一株產(chǎn)香酵母Trichomonascus ciferrii的分離鑒定及其純種發(fā)酵豆豉的揮發(fā)性成分分析

文鶴，劉江崟，胡祥飛，李浩，楊慧林，王筱蘭*

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330027)

豆豉是我國一種傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，與天培(tempeh，印度尼西亞根霉型豆豉)、納豆(natto，日本細菌型豆豉)齊名，因其獨特風(fēng)味受到廣大人們喜愛[1-2]。豆豉中揮發(fā)性風(fēng)味成分主要有酯、醛、醇、酚、呋喃、吡嗪等物質(zhì)，共同賦予豆豉酯香、醇香和醬香等風(fēng)味。豆豉根據(jù)生產(chǎn)工藝主要分為霉菌型和細菌型，而霉菌型豆豉根據(jù)制曲菌種不同又可劃分為曲霉型、毛霉型和根霉型[3-4]，生產(chǎn)工藝、菌種及環(huán)境的區(qū)別導(dǎo)致不同類型豆豉揮發(fā)性成分種類及含量存在明顯差異[5]。這些揮發(fā)性成分除極少數(shù)來源于原料本身外，大多數(shù)是在生產(chǎn)加工過程中經(jīng)不同微生物生長代謝產(chǎn)生的[6]。

我國豆豉生產(chǎn)工藝多沿襲傳統(tǒng)方法，采用自然發(fā)酵，主要包括制曲和發(fā)酵(后發(fā)酵)兩個階段，在開放式環(huán)境中制曲且后發(fā)酵時間長達半個多月，外界環(huán)境對其風(fēng)味、品質(zhì)影響較大[3,7]。自然發(fā)酵極易受氣溫影響，且生產(chǎn)周期長，開放式生產(chǎn)環(huán)境難以適應(yīng)消費者對食品安全及衛(wèi)生等方面要求，如何提高生產(chǎn)水平、穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)、實現(xiàn)工業(yè)化成為豆豉生產(chǎn)企業(yè)急需解決的難題。以往豆豉研究方向主要集中在可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)微生物多樣性[8]，對豆豉風(fēng)味物質(zhì)是由何種功能微生物產(chǎn)生缺乏相關(guān)研究。豐富的風(fēng)味物質(zhì)與多種微生物生長代謝密切相關(guān)，此前本課題組已從豆豉中篩選獲得高產(chǎn)脂肪酶[9]、蛋白酶[10]、酒精[11]、乳酸[12]的菌株，這些產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶的菌株能分解大豆中的大分子物質(zhì)，生成甘油、脂肪酸、甘油單酯、二酯、氨基酸和糖類等風(fēng)味前體物質(zhì)，或者通過糖酵解作用直接形成乳酸、乙醇等風(fēng)味物質(zhì)，賦予豆豉特有的風(fēng)味。通過篩選優(yōu)良菌株進行豆豉純種發(fā)酵，對控制發(fā)酵參數(shù)、避免雜菌污染、縮短生產(chǎn)周期、實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和改善品質(zhì)及風(fēng)味有著重要意義。

本研究擬從自然發(fā)酵豆豉中篩選獲得優(yōu)良產(chǎn)香菌株，采用固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid phase micro extraction-GC-MS，SPME-GC-MS)分析對比該菌株純種發(fā)酵豆豉與自然發(fā)酵豆豉中風(fēng)味物質(zhì)變化，對純種發(fā)酵豆豉品質(zhì)及揮發(fā)性成分進行評價，以考察豆豉純種發(fā)酵生產(chǎn)的可行性，揭示曲霉型豆豉自然發(fā)酵生產(chǎn)過程中風(fēng)味、功能微生物和核心功能菌群之間的相關(guān)性，為豆豉傳統(tǒng)生產(chǎn)和現(xiàn)代生產(chǎn)工藝結(jié)合奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲霉型豆豉，江西南昌稻香園調(diào)味食品有限公司；黑豆(符合食品加工要求)，市售；正構(gòu)烷烴(C8～C40)混合標品，西格瑪公司；鄰氨基苯甲酸甲酯、苯甲酸甲酯(色譜純)，阿拉丁試劑有限公司；Yeast基因組DNA提取試劑盒，OMEGA公司。

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)(g/L)：葡萄糖2.0，蛋白胨10.0，脫水小牛腦浸粉12.5，脫水牛心浸粉5.0，NaCl 5.0，磷酸氫二鈉2.0。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 PCR儀，BIO-RAD；固相微萃取裝置(包括手柄和DVB/CAR/PDMS萃取頭)，Supelco公司；PowerEase 90 W核酸凝膠電泳儀，Life technologies公司；7890A/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

在同一生產(chǎn)周期內(nèi)采集樣品，取后發(fā)酵的第1、5、9、13、19天的豆豉樣品，采集后用無菌的塑封袋密封，冰袋冷藏帶回實驗室進行下一步操作，置于實驗室4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 菌株的篩選與鑒定

1.3.2.1 菌種富集培養(yǎng)

分別取4 g以上5組豆豉樣品加到裝有10 mL無菌生理鹽水的試管中，渦輪振蕩5 min，吸取1 mL菌液接入裝有100 mL BHI培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。采用平板稀釋涂布法，分別取上述培養(yǎng)基中的菌液梯度稀釋至10-4～10-7，取100 μL分別均勻涂布到BHI培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，挑取不同菌落形態(tài)的菌株轉(zhuǎn)至斜面上，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2.2 分離純化

將篩選得到菌株在BHI培養(yǎng)基平板上劃線分離，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線3次以上，在顯微鏡下觀察到形態(tài)單一的菌體則說明菌株已經(jīng)分離純化。

1.3.2.3 菌株鑒定

將上述目的菌株劃線活化后，觀察菌落形態(tài)特征；對菌株進行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)；采用Yeast基因組DNA提取試劑盒并參照試劑盒內(nèi)說明書提取總DNA。選用真菌通用引物ITS 1/ITS 4進行擴增。PCR反應(yīng)體系50 μL[2]：Premix Taq 25 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、模板 1 μL、ddH2O 22 μL。熱循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證PCR擴增成功后將產(chǎn)物送至上海生工進行測序，測序結(jié)果提交到GenBank獲得登錄號，在NCBI里進行Blast序列比對分析，然后通過MEGA 6.0軟件用領(lǐng)接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 豆豉采集

純種發(fā)酵樣品：用接種環(huán)挑取適量上述菌接種到裝有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)36 h，再將菌液(5×106CFU/mL)按10%接種量接種到經(jīng)121 ℃、20 min蒸熟的市售黑豆中，不經(jīng)過制曲環(huán)節(jié)，直接在燒杯中30 ℃恒溫發(fā)酵19 d。發(fā)酵結(jié)束，在燒杯上、中、下3層取樣(深度分別為5、10、15 cm，下同)，取樣后充分混勻，每份樣品采集3組。

自然發(fā)酵樣品：該豆豉是經(jīng)過傳統(tǒng)工藝的制曲、洗曲階段后，在發(fā)酵池自然發(fā)酵19 d的樣品。在同一發(fā)酵池的上、中、下3層取樣，取樣后充分混勻，每份樣品采集3組。

1.3.4 SPME萃取揮發(fā)性成分

將DVB/CAR/PDMS萃取頭按照包裝里的說明書進行老化備用，將自然發(fā)酵第19天、純種發(fā)酵第19天的豆豉樣品(每個樣品設(shè)置3組重復(fù))進行研磨，分析前取研磨后的豆豉樣品過40目篩。取3 g樣品，加入到20 mL頂空進樣瓶中，采用恒溫水浴加熱，60 ℃平衡20 min，將SPME裝置置于頂空進樣瓶上方，60 ℃恒溫萃取30 min，再采用GC-MS分析[13]。

1.3.5 標準曲線測定

取250 mg苯甲酸甲酯標品，100 mg鄰氨基苯甲酸甲酯標品，溶解于25 mL無水乙醇中配成母液，依次分別取1.25、1.00、0.833、0.714、0.625、0.50 mL的母液，分別加入一定量的乙醇，定容至5 mL。取全部上述溶液，采用1.3.4中揮發(fā)性成分SPME的條件進行萃取后，再采用GC-MS分析。采用標準曲線法計算樣品中目標物質(zhì)的含量，以2.50、2.00、1.67、1.43、1.25、1.00 g/L質(zhì)量濃度的苯甲酸甲酯為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作苯甲酸甲酯標準曲線；以1.00、0.80、0.67、0.57、0.50、0.40 g/L質(zhì)量濃度的鄰氨基苯甲酸甲酯為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作鄰氨基苯甲酸甲酯標準曲線，測出樣品的峰面積后在標準曲線上查出其對應(yīng)的濃度。

1.3.6 GC-MS分析條件

色譜條件參照文獻[14]：Agilent 19091S-433毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，分流進樣；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至85 ℃，10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu。

1.3.7 成分鑒定及含量計算

定性分析：各樣品組分質(zhì)譜信息與NIST08質(zhì)譜庫進行檢索，初步確定化合物，采用樣品GC-MS分析條件進行正構(gòu)烷烴C8～C40系列混合標品分析，根據(jù)文獻[15]中的方法計算線性保留指數(shù)(linear retention indice，LRI)，再與NIST數(shù)據(jù)庫中的線性保留指數(shù)進行比，對化合物定性進行進一步確認[14]。

定量分析：揮發(fā)性成分相對含量用峰面積歸一化法計算[16]；采用外標法對純種發(fā)酵豆豉中主要揮發(fā)性成分定量，用主要揮發(fā)性成分標準品的峰面積與其對應(yīng)的濃度做標準曲線，根據(jù)標準曲線法計算樣品中目標物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)特征

經(jīng)過富集和分離純化，從自然發(fā)酵豆豉中分離獲得23株不同的菌株，經(jīng)復(fù)篩得到1株產(chǎn)香能力較強的菌株，命名為WLW。通過菌落形態(tài)觀察，菌落直徑2～3 mm，奶油色，半球狀，大而隆起，表面較光滑，濕潤，不易挑起，有大量向下生長嵌入培養(yǎng)基的假菌絲；光學(xué)顯微鏡觀察顯示該菌株形成較長的藕節(jié)狀假菌絲。

a-菌落形態(tài)；b-顯微形態(tài)圖1 WLW在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of WLW on YPD medium

2.1.2 ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

將上海生工的測序結(jié)果上傳到GenBank，獲得登錄號MW509947.1，再將ITS基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性比對。利用MEGA 6.0軟件進行多序列比對分析，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示菌株WLW與Trichomonascusciferrii(KY109915.1)的同源性達99%以上。綜合WLW菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株WLW鑒定為Trichomonascusciferrii。將該菌株送至廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)進行保藏，保藏號為：GDMCC No.61319。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的菌株WLW系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain WLW based on ITS sequence

2.2 純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖

純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分用SPME萃取后再通過GC-MS分析，得到樣品中揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖。由圖3可知，色譜峰較均勻分布在0～40 min，并且豐度較高，說明GC-MS條件適宜[17]。SPME是根據(jù)萃取頭極性不同，通過相似相溶原理萃取不同的物質(zhì)，李金林等[13]發(fā)現(xiàn)豆豉中揮發(fā)性物質(zhì)極性成分占比較高，而DVB/CAR/PDMS萃取頭屬于中等極性，適用于萃取中等極性和極性化合物，這說明用DVB/CAR/PDMS萃取頭對豆豉樣品進行SPME萃取較為合適。由圖3-a可以看出，豆豉純種發(fā)酵的揮發(fā)性成分中有2種化合物的峰面積尤為突出，由圖3-b可以看出，豆豉自然發(fā)酵的揮發(fā)性成分中有3種化合物的峰面積較為突出。

2.3 純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分鑒定

采用NIST08質(zhì)譜庫檢索和NIST數(shù)據(jù)庫比對，進一步確定檢測到的揮發(fā)性成分，結(jié)果如表1所示，純種發(fā)酵豆豉共檢測出44種揮發(fā)性成分，其中酯3種、酮2種、酚3種、醇12種、醛5種、酸5種、吡嗪7種、呋喃2種、芳香族3種、其他2種；自然發(fā)酵豆豉共檢測出87種揮發(fā)性成分，其中酯15種、酮7種、酚5種、醇10種、醛10種、酸10種、吡嗪10種、呋喃3種、芳香族6種、其他11種。

采用外標法對純種發(fā)酵豆豉中的主要揮發(fā)性成分進行定量分析，以外標物苯甲酸甲酯的質(zhì)量濃度X(g/L)及其對應(yīng)的峰面積做標準曲線為y=47 713 490.20x+126 056 260.05，R2=0.995，以外標物鄰氨基苯甲酸甲酯的質(zhì)量濃度X(g/L)及其對應(yīng)的峰面積做標準曲線為y=75 257 089.46x-25 853 586.18，R2=0.991，2種方法的線性較好且符合方法學(xué)要求。

2.4 純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分對比分析

純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉中揮發(fā)性成分種類、數(shù)量及含量變化如圖4所示。通過表1分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵19 d后，自然發(fā)酵豆豉形成的揮發(fā)物種類為純種發(fā)酵豆豉的1.98倍，峰面積總和也遠超純種發(fā)酵豆豉。自然發(fā)酵豆豉中各種類風(fēng)味物質(zhì)含量較為均衡，共同造就豆豉酯香、醇香和醬香等多層次風(fēng)味特征，而純種發(fā)酵豆豉形成的44種風(fēng)味物質(zhì)中，酯類化合物相對含量高達81.66%，尤其是苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯2種風(fēng)味物質(zhì)格外突出。其中純種發(fā)酵豆豉中有9種風(fēng)味物質(zhì)在自然發(fā)酵豆豉中未檢出，但也僅為純種發(fā)酵總揮發(fā)性成分的1.38%，可能是在自然發(fā)酵豆豉中含量過低而未能檢測出。以上說明利用WLW菌株純種發(fā)酵豆豉工業(yè)化生產(chǎn)可行，雖沒有自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分種類多，但該菌株純種發(fā)酵豆豉能高產(chǎn)酯類化合物，賦予豆豉更濃郁的酯香、果香和花香。

表1 純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉中主要揮發(fā)性成分Table 1 The main volatile components in fermented Douchi by purebred fermentation and natural fermentation

續(xù)表1

a-揮發(fā)性成分數(shù)量變化；b-揮發(fā)性成分含量變化圖4 純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉中揮發(fā)性成分種類、數(shù)量及含量變化Fig.4 Chang in species, amount, and content of volatile compounds in fermented Douchi by purebred and natural fermentation

在自然發(fā)酵豆豉中揮發(fā)性成分主要為酸、醛、酚、醇，分別占總揮發(fā)性成分的36.49%、24.59%、11.41%、9.43%。酸、醇賦予豆豉甜香、果香、奶酪味、脂香、花香等有益風(fēng)味。2-甲基丁酸和異戊酸分別占總揮發(fā)性成分的19.02%、13.44%，2-甲基丁酸具有辛辣的羊乳干酪味和愉快的水果香氣，異戊酸具有賦予豆豉甜香、果香、奶油香、漿果香等美好風(fēng)味。酸類物質(zhì)含量較高的原因可能是由蛋白質(zhì)和脂肪分解產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等大分子繼續(xù)分解產(chǎn)生小分子酸類風(fēng)味物質(zhì)造成的[18]，趙文鵬等[19]發(fā)現(xiàn)酸類化合物主要是在后發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。醇類物質(zhì)可由羰基化合物通過還原作用或微生物代謝生成[20]，大量酸類物質(zhì)的存在可以和醇類化合物通過酯化反應(yīng)形成酯類化合物，豆豉特殊風(fēng)味是一個緩慢形成的過程[21]。李金林等[13]在研究曲霉型豆豉時發(fā)現(xiàn)酯類是后發(fā)酵過程中形成最多的一類物質(zhì)，醛是大豆中脂肪氧化產(chǎn)物[18]，醛類化合物主要為苯甲醛和可卡醛，分別占總揮發(fā)物的15.70%和4.55%，苯甲醛是一種工業(yè)上常用的芳香醛，具有強烈的杏仁氣味，同時具有甜香、堅果香和櫻桃味等良好風(fēng)味，可卡醛具有苦可可香、堅果香、烘烤香、甜香和青草香等良好風(fēng)味。在自然發(fā)酵豆豉中酸、醛、酚、醇的含量占總揮發(fā)性成分的52.71%，共同組成豆豉特有的風(fēng)味。

純種發(fā)酵豆豉中揮發(fā)性成分主要為酯、芳香族、呋喃、醇，含量分別為總揮發(fā)性成分的81.66%、5.86%、4.99%、4.61%，尤為突出的是酯類化合物中的苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯，分別占純種發(fā)酵豆豉總揮發(fā)性成分的60.49%和21.16%，二者之和超過80%，而二者在自然發(fā)酵中占其總揮發(fā)性成分的0.61%和0.23%，差異明顯。其中苯甲酸甲酯具有強烈的果香和花香，有晚香玉和依蘭依蘭似的香韻，天然存在于依蘭依蘭花、晚香玉花和丁香花中；鄰氨基苯甲酸甲酯具有強烈的果香和花香，天然存在于晚香玉、茉莉花、梔子花和橙花中。苯甲酸甲酯的峰面積高達(1 924.51±0.35)×105mAu·min，鄰氨基苯甲酸甲酯的峰面積也達到(673.21±5.56)×105mAu·min，分別代入上步相對應(yīng)的標準曲線換算可得苯甲酸甲酯在1 g豆豉中的含量約為23.48 mg，鄰氨基苯甲酸甲酯在1 g豆豉中的含量約為2.06 mg，正是由于二者表現(xiàn)出強烈的花香和果香，純種發(fā)酵的豆豉中能直接聞到茉莉花香和晚香玉似的香韻。

自然發(fā)酵豆豉呈現(xiàn)復(fù)合風(fēng)味，而純種發(fā)酵豆豉在風(fēng)味方面表現(xiàn)出濃郁的酯香、果香和花香的特點，遠超自然發(fā)酵豆豉。市售的豆豉往往采用自然發(fā)酵工藝，不同甚至同一品牌的不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)都有較大差別。雖然自然發(fā)酵豆豉有多層次味覺體驗，但不可控的生產(chǎn)工藝、粗放的生產(chǎn)環(huán)境可能造成豆豉霉變、口感風(fēng)味下降甚至導(dǎo)致嚴重的食品安全問題[3]。通過添加菌種進行純種發(fā)酵、嚴格控制發(fā)酵工藝能有效解決以上問題，盡管純種發(fā)酵豆豉沒有自然發(fā)酵豆豉的多重味覺體驗，但可以通過篩選獲得自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物和多菌種搭配改良產(chǎn)品營養(yǎng)和風(fēng)味，為工業(yè)化大批量生產(chǎn)風(fēng)味豆豉提供可能。

3 結(jié)論

本研究通過篩選分離得到1株產(chǎn)香酵母Trichomonascusciferrii，命名為WLW。利用WLW純種發(fā)酵豆豉19 d后，以自然發(fā)酵19 d的豆豉為對照，采用SPME-GC-MS分析2組樣品中揮發(fā)性成分，對純種發(fā)酵豆豉的品質(zhì)進行評價。自然發(fā)酵豆豉共檢出87種揮發(fā)性成分，純種發(fā)酵豆豉共檢出44種揮發(fā)性成分，前者揮發(fā)性成分種類約為后者的1.98倍。自然發(fā)酵豆豉中各種類風(fēng)味物質(zhì)含量較為均衡，共同賦予豆豉酯香、醇香和醬香等多層次風(fēng)味特征；而純種發(fā)酵豆豉中酯類化合物相對含量高達81.66%，其中酯類化合物中的苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯分別占總揮發(fā)性成分的60.49%、21.16%，苯甲酸甲酯在豆豉中的含量約為23.48 mg/g，鄰氨基苯甲酸甲酯在豆豉中的含量約為2.06 mg/g，二者都具有強烈的花香和果香等美好風(fēng)味。利用該菌株純種發(fā)酵雖沒有自然發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分種類多，但純種發(fā)酵能高產(chǎn)酯類化合物，賦予豆豉更濃郁的酯香、花香和果香。自然發(fā)酵豆豉不可控的生產(chǎn)工藝、粗放的生產(chǎn)環(huán)境容易造成產(chǎn)品品質(zhì)下降，甚至引發(fā)嚴重的食品安全問題，而純種發(fā)酵可控的發(fā)酵工藝和更濃郁的風(fēng)味特征可以改良豆豉的品質(zhì)，該菌株純種發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)豆豉方案可行。豆豉風(fēng)味物質(zhì)的形成是由多種微生物代謝共同作用的結(jié)果，風(fēng)味物質(zhì)形成與功能微生物之間的關(guān)聯(lián)還需要在未來進行進一步的研究。