腈水解酶重組菌的培養(yǎng)工藝及磁性固定化研究

商玉婷，龔勁松，王順治，陸震鳴，李恒，史勁松，許正宏*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 藥學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

煙酸又稱維生素B3，在生物體的生命活動(dòng)中起著重要作用。煙酸具有抗氧化活性，可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受UV-C輻射的損害[1]。食用含有煙酸的飲食可以降低牛、火雞或豬等的脂肪含量，從而改善肉質(zhì)[2]。此外，煙酸還可以作為原料來(lái)合成新的化學(xué)中間體，例如煙酰胺、6-羥基煙酸[3]等。

利用腈水解酶催化3-氰基吡啶制得煙酸具有產(chǎn)物純度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作過(guò)程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)腈水解酶的杜鵑紅球菌tg1-A6在55 ℃下能將130 mmol/L 3-氰基吡啶完全轉(zhuǎn)化為煙酸，煙酸的最高質(zhì)量濃度可達(dá)165.2 g/L[4]。FAN等[5]構(gòu)建了1株產(chǎn)重組腈水解酶的大腸桿菌，基因來(lái)源為RalstoniaeutrophaH16，該酶可以在20.8 h水解1 050 mmol/L 3-氰基吡啶，積累生產(chǎn)煙酸129.2 g/L。

通過(guò)罐上發(fā)酵培養(yǎng)可以提高細(xì)胞在培養(yǎng)基中的密度，從而提高產(chǎn)物的濃度和比細(xì)胞生產(chǎn)率[6]。相比常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，罐上發(fā)酵技術(shù)能夠提高生產(chǎn)率、減少培養(yǎng)量和設(shè)備投資，并增強(qiáng)下游加工能力[7]。通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)物的補(bǔ)料分批培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度發(fā)酵的最常用方法之一，其包括簡(jiǎn)單間接反饋方法，例如恒pH培養(yǎng)策略、DO-stat策略、指數(shù)進(jìn)料，或者根據(jù)葡萄糖需求量反饋補(bǔ)料等方法[8-9]。顧炳琛等[10]在腈水解酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵中采用pH調(diào)節(jié)策略，最終腈水解酶的最高活性可達(dá)到583.3 U/mL。

磁性固定化是通過(guò)使用磁性納米材料對(duì)酶、抗體或細(xì)胞等進(jìn)行結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)通過(guò)磁場(chǎng)進(jìn)行產(chǎn)物或細(xì)胞分離的一種固定化方法。磁性納米顆粒比表面積高且在外部磁場(chǎng)下易于分離[11]。與游離酶相比，固定在磁性納米顆粒上的酶對(duì)有機(jī)溶劑介導(dǎo)的變性具有更高的抵抗力[12]。而復(fù)合型磁性納米材料則是磁性納米粒子與特定的載體材料結(jié)合而設(shè)計(jì)的新型材料[13]。陽(yáng)離子聚合物是復(fù)合磁性納米粒子常使用的材料，可以通過(guò)提供靜電力的表面修飾提高固定化效率[14]。

在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建1株產(chǎn)重組腈水解酶的BacillussubtilispMA5-NITR，其最高酶活力為38.03 U/mL，可以催化3-氰基吡啶累積生產(chǎn)煙酸，質(zhì)量濃度達(dá)到295.46 g/L[15]。為了進(jìn)一步提高B.subtilis來(lái)源的腈水解酶的產(chǎn)酶潛力和累積生產(chǎn)煙酸的能力，本文采用分批培養(yǎng)、恒速補(bǔ)料培養(yǎng)和恒pH培養(yǎng)等策略對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提高酶活力及生物量、降低生產(chǎn)成本，進(jìn)一步運(yùn)用氨基化核殼結(jié)構(gòu)磁性Fe3O4納米粒子對(duì)重組菌進(jìn)行細(xì)胞固定化，以提高酶穩(wěn)定性，提升其轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。目前的研究可以為未來(lái)腈水解酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝及大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化合成煙酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

重組腈水解酶B.subtilispMA5-NITR(以下簡(jiǎn)稱重組腈水解酶)為實(shí)驗(yàn)室保藏，基因是惡臭假單胞菌來(lái)源的腈水解酶基因[15]。

1.1.2 試劑

酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂，OXOID/REMEL(英國(guó))；氯化鈉、葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4·3H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5；

TBG培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，KH2PO42.3，K2HPO4·3H2O 16.4，酵母粉24，葡萄糖10，甘油5；

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖800；

固體LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5，瓊脂20；

LB、固體LB培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min；TBG培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基于115 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 酶活力檢測(cè)方法

酶活力定義：在標(biāo)準(zhǔn)條件下即30 ℃的反應(yīng)溫度下，1 min生成1 μmol煙酸或氨所需酶量為1 U。

取200 μL菌液在12 000 r/min下離心2 min，并用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌2次后收集靜息細(xì)胞，加入800 μL PBS緩沖液進(jìn)行重懸并于30 ℃金屬浴反應(yīng)5 min。添加200 μL 3-氰基吡啶(500 mmol/L)后繼續(xù)反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后12 000 r/min下離心2 min。取10 μL反應(yīng)上清液如上述操作進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定酶活力。

1.2.1.2 HPLC分析

本研究中3-氰基吡啶和煙酸均使用HPLC(Dionex Ultimate 3000)進(jìn)行分析。分析柱使用X-Bridge C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm；Waters)，0.02%流動(dòng)相為60%的乙腈和40%的三氟乙酸(均為體積分?jǐn)?shù))。液相分析的流速、柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)置為0.5 mL/min、30 ℃和268 nm。

1.2.2 罐上發(fā)酵

1.2.2.1 種子制備

將-80 ℃凍存的B.subtilispMA5-NITR于LB平板進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。然后按接種量2%轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后作為種子液待用。

1.2.2.2 分批培養(yǎng)

發(fā)酵罐大小為7.5 L，裝有4 L無(wú)菌TBG培養(yǎng)基。將種子液按照10%的接種量接種至發(fā)酵罐中并添加卡那霉素(Kanamycin)(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)?？刂瓢l(fā)酵反應(yīng)溫度為30 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，溶氧不低于30%(體積分?jǐn)?shù))，并流加消泡劑。定時(shí)取樣檢測(cè)發(fā)酵液的菌液濃度、酶活力、pH、殘余葡萄糖濃度。

1.2.2.3 恒速補(bǔ)料培養(yǎng)

首先按照1.2.2.2進(jìn)行分批培養(yǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中流加25%(體積分?jǐn)?shù))氨水，控制pH不低于7.0。當(dāng)檢測(cè)到殘余葡萄糖基本消耗完時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為3.6 mL/h。

1.2.2.4 恒pH培養(yǎng)

采用恒pH培養(yǎng)法進(jìn)行補(bǔ)料，在發(fā)酵前期進(jìn)行分批培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖基本消耗完后根據(jù)pH變化進(jìn)行反饋補(bǔ)料。發(fā)酵前期，葡萄糖流加速率為20%，同時(shí)流加25%氨水使pH維持在7.0左右；發(fā)酵中期，葡萄糖流加速率為15%，同時(shí)流加氨水使pH維持在7.0左右；發(fā)酵后期，葡萄糖流加速率為5%，同時(shí)流加氨水使pH維持在7.0左右。此外，補(bǔ)料全程維持葡萄糖質(zhì)量濃度在1～5 g/L，發(fā)酵中后期通過(guò)增加通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)保證溶氧供給。

1.2.3 制備Fe3O4磁性納米粒子

1.2.3.1 制備Fe3O4納米粒子

采用化學(xué)共沉淀方法[16]，進(jìn)行Fe3O4磁性納米粒子制備。具體步驟如下：FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照1∶8的摩爾比溶解于100 mL的超純水中，并在N2下攪拌混勻。然后滴加氨水到混合溶液中，至pH為11。在70 ℃下反應(yīng)1 h后，置于室溫下冷卻。通過(guò)外加磁場(chǎng)將產(chǎn)物從溶液中分離，并用蒸餾水反復(fù)洗滌至pH變?yōu)橹行?。最后于室溫下真空干燥，獲得Fe3O4納米粒子。其主要反應(yīng)過(guò)程為[17]：

Fe2++Fe3++OH-→Fe(OH)2/Fe(OH)3(形成共沉淀);

Fe(OH)2+Fe(OH)3→FeOOH+Fe3O4(pH≤7.5);

FeOOH+Fe2+→Fe3O4+H+(pH≥9.2)。

1.2.3.2 制備Fe3O4@SiO2納米粒子。

取4 g制備好的Fe3O4納米粒子，加入160 mL乙醇，40 mL水和5 mL氨水，超聲分散1 h后在室溫下進(jìn)行機(jī)械攪拌，同時(shí)緩慢滴加1 mg/L正硅酸乙酯(tetraethoxysilane，TEOS)至混合溶液中。反應(yīng)12 h后，通過(guò)外加磁場(chǎng)將產(chǎn)物從溶液中分離，蒸餾水反復(fù)洗滌至pH變?yōu)橹行浴Ｈ缓蠹尤?0 mL 1 mol/L的HCl，過(guò)夜浸泡，外加磁場(chǎng)進(jìn)行分離，并用蒸餾水洗滌至中性，最后于室溫下真空干燥，獲得Fe3O4@SiO2的納米粒子。

1.2.3.3 制備Fe3O4@SiO2@PEI納米粒子

取1 g Fe3O4@SiO2加入到含有100 mL超純水的錐形瓶中，超聲分散1 h后加入20 mg/mL的聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI，分子量10 000)，N2保護(hù)下持續(xù)攪拌，反應(yīng)8 h后，利用外加磁場(chǎng)分離，除去多余未反應(yīng)的PEI，再超聲分散于超純水中，最后室溫下真空干燥，即可得到經(jīng)PEI修飾的氨基化核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4納米粒子，即為Fe3O4@SiO2@PEI，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 制備磁性固定化細(xì)胞

1.2.4.1 制備方法

重組腈水解酶10 000 r/min離心5 min后去上清液，使用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌3次后重懸制備成靜息細(xì)胞懸液，使用分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度后放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將制備的Fe3O4@SiO2@PEI按照一定比例加入到重組腈水解酶靜息細(xì)胞懸液中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)20 min后利用外加磁場(chǎng)除去未吸附上磁性納米粒子的菌體。充分洗滌后測(cè)定菌液濃度，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

吸附效率計(jì)算如公式(1)所示：

吸附效率/%

(1)

1.2.4.2 制備條件對(duì)固定化細(xì)胞的影響

(1)靜息細(xì)胞濃度：將制備好的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子按照1 g/L進(jìn)行分裝，并添加PBS進(jìn)行重懸，然后超聲分散1 h。并將靜息細(xì)胞按照比例添加至磁性固定化細(xì)胞中，分別稀釋到1～11 g/L。

(2)溫度：分別在20～60 ℃下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細(xì)胞懸液中制備磁性固定化細(xì)胞。

(3)pH：分別在pH 4.0～9.0環(huán)境下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細(xì)胞懸液中制備磁性固定化細(xì)胞。

測(cè)定不同靜息細(xì)胞濃度、溫度及pH下固定化細(xì)胞的吸附效率和酶活力，研究不同制備條件對(duì)磁性固定化細(xì)胞的影響。

1.2.4.3 磁性固定化細(xì)胞的性能評(píng)價(jià)

(1)細(xì)胞溫度穩(wěn)定性：將磁性固定化細(xì)胞分別置于4、30、40、50 ℃條件下進(jìn)行孵育，定時(shí)取樣測(cè)定酶活力直至酶活力降低至初始水平的一半。以初始固定化細(xì)胞酶活力作為對(duì)照，以殘余酶活力的自然對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行作圖并計(jì)算固定化腈水解酶在不同溫度下的半衰期。

(2)底物耐受性：將50～400 mmol/L的3-氰基吡啶分別加入到固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞體系中進(jìn)行酶催化反應(yīng)。通過(guò)不同3-氰基吡啶濃度下磁性固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞酶活力的變化來(lái)評(píng)價(jià)底物耐受性。

(3)初始底物濃度影響：在相同體積的體系中，分別添加50～400 mmol/L的3-氰基吡啶進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。每5 min取樣，檢測(cè)磁性固定化細(xì)胞對(duì)不同濃度底物的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.5 磁性固定化細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸

使用制備好的磁性固定化細(xì)胞進(jìn)行對(duì)3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，每轉(zhuǎn)化10批次，通過(guò)磁場(chǎng)分離磁性固定化細(xì)胞和產(chǎn)物，并將磁性固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的體系進(jìn)行下一輪批次轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的罐上發(fā)酵

2.1.1 分批培養(yǎng)

通過(guò)分批培養(yǎng)策略研究重組菌的pH變化、酶活力、葡萄糖濃度和菌液濃度變化情況，分析影響重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的因素，為后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化提供參考依據(jù)。由圖1可知，在發(fā)酵初始階段，生物量較低，重組菌處于遲緩期，發(fā)酵罐內(nèi)pH基本維持恒定；發(fā)酵中期，重組菌達(dá)到對(duì)數(shù)期，菌體開始快速生長(zhǎng)，此時(shí)酶活力也隨著重組菌生物量的提高而快速升高，在36 h時(shí)菌液濃度達(dá)到最高，OD600為19.27，同時(shí)酶活力也達(dá)到最大值為63.41 U/mL；隨后重組菌進(jìn)入穩(wěn)定期中后期，此時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖基本消耗完畢，發(fā)酵pH持續(xù)增加；在發(fā)酵末期，pH進(jìn)一步升高，達(dá)到8.0以上，重組腈水解酶的酶活力開始出現(xiàn)明顯降低。

圖1 重組B.subtilis pMA5-NITR分批培養(yǎng)Fig.1 Batch mode of fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.2 恒速補(bǔ)料培養(yǎng)

在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料流加，可以有效補(bǔ)充細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于葡萄糖廉價(jià)易得，并且能夠被微生物快速利用，因此被廣泛用作重組菌罐上發(fā)酵的限制性基質(zhì)為微生物生長(zhǎng)提供能源[18]。黃燕等[19]通過(guò)恒速補(bǔ)料培養(yǎng)的方法提升了角質(zhì)酶的表達(dá)水平，在OD600為75時(shí)，進(jìn)行恒速流加0.8 g/(L·h)的乳糖溶液，重組菌在24 h達(dá)到最高(OD600為90)，酶活力在26 h達(dá)到最大為4 788 U/mL，是搖瓶發(fā)酵酶活力的28倍。

因此，待初始葡萄糖基本消耗完畢后對(duì)重組菌進(jìn)行補(bǔ)料，葡萄糖流加速率為3.6 mL/h。由圖2可知，開始補(bǔ)糖后重組腈水解酶的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顯著延長(zhǎng)。在63 h前，重組菌的酶活力和菌液濃度隨著時(shí)間的增加而升高，酶活力在66 h達(dá)到最大值，為125.62 U/mL，是分批培養(yǎng)的1.98倍。菌液濃度在75 h達(dá)到最大值，OD600為55.80，是分批培養(yǎng)的2.9倍。

圖2 重組B.subtilis pMA5-NITR恒速補(bǔ)料培養(yǎng)Fig.2 Constant-speed feed fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.3 恒pH培養(yǎng)

由恒速補(bǔ)料培養(yǎng)可知，發(fā)酵中后期由于葡萄糖流加速率有限，無(wú)法及時(shí)滿足重組菌生長(zhǎng)繁殖所需，使菌體生長(zhǎng)減慢，產(chǎn)酶受到限制。采取調(diào)控更加精細(xì)的恒pH培養(yǎng)策略，對(duì)重組腈水解酶進(jìn)行發(fā)酵，有望進(jìn)一步提升菌體的產(chǎn)酶潛力。

如圖3所示，發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖在24 h時(shí)基本消耗完畢，此時(shí)開始補(bǔ)加葡萄糖。在進(jìn)行補(bǔ)料之后葡萄糖濃度相對(duì)較為穩(wěn)定，60 h后葡萄糖質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定在1.2 g/L。重組菌菌液濃度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而穩(wěn)步上升，并在84 h時(shí)達(dá)到最高(OD600為58.85)，是分批培養(yǎng)的3.05倍，隨后開始緩慢下降。重組B.subtilis在發(fā)酵51 h時(shí)有最高酶活力，為167.32 U/mL，是分批培養(yǎng)的2.64倍，隨后酶活力開始下降。90 h后酶活力快速降低，96 h時(shí)酶活力約為80 U/mL，在108 h時(shí)終止發(fā)酵。

圖3 重組B.subtilis pMA5-NITR恒pH培養(yǎng)策略Fig.3 Feeding fermentation in pH-stat strategy of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.2 重組腈水解酶的磁性固定化

2.2.1 靜息細(xì)胞濃度對(duì)磁性固定化細(xì)胞的制備及酶活力的影響

將1 g/L的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子分別添加到1～11 g/L的靜息細(xì)胞中進(jìn)行混合，并按照1.2.4制成磁性固定化細(xì)胞。結(jié)果如圖4-a所示，在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，吸附效率最高，可達(dá)到69%，隨著靜息細(xì)胞濃度的升高，吸附效率逐漸降低。固定化細(xì)胞酶活力隨靜息細(xì)胞濃度的增加而升高，在5 g/L時(shí)達(dá)到最高酶活力，之后隨著靜息細(xì)胞濃度的升高，吸附效率開始下降，而酶活力也隨之降低。因此，5 g/L為最佳靜息細(xì)胞吸附濃度。

2.2.2 溫度對(duì)磁性固定化細(xì)胞的制備及酶活力的影響

為了評(píng)估溫度對(duì)磁性固定化細(xì)胞的制備和酶活力的影響，在20～60 ℃下制備磁性固定化細(xì)胞。結(jié)果如圖4-b所示，在55 ℃之前，磁性納米粒子對(duì)細(xì)胞的吸附效率隨著溫度的升高而提高，在55 ℃時(shí)達(dá)到最大吸附效率為76%，而當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃，吸附效率開始下降。酶活力在50 ℃之前隨著溫度的升高而增加，并在50 ℃達(dá)到最大，然后隨著溫度的升高而降低?？紤]到腈水解酶的穩(wěn)定性，選擇相對(duì)較高的30 ℃作為后續(xù)研究溫度。

2.2.3 pH對(duì)磁性固定化細(xì)胞的制備及酶活力的影響

不同pH條件會(huì)影響到磁性納米粒子和菌體表面的帶電情況，并影響到兩者之間的吸附效率。將靜息細(xì)胞和磁性納米粒子在不同pH的緩沖液下進(jìn)行復(fù)合，如圖4-c所示，當(dāng)pH較低時(shí)，磁性固定化細(xì)胞的吸附效率較低，且隨著pH的升高而增大。當(dāng)pH在7.2時(shí)有最高吸附效率為67.33%，然后隨著pH的升高而逐漸下降。酶活力受pH的影響較大，在pH 4.0～4.6基本完全喪失酶活力，然后隨著pH的上升而升高，并在pH 7.2時(shí)有最高酶活力。之后酶活力隨著pH的升高而下降，并在pH為8.9時(shí)基本完全喪失。同時(shí)磁性固定化細(xì)胞的酶活力受緩沖液的影響較明顯，在PBS緩沖液中酶活力最高。

a-不同靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度；b-不同反應(yīng)溫度；c-不同反應(yīng)pH圖4 不同制備條件對(duì)磁性固定化細(xì)胞及酶活力的影響Fig.4 Effect of different preparation conditions on the magnetically immobilized cells and enzyme activity

2.2.4 磁性固定化細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性

設(shè)置不同的溫度孵育磁性固定化細(xì)胞，以殘留酶活力(residual enzyme activity,RA)的自然對(duì)數(shù)ln(RA)對(duì)時(shí)間進(jìn)行作圖。初始固定化細(xì)胞酶活力設(shè)定為相對(duì)活性的100%。由圖5-a可知，固定化細(xì)胞在4 ℃下最為穩(wěn)定，其半衰期(t1/2)達(dá)到140 h。在30 ℃下相對(duì)較穩(wěn)定，半衰期(t1/2)為15 h。在40、50 ℃ 下保存6 h后，酶活力僅有初始酶活力的29%和5%。和游離細(xì)胞相比，磁性固定化細(xì)胞在4 ℃下的半衰期提高了2.33倍。

2.2.5 磁性固定化細(xì)胞的底物耐受性

底物耐受性是反映酶催化能力的重要指標(biāo)，良好的底物耐受性可以使酶催化承受更高的底物濃度，提高酶的催化效率和重復(fù)使用能力。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)腈水解酶的固定化重組大腸桿菌可以將1 mol/L 3-氰基吡啶完全催化為煙酸，其底物耐受性和穩(wěn)定性得到顯著提升[20]。

在相同反應(yīng)體系中，分別在磁性固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞反應(yīng)液中添加50～400 mmol/L終濃度的底物，檢測(cè)底物耐受性。結(jié)果如圖5-b所示，隨著底物濃度的升高，游離細(xì)胞酶活力快速降低，在添加100 mmol/L終濃度的底物時(shí)酶活力僅有相對(duì)酶活力的59%，在300 mmol/L終濃度底物下基本完全喪失酶活力。磁性固定化細(xì)胞在200 mmol/L以下隨著底物濃度的升高酶活力逐漸提高，并在200 mmol/L終濃度底物下表現(xiàn)出最高酶活力，然后隨著底物濃度的繼續(xù)升高而逐漸降低。在400 mmol/L終濃度底物下，磁性固定化細(xì)胞仍保留有60%的酶活力。磁性固定化細(xì)胞的底物耐受性比游離細(xì)胞顯著提升。

2.2.6 初始底物濃度對(duì)磁性固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

在相同體系下，分別添加50～400 mmol/L不同初始濃度的底物。結(jié)果如圖5-c所示，50和100 mmol/L的底物在5 min內(nèi)即可完全轉(zhuǎn)化完畢，當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步提高，轉(zhuǎn)化時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，400 mmol/L的底物需要60 min才能完全轉(zhuǎn)化?？紤]到轉(zhuǎn)化效率，后續(xù)批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸實(shí)驗(yàn)采用200 mmol/L終濃度的底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.3 磁性固定化細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化

每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化10批次后殘余酶活力約為初始酶活力的20%，產(chǎn)物抑制較為明顯。因此每轉(zhuǎn)化10批次，通過(guò)磁場(chǎng)分離磁性固定化細(xì)胞與產(chǎn)物，對(duì)固定化細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)使用結(jié)果如圖6所示。

a-磁性固定化細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性；b-磁性固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的底物耐受性；c-初始底物濃度對(duì)磁性固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響圖5 磁性固定化細(xì)胞的性能評(píng)價(jià)Fig.5 Performance evaluation of magnetically immobilized cells

圖6 磁性固定化細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸Fig.6 Batch conversion of magnetic immobilized cells to produce nicotinic acid

前10個(gè)批次3-氰基吡啶可以在8 min之內(nèi)轉(zhuǎn)化完畢，第11～20批次底物能夠在15 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，第21～30批次底物能夠在20 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，并檢測(cè)不到底物殘留，最終煙酸累積質(zhì)量濃度達(dá)到738.66 g/L，是目前已有報(bào)道的B.subtilis腈水解酶生產(chǎn)煙酸的最高水平。據(jù)報(bào)道，DONG等[21]對(duì)腈水解酶產(chǎn)生菌惡臭假單胞菌CGMCC3830進(jìn)行復(fù)合固定，該固定化細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化14批次3-氰基吡啶，并積累煙酸達(dá)418 g/L。

經(jīng)過(guò)酶活力測(cè)定，在轉(zhuǎn)化30批次底物后，磁性固定化細(xì)胞仍然保留40%酶活力，而游離細(xì)胞僅能完成一輪批次轉(zhuǎn)化，酶活力就顯著喪失。和游離細(xì)胞相比，磁性固定化細(xì)胞對(duì)3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化速率大大提升，前期是游離細(xì)胞的3.75倍。通過(guò)磁場(chǎng)快速分離產(chǎn)物后轉(zhuǎn)入新的體系仍能繼續(xù)進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化，最終累積生成煙酸濃度是游離細(xì)胞的2.5倍。

3 結(jié)論

本文分別使用分批培養(yǎng)、恒速補(bǔ)料培養(yǎng)以及恒pH培養(yǎng)等不同策略對(duì)重組腈水解酶產(chǎn)生菌B.subtilispMA5-NITR進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。其中恒pH培養(yǎng)的策略效果最佳，重組菌最高OD600為58.85，是分批培養(yǎng)的3.05倍；最高酶活力為167.32 U/mL，是分批培養(yǎng)的2.64倍。靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度5 g/L、反應(yīng)溫度30 ℃、pH 7.2是重組腈水解酶的最佳磁性固定化條件。相較于游離細(xì)胞，磁性固定化細(xì)胞的底物耐受性明顯提升。按照200 mmol/L的批次底物投料濃度，磁性固定化細(xì)胞能在450 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化30批次底物，煙酸累積質(zhì)量濃度達(dá)到738.66 g/L，是目前報(bào)道的B.subtilis腈水解酶生產(chǎn)煙酸的最高水平，并且轉(zhuǎn)化完畢后仍能保留40%的酶活力。本研究對(duì)于提升腈水解酶轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸的工藝經(jīng)濟(jì)性具有重要意義，有望為其潛在工業(yè)應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。