99和1.79倍，其中60 kPa處理荔枝果皮ATP含量顯著(P<0.05)高于對照組。

如圖7-c所示，在采收當(dāng)天，減壓處理荔枝果皮AMP含量低于對照處理。在貯藏期間，AMP含量均呈連續(xù)上升趨勢，并在2～4 d有一個快速上升過程，并在第6天全部達(dá)到峰值。在整個貯藏期間，60 kPa處理組AMP含量顯著(P<0.05)低于對照組。

如圖7-d所示，采后荔枝果皮EC值處于逐漸下降趨勢，在貯藏后期60 kPa處理組能荷顯著(P<0.05)高于對照組。減壓處理延緩了荔枝果皮能荷的下降。

上述結(jié)果表明，減壓處理有效延緩妃子笑荔枝果皮ATP、ADP含量的下降和AMP含量的升高，抑制果皮能荷的下降，有利于荔枝果皮處于較高的能量水平。

a-ATP；b-ADP；c-AMP；d-EC圖7 減壓處理對荔枝果皮的影響Fig.7 Effects of reduced pressure treatment on litchi pericarp

2.8 減壓處理對荔枝果皮超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖8中1～2可知，新鮮荔枝果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁緊貼，所有細(xì)胞器都集中在質(zhì)膜上，可以看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細(xì)胞核、核糖體、線粒體等，還有其他一些細(xì)胞器，表明果皮細(xì)胞具有鮮活生命力。

由圖8中3～6可知，貯藏2 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。2組荔枝果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨著常溫貨架期的延長而變得模糊，基本看不到完整的細(xì)胞器。在常溫貨架期，60 kPa處理組的細(xì)胞膜破損程度較對照組小。2組的細(xì)胞在常溫貨架后期皆出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，與對照組相比較而言，60 kPa處理組的荔枝果皮細(xì)胞質(zhì)壁分離較輕微。

由圖8中7～10可知，貯藏4 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。2組荔枝果皮細(xì)胞膜脂系統(tǒng)隨著常溫貨架期的延長而變得模糊破裂，對照組在常溫貨架后期基本找不到細(xì)胞膜，胞內(nèi)發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞器遭到降解，細(xì)胞壁變形，此時果皮細(xì)胞失去生命力；而60 kPa處理組保持一定的膜脂，細(xì)胞膜沒有完全脫離細(xì)胞壁，還能看見一些細(xì)胞器。

由圖8中11～14可知，貯藏6 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。在貯藏6 d后，2組荔枝果皮細(xì)胞破損程度越來越大。隨著常溫貨架期延長，對照組不但細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性消失，出現(xiàn)胞吞現(xiàn)象，細(xì)胞壁也出現(xiàn)破裂，表明褐變后的細(xì)胞生命力喪失嚴(yán)重；而60 kPa處理組的荔枝果皮細(xì)胞微結(jié)構(gòu)情況較好，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)沒有完全破壞。

圖8 荔枝貯藏過程中果皮超微結(jié)構(gòu)變化Fig.8 Ultrastructural changes of litchi pericarp during storage注：荔枝果皮透射電鏡觀察倍數(shù)：1-(×3 700)；2-(×2 550)；3-(×3 700)；4-(×8 900)；5-(×1 650)；6-(×6 200)；7-(×8 900)；8-(×2 550)；9-(×2 550)；10-(×12 500)；11-(×3 700)；12-(×3 700)；13-(×2 550)；14-(×1 650)

3 結(jié)論

荔枝極易發(fā)生褐變霉變并引發(fā)腐爛，貯藏性差。本試驗(yàn)中，以不同減壓處理和常壓作對照，研究了荔枝在貯藏2、4、6 d后，2組處理的荔枝果實(shí)細(xì)胞膜功能與膜脂代謝相關(guān)酶活性變化。研究表明，荔枝果皮結(jié)構(gòu)特殊，采后褐變與細(xì)胞膜的完整性密切相關(guān)，細(xì)胞滲透性增大，會導(dǎo)致膜內(nèi)酶和底物區(qū)域化破壞。在本研究中60 kPa處理通過延緩細(xì)胞膜滲透性的增加以及維持了果皮細(xì)胞膜的流動性，保持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能，從而顯著降低了荔枝果實(shí)的果皮褐變和霉變率。

線粒體中能夠進(jìn)行細(xì)胞組織能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，線粒體呼吸作用標(biāo)志酶SDH和CCO活性的高低能直接反映出線粒體生命系統(tǒng)的功能狀態(tài)。本研究中，在荔枝果實(shí)的成熟期，對照組和60 kPa處理組的SDH和CCO活性都比較高；而在荔枝果實(shí)的衰老期，2組活性都有所下降。表明隨著貯藏時間的延長，荔枝果實(shí)細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能遭到破壞，可能使膜脂代謝相關(guān)酶的活性也受到抑制，使細(xì)胞加速衰老。

采收后的荔枝果實(shí)，失去了外源能量供給，需要通過分解自身營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身正常代謝的能量。隨著采后果蔬的衰老、病原菌侵染的發(fā)生，果蔬氧化磷酸化作用明顯降低，會引起ATP生成的減少及EC水平的下降，ATP短缺和EC水平低意味著維持細(xì)胞生命活動所需要的能量不足，而能量虧缺會導(dǎo)致整個代謝系統(tǒng)瓦解，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而加速采后荔枝果實(shí)品質(zhì)敗壞。本試驗(yàn)中，減壓處理能夠使采后妃子笑荔枝果實(shí)果皮ATP、ADP含量保持在較高水平，延緩AMP含量的上升，維持較高的EC水平，保證采后果皮細(xì)胞膜修復(fù)所需要的能量供應(yīng)，延緩果皮細(xì)胞膜完整性的破壞，從而增強(qiáng)果實(shí)的抗病能力，其中60 kPa處理效果最好。