金盆柚不同成熟度對(duì)湘柑茶品質(zhì)的影響

戚賀亭，潘兆平，李想，劉倩，王琛，于洋，廖艷芳，付復(fù)華*

1(湖南大學(xué) 研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙，410125)2(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙，410125)3(果蔬貯藏加工及質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙，410125)4(湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地，湖南 長(zhǎng)沙，410125)

柑橘果茶是一種將柑橘果肉掏空，晾干之后填入茶葉，后經(jīng)風(fēng)干收縮而成的復(fù)合果茶，如柑普茶、柑白茶和檸檬紅茶等。近年來(lái)，由于其潛在的健康效應(yīng)和獨(dú)特的口感，越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。湘柑茶是利用湖南豐富的柑橘和茶葉資源，采用湖南主要栽培的特色柑橘品種的柑皮與安化天尖茶為原料，經(jīng)過(guò)挖果、填茶、殺青、干燥等工藝加工而成的一種“湘式”新茶飲。柑橘果茶的柑殼和陳皮原料近似，陳皮根據(jù)果實(shí)成熟度的不同又可以分為青皮、微紅皮和大紅皮。ZHANG等[1]利用代謝組學(xué)對(duì)廣陳皮不同成熟期化學(xué)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的黃酮類物質(zhì)、檸檬苦素、生物堿和酚酸的含量不同。青皮在預(yù)防心腦血管疾病、抗癌抗腫瘤方面效果更佳，而大紅皮具有更加明顯的抑菌、消炎、止咳等生理活性[2]。香氣成分是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，新會(huì)柑普茶的不同成熟度的茶枝柑制得的柑普茶的風(fēng)味物質(zhì)存在顯著差異[3]。綜上所述，不同的成熟度的柑果對(duì)柑橘茶的品質(zhì)有很大的影響。

頂空氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)是一種基于氣相色譜和離子遷移譜技術(shù)的新技術(shù)，其可以檢測(cè)未經(jīng)預(yù)處理的液體或固體樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜，從而更完整地保存樣品的風(fēng)味。由于儀器對(duì)具有高負(fù)電性或強(qiáng)質(zhì)子親和性官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的識(shí)別具有較高的靈敏度，因此利用氣相色譜和離子遷移譜技術(shù)的新技術(shù)分析食品風(fēng)味物質(zhì)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。此外，由系統(tǒng)生成的指紋可以更直觀、方便地觀察樣品間的差異。近年來(lái)，HS-GC-IMS被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域的揮發(fā)性化合物分析，如中藥[4]、蜂蜜[5]、覆盆子酒[6]等。然而，GC-IMS儀器無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定揮發(fā)成分含量。因此，將IMS與其他設(shè)備相結(jié)合能夠增強(qiáng)其優(yōu)勢(shì)，以便對(duì)香氣進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。氣味活性值(odor activity value，OAV)計(jì)算被廣泛應(yīng)用于食品中關(guān)鍵氣味活性化合物的篩選和鑒定[7]。常用的揮發(fā)性有機(jī)物測(cè)定方法是頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜(head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，它可以根據(jù)保留指數(shù)進(jìn)行比較鑒定，通過(guò)加入內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。據(jù)此，可以進(jìn)一步進(jìn)行OAV計(jì)算，篩選出關(guān)鍵香氣化合物。到目前為止，還沒(méi)有涉及柑橘果茶中的香氣成分OAV值的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次以金盆柚和天尖茶為原料制備湘柑茶，研究不同成熟度的金盆柚制備的果茶的加工品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、感官評(píng)價(jià)等，同時(shí)通過(guò)HS-GC-IMS技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析湘柑茶香氣品質(zhì)，并采用主成分分析對(duì)湘柑茶品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為消費(fèi)者對(duì)不同成熟度的柑橘制備的湘柑茶的選擇比較和產(chǎn)品推廣等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒(méi)食子酸、蘆丁、柚皮苷(均為標(biāo)準(zhǔn)品)，成都曼思特生物科技有限公司；橙皮苷(標(biāo)準(zhǔn)品)，美國(guó)MCE公司；氫氧化鈉、環(huán)己酮、碳酸鈉、亞硝酸鋁、亞硝酸鈉(均為分析純)，甲醇(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

金盆柚，湖南省岳陽(yáng)縣惠泰云有限公司；天尖茶，湖南省白沙溪茶廠有限責(zé)任公司。采用未成熟、半成熟、完全成熟的金盆柚果實(shí)與天尖茶葉進(jìn)行制備湘柑茶。樣品名稱和具體原料信息見(jiàn)表1。

表1 湘柑茶信息表Table 1 Information sheet on Xianggan teas ingredients

1.2 儀器與設(shè)備

DE-500 g型多功能粉碎機(jī)，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；DHG-9053A型鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；E1204-IC型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；Acquity超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Color Quest XE型全自動(dòng)色度分析儀，美國(guó)Hunter Lab公司；Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀：內(nèi)置500 V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度、300 MBq輻射氚、5 kV 漂移電壓、98 mm遷移管的IMS標(biāo)準(zhǔn)模塊，F(xiàn)S-SE-54-CB-1氣相色譜多毛細(xì)管柱(15 m×0.53 mm×0.2 μm)，德國(guó)G.A.S公司；6890 N-5973型氣相色譜質(zhì)譜儀(NIST08譜庫(kù))，美國(guó)Agilent公司；二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/PDMS，50/30 μm，65 μm)，德國(guó)默克公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 湘柑茶待測(cè)樣品的制備

湘柑茶制備：將采摘的金盆柚新鮮柑果用清水洗凈后從頂部開(kāi)蓋，挖出果肉并再次清洗晾干，填充市售的天尖茶至柑果殼3/4高度，蓋上頂蓋，85 ℃殺青2 h后轉(zhuǎn)45 ℃烘干。每隔30 min對(duì)湘柑茶進(jìn)行稱重，直到湘柑茶質(zhì)量不變?yōu)橹埂?/p>

待測(cè)樣制備：將每種湘柑茶成品分成A、B、C 3組：A組取湘柑茶的柑皮液氮輔助下進(jìn)行研磨，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩并混合均勻，錫箔袋封口后放在15 ℃下貯藏待進(jìn)行柑皮相應(yīng)理化指標(biāo)的測(cè)定；B組取整個(gè)成品進(jìn)行液氮研磨，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩并混合均勻，錫箔袋封口后放在15 ℃下貯藏待進(jìn)行香氣成分的測(cè)定；C組成品用來(lái)測(cè)定色度和進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 加工特性

湘柑茶的加工特性包括原料果皮厚度、挖果難易程度、成品湘柑茶形態(tài)，具體評(píng)價(jià)表如下。

表2 湘柑茶加工特性評(píng)價(jià)表Table 2 Evaluation table of processing characteristics of Xianggan teas

1.3.2.2 色度

用色度分析儀測(cè)定湘柑茶柑皮的色澤，記錄L*值、a*值和b*值取平均值。其中L*值為樣品的亮度值，a*值為紅綠值，b*值為黃藍(lán)值。

1.3.2.3 總黃酮含量

參考SN/T 4592─2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》中的分光光度法測(cè)定。取1.3.1中的A組1 g待測(cè)樣品加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇50 mL，40 ℃超聲提取50 min后，濾入100 mL容量瓶中。重復(fù)過(guò)濾2次，合并濾液待測(cè)。吸取2.0 mL樣品溶液，用氫氧化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%)補(bǔ)充至5.0 mL，加1 mL硝酸鈉(50 g/L)，搖勻，放置6 min，加入1.5 mL硝酸鋁(100 g/L)，搖勻，放置6 min，加入4 mL 氫氧化鈉(200 g/L)，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。結(jié)果以每克樣品中蘆丁質(zhì)量表示。

1.3.2.4 總酚含量

采用福林-酚法[8]測(cè)定。取1.3.1中的A組1 g待測(cè)樣品加10 mL甲醇，50 ℃超聲處理30 min，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液于容量瓶中，殘?jiān)?0 mL甲醇重復(fù)提取2次，合并上清液，用甲醇定容至50 mL，待測(cè)。吸取2 mL待測(cè)液于10 mL刻度比色管中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL福林酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL碳酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)，將樣品放入45 ℃的水浴鍋反應(yīng)15 min，取出樣品后充分搖勻，在765 nm處測(cè)其吸光度值。

1.3.2.5 橙皮苷和柚皮苷含量

采用UPLC法[9]測(cè)定。樣品預(yù)處理：取1.3.2.3中制備的待測(cè)液，過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)。

UPLC條件：Waters Acquity UPLC BEH Cis鍵合色譜柱(180 mm×2.1 mm×1.7 pirn)；流動(dòng)相：甲醇(流動(dòng)相A)，水(流動(dòng)相B)；洗脫條件：采用梯度洗脫，0～3 min，40%～45%流動(dòng)相A；3～7 min，45%～40%流動(dòng)相A；7～50 min，40%流動(dòng)相A。流速0.15 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；橙皮苷、柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=23 689x-41 965,R2=0.996 7；y=23 681x-69 798,R2=0.997 6。

1.3.2.6 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測(cè)定

(1)HS-GC-IMS檢測(cè)條件

頂空孵化溫度80 ℃，孵化時(shí)間20 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。載氣為高純氮?dú)?≥99.999%)，色譜柱溫度60 ℃，色譜運(yùn)行時(shí)間30 min，載氣的流速梯度設(shè)置為2 mL/min保持2 min，在20 min內(nèi)線性增至100 mL/min后保持10 min。頂空進(jìn)樣針溫度85 ℃、進(jìn)樣量100 μL。

(2)HS-GC-MS檢測(cè)條件

參照遵循呂海鵬等[10]的方法，稍作修改。如下：

頂空-固相微萃?。喝組6 g待測(cè)樣品移入20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入4 mL飽和氯化鈉溶液和10 μL的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮(50 mg/L，乙醇稀釋)后，立即用聚四氟乙烯隔墊密封，60 ℃水浴平衡5 min，頂空萃取30 min后，插入老化好的萃取頭，在250 ℃的氣相色譜進(jìn)樣器中無(wú)分裂解吸5.5 min。

J&W DB-5石英毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至125 ℃保持3 min，然后以2 ℃/min升至180 ℃保持3 min，最終在15 ℃/min時(shí)增至230 ℃保持6 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z35～550。

通過(guò)質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)NIST 08文庫(kù)的保留指數(shù)比較，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算揮發(fā)性化合物的含量。

1.3.2.7 感官評(píng)價(jià)

對(duì)制備的3種湘柑茶樣品進(jìn)行10 s沸水洗茶后，以1∶50(g∶mL)用煮茶器煮茶20 min后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。組成20人評(píng)定小組(男女各10人)，對(duì)湯色(20分)，香氣(30分)，滋味(30分)和形態(tài)(20分)進(jìn)行評(píng)定，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 湘柑茶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criteria of Xianggan teas

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

以T1、T2、T3 3種湘柑茶樣品的理化指標(biāo)和關(guān)鍵香氣成分作為樣本單元進(jìn)行主成分分析；采用SPSS 20.0對(duì)湘柑茶的理化指標(biāo)進(jìn)行ANOVA方差分析(P<0.05表示差異顯著)，采用Origin 2020作圖；OAV值的計(jì)算參考PANG等[11]的方法；所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

HS-GC-IMS數(shù)據(jù)使用LAV(Laboratory Analytical Viewer)軟件進(jìn)行，使用內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析；Reporter插件直接對(duì)樣品進(jìn)行二維圖譜差異性對(duì)比；Gallery Plot插件程序構(gòu)建揮發(fā)性指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘柑茶的加工特性

如圖1所示，湘柑茶的加工品質(zhì)中果皮的厚度是T2最適宜，太薄會(huì)在干燥過(guò)程中變脆，產(chǎn)生裂紋，太厚則不利于茶葉填充。隨著金盆柚成熟度的增加，囊衣與果皮結(jié)合越松散，越容易挖果。3種樣品的湘柑茶形態(tài)表面均光滑，形態(tài)良好。加工品質(zhì)總分最高的是T3，達(dá)74.8分。

圖1 加工特性雷達(dá)圖Fig.1 Processing characteristics radar chart

2.2 湘柑茶外型及色度

湘柑茶外型為圓型，外部是柑皮殼，內(nèi)里為茶葉，頂蓋開(kāi)口。其色澤是最直觀的外部體現(xiàn)，在一定程度上影響消費(fèi)者的選擇。柑橘在制備湘柑茶的過(guò)程中會(huì)發(fā)生柑皮顏色的變化，不同的成熟度的柑橘制備的湘柑茶具有顯著區(qū)別。不同成熟度柑橘制備的湘柑茶外型如圖2所示，各色澤值的比較見(jiàn)圖3。

湘柑茶的體積隨著柑橘的成熟度的增加逐漸增大，T1最小，T2適中，T3最大，這與柑橘新鮮果實(shí)的大小一致。L*是明度指數(shù)，表示色彩的明暗度，由圖3可知,T3的L*值高于其他樣品，T1次之。a*值為呈色物質(zhì)的紅綠值，正值時(shí)表示紅色程度，負(fù)值時(shí)表示綠色程度[9]。T1的a*值為負(fù)值，偏向綠色，與其他樣品差異顯著(P<0.05)；T2的a*值小于T3，且均為正值，即代表顏色偏向紅色。b*值為黃藍(lán)值，從黃(+b*)到藍(lán)(-b*)漸變，湘柑茶的b*均為正值，代表偏黃，且T3最偏黃。上述色度與圖2的T1感官顏色為綠色，T2為暗橘色，T3為橘黃色相符。

圖2 湘柑茶樣品Fig.2 Sample of Xianggan tea

圖3 不同湘柑茶的色度Fig.3 The color of different Xianggan tea

2.3 總黃酮和總酚的含量

總黃酮(total flavonoid, TF)和總酚(total phenols, TP)是自由基清除劑，可以預(yù)防心血管疾病，能夠抗炎癥、降低血脂、血糖等。由圖4可知，柑皮中TF含量隨著柑橘的成熟逐漸降低，其中T1中TF含量最高為9.2 mg/g，相比其他樣品較為顯著(P<0.05)。這與施學(xué)驕[12]發(fā)現(xiàn)隨著酸橙果實(shí)成熟度增加，總黃酮含量均呈現(xiàn)遞減的變化趨勢(shì)一致。湘柑茶中TP的含量均大于7 mg/g，且T2中TP含量最高，T3次之，T1最低。WANG等[13]研究表明，茶枝柑(Citrusreticulata‘Chachi’)果皮中綠原酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸在果皮成熟過(guò)程中積累量分別增加了26.7%、17.2%和31.7%。這些酚類化合物的積累促進(jìn)了TP含量的增加。以采收期為維度，同一柑橘品種中TP的含量隨生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)呈先增加后減少[14]。這與湘柑茶的柑皮的采收時(shí)間不同而導(dǎo)致的TP變化一致。

圖4 總酚和總黃酮含量Fig.4 Total phenol and flavonoids content注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 橙皮苷和柚皮苷含量

柑桔皮中黃酮類物質(zhì)種類繁多, 但現(xiàn)今分離提取主要集中在其中的橙皮苷和柚皮苷上；同時(shí), 這2種物質(zhì)是所有柑桔屬植物的果皮中含量最大的生物活性成分[15]。在本研究中，以金盆柚為原料的同一類型湘柑茶中柚皮苷的含量均大于橙皮苷。其中，由圖5可知，隨著金盆柚采摘的成熟度逐漸增加，湘柑茶中柚皮苷與橙皮苷的差值也越來(lái)越大，在T3中兩者差值達(dá)到最高為15.2 mg/g。這與施學(xué)驕[12]對(duì)5～7月采摘的枳殼的橙皮苷與柚皮苷的關(guān)系的分析相同。除此之外，湘柑茶中橙皮苷含量隨著原料成熟度增大呈下降趨勢(shì)，且含量均大于3.5 mg/g，滿足《中華人民共和國(guó)藥典》[16]規(guī)定陳皮的入藥級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。然而，柚皮苷的含量則呈相反趨勢(shì)，T1中柚皮苷的含量(15.6 mg/g)遠(yuǎn)低于T2(19.4 mg/g)和T3(20.6 mg/g)。酸橙隨著果實(shí)成熟度的增加，柚皮苷的含量往往也相應(yīng)增加。研究表明，YOO等[17]和WANG等[13]分別發(fā)現(xiàn)日本柚子和茶枝柑果皮中的柚皮苷的含量隨著果實(shí)的成熟而升高，與本研究結(jié)果一致。

圖5 橙皮苷和柚皮苷含量Fig.5 Hesperidin and naringin content

2.5 不同成熟度柑橘對(duì)湘柑茶香氣的影響

2.5.1 HS-GC-IMS分析結(jié)果

2.5.1.1 湘柑茶中香氣化合物的鑒定

用C2～C9的正丁酮至正壬酮作為外標(biāo)參考計(jì)算每種化合物的保留指數(shù)，基于揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜保留時(shí)間和離子漂移時(shí)間對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析。以現(xiàn)有的軟件內(nèi)置NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與IMS漂移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)資料，共鑒定出85個(gè)峰，定性檢出64種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類12種、醛類18種、酯類9種、酮類10種、萜烯類10種、雜環(huán)類4種和硫化物2種(表4)。此外，還檢測(cè)到一些數(shù)據(jù)庫(kù)中未包含的物質(zhì)。一些單一化合物在漂移時(shí)間尺度上具有多重信號(hào)，這可以解釋為分析離子與中性分子(如二聚體和水合物)之間的加合物在IMS漂移管的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中形成。研究表明，這種團(tuán)簇的形成在具有高質(zhì)子親和力的化合物中尤為常見(jiàn)[18]。在本研究中，大多數(shù)醛、烯烴以及α-松油醇、芳樟醇、2-乙基呋喃、乙酸乙酯和乳酸乙酯都有雙峰。

表4 揮發(fā)性成分信息表Table 4 Volatile components information sheet

續(xù)表3

根據(jù)各類揮發(fā)性有機(jī)物的總量，繪制湘柑茶的香氣相對(duì)組成圖。如圖6所示，整體來(lái)看，烯烴(22.3%～29.2%)、醇類(19.3%～27.0%)和醛類(11.3%～15.3%)作為主要的芳香化合物在所有樣品中含量較多。隨著柑橘的成熟度的增加，湘柑茶的香氣中醇類、醛類、酯類、酮類和烯烴組分總量均逐步增加。江津津等[3]發(fā)現(xiàn)未成熟的果實(shí)制備的柑普茶的香氣中雜環(huán)化合物(5.8%)大于相對(duì)成熟的果實(shí)制備的柑普茶(3.4%)，與本研究中湘柑茶中隨著成熟度的提高，由雜環(huán)化合物和硫化物組成的其他組分香氣總量逐漸降低相一致。

圖6 湘柑茶的香氣相對(duì)組成Fig.6 The aroma of Xianggan tea is relatively composed

2.5.1.2 樣品間直觀差異性對(duì)比

采用風(fēng)味分析儀的Reporter插件程序生成二維譜圖(圖7)，以便對(duì)樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行比較?？v坐標(biāo)表示保留時(shí)間，橫坐標(biāo)表示漂移時(shí)間，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰(reaction ion peak，RIP)，RIP兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表1種揮發(fā)性有機(jī)物。選擇以T1樣品的譜圖為參比，可直接比較不同處理果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)差異?？鄢尘昂笙嗤瑵舛鹊幕衔镱伾珵榘咨t色點(diǎn)表示化合物的濃度高于參比樣品，紅色越深表示濃度越高；而藍(lán)點(diǎn)則表示化合物的濃度低于參比樣品，藍(lán)色越深表示樣品濃度越低。由圖7可知，揮發(fā)性物質(zhì)聚集在0～1 000 s，主要分布在漂移時(shí)間1.0～1.5 ms。不同湘柑茶具有相似的揮發(fā)性物質(zhì)，但是濃度明顯不同。隨著成熟度的增加，湘柑茶的揮發(fā)性有機(jī)物的濃度逐漸降低，主要呈藍(lán)色。不同成熟度制備的湘柑茶的揮發(fā)性有機(jī)物可通過(guò)HS-GC-IMS技術(shù)很好地分離，且可直觀識(shí)別不同處理的揮發(fā)性物質(zhì)的差異。

圖7 湘柑茶的HS-GC-IMS差異對(duì)比圖譜Fig.7 The HS-GC-IMS differential and comparative map of Xianggan tea

2.5.1.3 揮發(fā)性指紋圖譜分析

由于二維光譜顯示了揮發(fā)性成分的全貌，很難準(zhǔn)確分析圖像中的重疊物質(zhì)。因此，根據(jù)所有的信號(hào)峰形成了湘柑茶的指紋圖譜(圖8)。在指紋圖譜中，每一行代表同一樣品的所有揮發(fā)性峰，每一列代表同一物質(zhì)在不同樣品中的信號(hào)峰。斑點(diǎn)的顏色從藍(lán)色到紅色不等，表明揮發(fā)性物質(zhì)的濃度從低到高。鑒定出的85個(gè)信號(hào)峰值用它們現(xiàn)有名稱進(jìn)行標(biāo)記，數(shù)字代表IMS數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的未知物質(zhì)。

圖8 基于HS-GC-IMS的湘柑茶的指紋圖譜Fig.8 The fingerprint of Xianggan tea based on HS-GC-IMS

T1在A區(qū)域內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)的含量比T2、T3多。揮發(fā)性物質(zhì)包括3種酯類：乙酸苯乙酯、乙酸乙酯和丁位辛內(nèi)酯;3種酮類：2-庚酮、2-己酮和2-丁酮，2-正己醇。其中，酯類主要來(lái)源于脂氧合酶途徑和氨基酸代謝，這些化合物大多表現(xiàn)出典型的果味或花味，與水果風(fēng)味的“果香”屬性有關(guān)。2-庚酮、2-己酮和2-丁酮都屬于具有特殊香氣的低碳飽和酮，大量存在于奶酪中[19]。B區(qū)域內(nèi)包括絕大部分的醛類，5種酮類，3種醇類，3種酯類，此外還有2,5-二甲基呋喃和2-乙基呋喃。這些物質(zhì)在T2中的含量均大于其他樣品。幾乎所有的醛類和酮類都被證明是香氣的重要組成部分，醛是次生代謝物，形成于柑橘成熟期間，并提供類似柑橘的水果味道。正己醛、壬醛、青葉醛和癸醛分別是C6、C9或C10醛，起源于多不飽和脂肪酸氧化后的產(chǎn)物被過(guò)氧化物裂解酶裂解的過(guò)程[20]，這是植物產(chǎn)生清香風(fēng)味成分的基本途徑。在水果的主要香氣成分中癸內(nèi)酯具有與桃子、甜牛奶相似的氣味，其生物合成與氧化途徑有關(guān)，如桃子中的β-癸內(nèi)酯、椰子中的γ-辛內(nèi)酯等[21]。金盆柚屬于雜交香橙品種，這是首次在金盆柚制成的衍生品中發(fā)現(xiàn)癸內(nèi)酯。

在指紋圖譜其他區(qū)域，芳樟醇、3-羥基-2-丁酮、三環(huán)烯、檸檬烯、蒎烯、月桂烯和α-水芹烯等化合物在所有樣品中均含量較高。鄭敏[22]研究表明柑普茶的外皮中烯烴類化合物的相對(duì)含量占87%以上，可見(jiàn)大量的萜烯類物質(zhì)在湘柑茶的整體香氣中起著關(guān)鍵作用。糖醛、2-乙?；秽?-甲基丁醛-單體在T3中含量最高，湘柑茶干燥過(guò)程中，呋喃和吡嗪類化合物通過(guò)在美拉德反應(yīng)中脫水脫氧醛糖降解氨基酸而產(chǎn)生[18]。除此之外，揮發(fā)性硫化物是重要的芳香誘導(dǎo)化合物，具有門(mén)檻低、氣味強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛分布于食品中。二甲基硫化物[23]被描述為一種蘆筍、玉米和糖蜜的香氣，被認(rèn)為是一種在低濃度下有益的化合物。湘柑茶中二甲基硫在T2中含量較多，二甲基二硫在T1中含量較多。此外，2-甲基丁醛、3-甲基丁醛是在茶葉加工過(guò)程中產(chǎn)生這些具有麥芽糖氣味的醛，可能是由于其母氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸與偏二羰基化合物的反應(yīng)[24]，如氧化茶多酚或甲基乙二醛。

2.5.2.1 揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定

由表5可知，3種湘柑茶中共檢測(cè)出115種香氣成分，其中酯類6種、醇類21種、酮醛類10種、烯類65種、烷類7種、酚類4種。目前江津津等[3]比較了4種柑橘果茶的揮發(fā)性香氣成分，也僅鑒定出42種揮發(fā)性成分，因此湘柑茶產(chǎn)生的香氣成分種類較其他柑橘制備的柑橘果茶多。香氣成分質(zhì)量濃度總量為T(mén)2>T1>T3。其中，烯類最多，醇類次之(圖9)。

圖9 湘柑茶中揮發(fā)性有機(jī)物的含量Fig.9 The content of volatile organic matter in the Xianggan tea

表5 HS-SPME-GC-MS技術(shù)測(cè)定湘柑茶中揮發(fā)性成分含量Table 5 Determination of volatile components in Xianggan tea by HS-SPME-GC-MS

續(xù)表4

酯類。酯類是柑橘中最重要的風(fēng)味成分之一，其主要來(lái)源于脂氧合酶途徑和氨基酸代謝，與果實(shí)風(fēng)味的果香屬性有關(guān)，其含量通常在成熟后期增加[25]。在6種酯類中，橙花乙酸酯和乙酸香葉酯同時(shí)存在于3種樣品中且含量較高，可見(jiàn)其對(duì)湘柑茶的整體香氣具有重要貢獻(xiàn)。除此之外，每種樣品具有獨(dú)特的酯類，比如醋酸辛酯、鄰氨基苯甲酸芳樟酯和反式-金合歡醇乙酸酯只存在于T2中，4-碳酸異丙苯丙炔酯僅存在于T1中。這些物質(zhì)可以作為它們的獨(dú)特分子標(biāo)記物。

醇類。共檢測(cè)到21種醇類物質(zhì)，其中芳樟醇、α-松油醇、(1R,5R)-香芹醇和樺木醇在所有樣品中均存在。這些醇類成分是湘柑茶在加工過(guò)程中碳?xì)漭葡┖推渌绑w的一系列氧化水合-脫水反應(yīng)形成的。芳樟醇是一種帶有花香的萜類酒精，它可以從香葉醇轉(zhuǎn)化為酶異構(gòu)，進(jìn)而在酸性條件下芳樟醇可降解為α-松油醇[26](B7)。除T1樣品外，4-萜烯醇和桉油烯醇在其余樣品中均存在。這些單萜烯醇是茶樹(shù)產(chǎn)物的主要成分，即萜類醇及其氧化物是微生物發(fā)酵茶如普洱茶中的主要醇類[27]。

酮醛類。在湘柑茶樣品中檢出4種醛(C1～C4)和6種酮(C5～C10)。幾乎所有的醛類和酮類都被證明是影響香氣的重要因素，并且在發(fā)酵過(guò)程中顯著增加。醛類化合物廣泛存在于茶葉中，是構(gòu)成其整體香氣特征的主要揮發(fā)性基團(tuán)之一。T2和T3中醛類含量和種類明顯高于T1。L-紫蘇醛同時(shí)存在于所有樣品中，它來(lái)源于肉桂酸的降解[28]。同樣，3種湘柑茶樣品具有不同的酮類，D-香芹酮是它們的共有化合物。BI等[29]發(fā)現(xiàn)，在熱加工過(guò)程中，D-香芹酮是檸檬烯的氧化產(chǎn)物，可以通過(guò)氧化途徑氧化相應(yīng)不飽和位點(diǎn)，使其含量顯著增加。

烯類。萜類化合物在柑橘果茶的香氣中起著重要的作用。本研究中，共鑒定出65種烯類，其中以單萜類化合物居多，3種湘柑茶中共有的烯類有18種。研究觀察到不同樣品之間烯類物質(zhì)的含量和種類存在顯著差異。其中D-檸檬烯是柑橘中的一種代表性化合物，具有最高的含量(115～300 μg/g)。先前的研究表明，D-檸檬烯作為增味劑，是柑橘類產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)志。在深加工過(guò)程中，D-檸檬烯可能被氧化成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫進(jìn)一步反應(yīng)生成大量產(chǎn)物，如香芹酮、鄰苯三酚和萜烯-4-醇等[28]。

酚類。湘柑茶樣品中含有香芹酚、百里酚、5,6,7,8-四氫-1-萘酚和3-甲基-4-異丙基苯酚這4種揮發(fā)性酚類化合物。香芹酚和百里酚是食品工業(yè)中重要的增味劑，廣泛存在于植物中，是鮮葉茶的重要酚類成分[27]。T2中香芹酚的含量最高達(dá)25.38 μg/g，同樣T3中百里酚的含量最高達(dá)25.86 μg/g。這表明不同的成熟度的金盆柚制備的湘柑茶的香氣具有顯著區(qū)別。

2.5.2.2 關(guān)鍵香氣化合物分析

消費(fèi)者通常通過(guò)風(fēng)味來(lái)判斷食品的可接受性。湘柑茶中揮發(fā)性有機(jī)化合物的氣味活性是決定最終產(chǎn)品質(zhì)量的主要感官特征之一。為了尋找到湘柑茶中關(guān)鍵的香氣化合物，更準(zhǔn)確地確定各自揮發(fā)性成分對(duì)湘柑茶香氣的影響，本實(shí)驗(yàn)采用了采用OAV來(lái)表征各香氣化合物對(duì)主體香氣成分的貢獻(xiàn)，分析探討3種樣品中的關(guān)鍵揮發(fā)性香氣物質(zhì)。OAV的水平可以反映化合物對(duì)樣品特征味道的貢獻(xiàn)。香氣化合物的OAV通過(guò)計(jì)算濃度除以氣味閾值來(lái)計(jì)算[30]。以往的研究表明，OAV>1表示其對(duì)樣品整體香氣的貢獻(xiàn)，OAV越高，化合物的個(gè)體貢獻(xiàn)越大。

由表6可知，湘柑茶的香氣化合物中OAV>1的物質(zhì)有27種。其中，酯類2種、醇類5種、酮醛類6種、烯類12種和酚類2種。其中，具有檸檬香氣的D-檸檬烯的OAV在3種樣品中均大于100，具有最高的香氣貢獻(xiàn)率。其中，除了上文提到的芳樟醇外，具有海桐花香氣的α-松油醇也對(duì)湘柑茶的香氣具有較大影響。(1R,5R)-香芹醇和(1R,5S)-香芹醇是由P450酶對(duì)檸檬烯的6-羥基化所形成的[31]。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，糖苷通過(guò)水解和進(jìn)一步氧化得到這些萜醇及其衍生物，并能提供柑橘茶的花香、甘甜和木香的香氣。酮是各種茶葉樣品中非常重要的香氣物質(zhì)，具有獨(dú)特的花香和木香。由于它們的閾值較低如β-紫羅酮(C10)等，所以極低的含量也可以影響樣品的整體香氣。在OAV>1的12種烯類物質(zhì)中，T1中種類最多達(dá)11種，T2有6種，T3有3種。其中有4種蒎烯的同分異構(gòu)體(D1、D5、D7和D10)具有松節(jié)油氣味。除了檸檬烯外，具有柑橘香的γ-萜品烯和具有丁香香氣的β-石竹烯對(duì)湘柑茶的整體香氣均有較顯著的影響。然而，具有啤酒花香氣的α-律草烯和具有黑胡椒、藹荷似香氣的α-水芹烯僅存在于T1的香氣中。

表6 湘柑茶的關(guān)鍵香氣化合物的OAV值Table 6 OAV values of key aroma compounds in Xianggan tea

續(xù)表6

由此可知，3種湘柑茶中均含有柑橘果茶的主體性香氣成分，但也有各自獨(dú)有的香氣成分，存在特異性差異。

2.6 感官評(píng)價(jià)

由圖10可知，3種湘柑茶沖泡后茶葉形態(tài)良好，柑皮與茶葉包裹較緊密，茶湯均勻。湯色評(píng)分較高的為T(mén)1和T2，其顏色橙紅明亮，T3的湯色則欠亮。香氣評(píng)分最高的湘柑茶為T(mén)2，達(dá)21.6分，其柑橘香、茶香濃郁，優(yōu)雅協(xié)調(diào)，而T3的香氣不足。滋味得分的結(jié)果和湯色一致，T1最高，T2次之，T3最低。T1的滋味醇厚，細(xì)膩?zhàn)虧?rùn)，回味良好。綜合感官得分最高的為T(mén)2，其湯色紅濃明亮，滋味較醇厚，柑橘香、茶香協(xié)調(diào)較良好，口感良好，總分為67.8，其次為T(mén)1，總分達(dá)66.1。

圖10 感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.10 Sensory evaluation radar map

2.7 不同成熟度柑橘制備的湘柑茶品質(zhì)綜合分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一種利用降維技術(shù)將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為主成分的統(tǒng)計(jì)方法，是最重要的降維方法之一。KESEN等[33]通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，不同地理產(chǎn)地的土耳其橄欖油的香氣特征存在明顯差異。本研究采用主成分分析法對(duì)不同成熟度的金盆柚制備的湘柑茶綜合品質(zhì)進(jìn)行分析。

如圖11-a所示，將湘柑茶的加工特性、TF、TP、橙皮苷、柚皮苷、感官評(píng)價(jià)和27種關(guān)鍵香氣化合物(OAV>1)的含量共33個(gè)指標(biāo)進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示，共提取到11個(gè)主成分。第一個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為55.3%，前2個(gè)主成分的特征值均大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到95.07%。T1、T2和T3分別位于第二象限、第一象限和第四象限。不同湘柑茶樣品樣本可以很好地區(qū)分，說(shuō)明其綜合品質(zhì)具有顯著差異。

a-PCA得分圖；b-雙重信息圖圖11 湘柑茶品質(zhì)的主成分分析Fig.11 The principal component analysis from the quality characteristics of Xianggan tea

為了獲得更多細(xì)節(jié)，使用了雙重信息圖(圖11-b)。水平和垂直坐標(biāo)為主成分，每個(gè)向量代表原始特征。向量在主成分上的投影可以表示兩者之間的相關(guān)程度。由圖中可以清楚地看出，這些指標(biāo)對(duì)不同的湘柑茶樣品的影響是不同的。其中TF和烯類香氣物質(zhì)與T1的綜合品質(zhì)呈正相關(guān)，這與它們的含量在T1中最高相一致。同樣，胡椒酮、4-萜烯醇、柚皮苷和加工品質(zhì)等對(duì)T3的綜合品質(zhì)也有顯著貢獻(xiàn)。值得注意的是，TP、感官品質(zhì)和大部分的醇類、酯類、酮醛類均投影在第一象限內(nèi)，構(gòu)成了T2綜合品質(zhì)的重要指標(biāo)。綜上所述，不同指標(biāo)對(duì)湘柑茶綜合品質(zhì)的影響的大小與指標(biāo)的高低相一致，不同成熟度金盆柚制備的湘柑茶綜合品質(zhì)具有顯著差異。

3 結(jié)論

本研究對(duì)不同成熟度的金盆柚制備的湘柑茶進(jìn)行了加工品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、香氣品質(zhì)和感官品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，T3的加工特性最佳，挖果容易且成品形態(tài)良好。T2的感官評(píng)價(jià)最優(yōu)，柑皮和茶葉的香氣協(xié)調(diào)性較好，口感良好，接受度較高。營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)中TF和橙皮苷在T1柑皮中含量最高分別達(dá)9.2和12.49 mg/g，且其含量隨果實(shí)成熟度的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，柚皮苷的變化則呈相反趨勢(shì)；TP在T2中含量最高達(dá)8.4 mg/g，其含量隨成熟度呈先增加后減少的趨勢(shì)。通過(guò)HS-GC-IMS技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析湘柑茶香氣品質(zhì)，分別鑒定出64種和115種香氣成分，主要有烯烴類、酯類，醇類、酮醛類和酚類。通過(guò)OAV計(jì)算，篩選出27種關(guān)鍵香氣化合物，不同湘柑茶中均含有共同的主體性香氣成分如D-檸檬烯、芳樟醇、α-松油醇和β-石竹烯等，但也有各自獨(dú)有的香氣成分，這些化合物具有果香、花香、松柏木香等典型的植物香氣，構(gòu)成了湘柑茶的整體風(fēng)味。最后主成分分析顯示，3種湘柑茶的綜合品質(zhì)存在顯著差異。

湖南是柑橘和茶葉資源大省，湘柑茶對(duì)于聯(lián)合湖南省內(nèi)過(guò)剩的柑橘和茶葉資源，開(kāi)發(fā)柑橘加工新產(chǎn)品提供了參考。由于本實(shí)驗(yàn)僅重點(diǎn)考察了金盆柚的不同果實(shí)成熟度對(duì)湘柑茶綜合品質(zhì)的影響，后續(xù)可進(jìn)一步開(kāi)展加工工藝優(yōu)化和風(fēng)味形成規(guī)律研究，通過(guò)加工過(guò)程實(shí)現(xiàn)對(duì)湘柑茶品質(zhì)的控制，為湘柑茶的規(guī)范生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)支撐。