利用表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯回收大豆蛋白酶解液中多肽的研究

王佳悅，董亞博，付元濤，蘭天，隋曉楠，王歡，江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱，150030)

大豆蛋白作為一種重要的食品成分，是目前最豐富的具有重要商業(yè)價(jià)值的植物蛋白來(lái)源之一，由于其具有顯著的營(yíng)養(yǎng)和功能特性、對(duì)健康的積極作用且低成本容易獲取而被廣泛應(yīng)用于食品加工中[1]。大豆蛋白的生理、功能和營(yíng)養(yǎng)特性對(duì)加工利用具有重要意義，因此通常經(jīng)由化學(xué)、物理和酶處理大豆蛋白以改善其特性[2]。其中，利用酶水解蛋白制備具有多種生物活性功能(抗氧化性[3]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性[4]、降血壓、降膽固醇、細(xì)胞保護(hù)作用[5]等)的蛋白肽受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究。因此，酶法生產(chǎn)大豆蛋白肽已成為功能性食品配料、化妝品和藥品開(kāi)發(fā)中公認(rèn)的工藝[6-7]。蛋白質(zhì)水解物通常是大量肽片段的混合物，因此需要進(jìn)行分離以得到目標(biāo)肽，目前幾種有效的分離肽的技術(shù)包括：高效液相色譜法(HPLC)[8-9]、超濾法[10]、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)[11]。然而，這些技術(shù)在使用中存在一些問(wèn)題，如膜污染、操作繁瑣、成本高等[12]。

表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶中含量最豐富的兒茶素，也是已知的能夠捕獲大多數(shù)活性氧，如超氧化物、單線態(tài)氧、羥基自由基最有效的的茶多酚[13]。同時(shí)，EGCG還因其潛在的抗病毒、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用而引起人們的關(guān)注。流行病學(xué)研究表明，攝入EGCG可以降低心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和肥胖的風(fēng)險(xiǎn)[14]。近年來(lái)，多酚-蛋白質(zhì)相互作用被廣泛研究，即多酚通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)作用絡(luò)合蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及營(yíng)養(yǎng)特性[15]。WEI等[16]研究發(fā)現(xiàn)EGCG和乳球蛋白之間的相互作用改變了乳球蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和生物活性。DING等[17]研究表明，EGCG的加入使大豆蛋白油脂體的穩(wěn)定性顯著提高，并減緩油脂釋放速率。此外，除了形成可溶的絡(luò)合物，多酚與蛋白質(zhì)相互作用也會(huì)形成不可溶的聚集體[18-19]。EGCG與富含脯氨酸的蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[20-21]。

本研究是根據(jù)EGCG與大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)酶解物復(fù)合會(huì)形成不溶性肽聚集物，考察利用EGCG從大豆分離蛋白酶解液(soy protein hydrolysate，SPHs)中回收多肽的作用，并對(duì)大豆多肽與EGCG復(fù)合物性質(zhì)進(jìn)行表征，考察了EGCG濃度和pH值對(duì)總肽提取率的影響，通過(guò)對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能的變化以及抗氧化活性的分析進(jìn)一步評(píng)估回收肽的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI，實(shí)驗(yàn)室自制；EGCG(純度98%)，西安通澤生物技術(shù)公司；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L，2.4 AU/g)，諾維信公司；鹽酸、氫氧化鈉(均為分析純)，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CJJ-6磁力攪拌器，納麗雅有限公司；Eppendorf 5 424R冷凍離心機(jī)，Eppendorf德國(guó)公司；PHS-25數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì)，上海雷磁公司；HH420光合水箱水浴鍋，光合有限公司；2500C高速研磨機(jī)，艾澤拉有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SPI的制備

參考ZHANG等[22]的方法稍加修改。將大豆磨粉過(guò)60目篩，與正己烷混合(質(zhì)量比1∶3)進(jìn)行3次脫脂得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉溶于去離子水中(質(zhì)量比1∶10)，并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0。所得漿液在45 ℃條件下連續(xù)攪拌2 h，并在10 000×g離心30 min后收集上清液。用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.5沉淀蛋白質(zhì)，然后在6 500×g下離心20 min 收集沉淀。將得到的沉淀水洗3次，并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性后冷凍干燥得到大豆分離蛋白粉末。

1.3.2 SPI酶解物的制備

將凍干大豆分離蛋白粉末溶于去離子水中(質(zhì)量濃度為40 g/L)，于50 ℃下加熱攪拌20 min以達(dá)到堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)最適溫度。在SPI溶液中加入Alcalase 2.4 L(質(zhì)量濃度為10 g/L)分別持續(xù)酶解30、60、90 min，并在酶解過(guò)程中用2 mol/L NaOH始終保持SPI溶液的pH為8.5。將所有樣品在85 ℃的水浴中加熱10 min，并立即在冰浴中冷卻至室溫終止反應(yīng)。將酶解后的混合物調(diào)節(jié)pH至中性，然后在3 000×g下離心20 min。將含有大部分大豆分離蛋白酶解物的上清液分離。

1.3.3 SPHs的分子質(zhì)量分布

參考ZHANG等[3]的方法對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。采用島津LC 20 A型高效液相色譜儀利用體積排阻色譜(SEC-HPLC)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector，UVD)，色譜柱為AdvanceBio SEC柱(300 mm×4.6 mm，2.70 μm)。將樣品溶于PBS(0.01 mol/L，pH 7.0)中，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣體積10 μL。流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 7.0)，洗脫速度0.30 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。分別以牛γ-血球蛋白(158 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa)、雞卵白蛋白(44 kDa)、馬肌紅蛋白(17 kDa)和維生素B12(1.35 kDa)作為標(biāo)準(zhǔn)品得到各個(gè)蛋白的保留時(shí)間與相對(duì)分子質(zhì)量間的回歸方程，進(jìn)而計(jì)算大豆蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布。

1.3.4 EGCG沉降SPHs

量取等量SPHs分別調(diào)節(jié)pH值至4.5和7.0，將0、0.05%、0.10%、0.20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EGCG分別加入SPHs溶液(pH 4.5和7.0)中，并在室溫下避光攪拌30 min。隨后，在4 ℃下用去離子水透析24 h后將混合物以10 000×g離心20 min，收集沉淀冷凍干燥后進(jìn)行分析。肽回收率根據(jù)公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：P′為上清液中肽含量，P為SPHs中肽含量。

1.3.5 SPHs-EGCG的紅外光譜分析

參考JIANG等[23]的方法，稱取一定量的SPHs-EGCG復(fù)合物樣品與溴化鉀粉末混合后壓片，兩者配比為1∶100(質(zhì)量比)，紅外光譜儀分辨率設(shè)置為4 cm-1，掃描次數(shù)設(shè)置為32次，掃描波數(shù)譜段范圍設(shè)置為400～4 000 cm-1。隨后用Peakfit 4.12軟件對(duì)譜圖進(jìn)行分析，并通過(guò)積分面積來(lái)計(jì)算肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的百分含量占比。

1.3.6 SPHs-EGCG的表面疏水性分析

使用熒光探針ANS-方法測(cè)量表面疏水[24]。在室溫下用10 mmol/L的PBS稀釋樣品使其質(zhì)量濃度達(dá)0.04～0.2 g/L，將4 mL樣品溶液與20 μL ANS(0.008 mol/L)混合反應(yīng)15 min后置于石英比色皿中進(jìn)行熒光光譜測(cè)定光譜測(cè)定條件設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫寬為5 nm，重復(fù)掃描3次。

1.3.7 SPHs-EGCG的抗氧化活性分析

樣品溶液與等體積的DPPH原液(0.20 mmol/L，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液)混合。室溫下在黑暗中孵育30 min后，用酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200酶標(biāo)儀，Tecan Inc.，Maennedorf，Switzerland)在517 nm處測(cè)量混合物的吸光度?？瞻子靡掖即鍰PPH溶液，對(duì)照用乙醇代替樣品溶液。根據(jù)公式(2)計(jì)算自由基清除率：

(2)

式中：A樣品，A空白，A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照品的吸光度。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)至少需要進(jìn)行重復(fù)3次。采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，當(dāng)P<0.05時(shí)為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPHs的分子質(zhì)量分布分析

通過(guò)排阻色譜測(cè)定的SPHs分子質(zhì)量分布如表1所示。未進(jìn)行酶處理的樣品中，主要成分為分子質(zhì)量為5～10 kDa的肽或蛋白小分子，占比85.33%；分子質(zhì)量>10 kDa的肽含量占13.63%，此時(shí)分子質(zhì)量為1～5 kDa內(nèi)未發(fā)現(xiàn)肽。隨著酶解時(shí)間的增加，分子質(zhì)量>10 kDa的肽含量逐漸減少，形成更小的多肽。CHABANON等[25]研究發(fā)現(xiàn)油菜籽蛋白在Alcalase 2.4 L酶解過(guò)程中，隨著水解度的增加，完整的蛋白或大分子質(zhì)量的多肽(>10 kDa)逐漸消失，形成更小的多肽。在酶解時(shí)間60 min及以后，分子質(zhì)量5～10 kDa和分子質(zhì)量<1 kDa的肽含量逐漸下降直至檢測(cè)不到，而中間分子質(zhì)量1～5 kDa的肽含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這說(shuō)明酶解作用在整個(gè)蛋白上，導(dǎo)致中間肽的出現(xiàn)比例很高(96.96%)[26]。

表1 大豆分離蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPHs

2.2 肽回收率分析

不同pH、EGCG添加量、酶解時(shí)間條件下的肽回收率如圖1所示。在pH 4.5、7.0時(shí)，EGCG的加入使蛋白質(zhì)回收率增加且聚集體的量與EGCG的濃度呈正相關(guān)。CHARLTON等[27]表示多酚可以與肽相互作用形成聚集體并從水溶液中沉淀。當(dāng)接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，在pH 4.5的條件下，EGCG更容易沉淀多肽。RAWEL等[28]的研究得到相似的結(jié)論，在牛血清白蛋白(BSA)的等電點(diǎn)附近，阿魏酸與BSA之間的親和力較高。當(dāng)EGCG添加量為為0.20%時(shí)，pH 4.5 的條件下肽的最大回收率為48.3%。在pH 4.5時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加肽回收率呈先降低后升高趨勢(shì)，且加入EGCG的SPHs在30 min時(shí)回收率比其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較高，說(shuō)明EGCG可能與分子質(zhì)量5～10 kDa的肽更易生成沉淀。

A-pH 7.0；B-pH 4.5圖1 不同pH值、EGCG添加量、酶解時(shí)間的條件下肽回收率Fig.1 Peptide recovery rate under different pH value, EGCG concentration and enzymolysis time

2.3 SPHs-EGCG紅外光譜分析

表2展示了不同pH條件下生成的SPHs-EGCG復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，無(wú)論EGCG添加量為多少，SPHs-EGCG復(fù)合物的α-螺旋和β-折疊含量?jī)H發(fā)生輕微的變化。當(dāng)pH值調(diào)為4.5時(shí)，隨著EGCG量的增加，SPHs-EGCG復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)出α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量升高，β-折疊含量降低的現(xiàn)象。與ZHOU等[13]研究一致，EGCG的加入改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量升高，β-折疊含量降低。β-折疊含量的降低表明EGCG與蛋白質(zhì)的結(jié)合可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)肽鏈與多酚相互作用后發(fā)生松動(dòng)，蛋白質(zhì)被拉伸。同時(shí)，KANAKIS等[29]報(bào)道多酚可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，主要體現(xiàn)在α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量的增加，與本研究結(jié)果一致。

表2 SPHs-EGCG的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 2 Secondary structure content of SPHs-EGCG

2.4 SPHs-EGCG表面疏水性分析

蛋白質(zhì)表面疏水性的變化將明顯影響蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)，而界面性質(zhì)在穩(wěn)定食品配方(如分散劑、泡沫和乳劑)方面起著重要作用[30]。因此蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)的暴露(蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的指示)使用熒光探針(ANS)的信號(hào)增強(qiáng)進(jìn)行測(cè)量。圖2為不同EGCG添加量、不同pH值條件生成的SPHs-EGCG復(fù)合物的表面疏水性。由圖2可知，EGCG的加入可使蛋白質(zhì)的表面疏水性降低，且EGCG的添加量和蛋白質(zhì)表面疏水性值成反比。這可以歸因于酚類化合物內(nèi)部的極性基團(tuán)，EGCG引入的親水性羧基和羥基對(duì)蛋白質(zhì)的疏水性產(chǎn)生了負(fù)面影響[28]。此外，SPHs-EGCG表面疏水性的降低可能是由于EGCG交聯(lián)蛋白中一些埋藏在肽鏈內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，降低了熒光探針結(jié)合位點(diǎn)的可及性,由此也改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[31]。此外。在EGCG添加量相同的條件下，pH 4.5的表面疏水性高于pH 7.0，表明SPHs-EGCG在酸處理期間的暴露出疏水基團(tuán)，表面疏水性增加。酸性pH處理促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性顯著增加[32]。

圖2 不同pH值、EGCG添加量條件下SPHs-EGCG表面疏水性Fig.2 Surface hydrophobicity of SPHs-EGCG at different pH value and EGCG concentration

2.5 SPHs-EGCG抗氧化能力分析

自由基清除能力是使用酚類化合物作為功能性添加劑的食品貨架穩(wěn)定性以及對(duì)健康有益的重要指標(biāo)。本文采用DPPH自由基清除法檢測(cè)SPHs-EGCG，SPHs的抗氧化活性。如圖3所示，未結(jié)合EGCG的SPHs具有20%～40%的自由基清除率，而SPHs的抗氧化活性歸因于其組成部分多肽的抗氧化活性[33]。此外，SPHs清除DPPH自由基的能力隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而提高?？寡趸芰Φ奶岣呤怯捎诖蠖沟鞍姿夂蟊┞读穗[藏的氨基酸殘基和具有抗氧化能力的側(cè)鏈(通常隱藏在蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)中)[34]。YAN等[35]的研究表明EGCG通過(guò)范德華力和疏水相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，保護(hù)其復(fù)合物免受降解，從而提高其抗氧化特性并提高生物利用度，與該研究結(jié)果一致。隨著EGCG添加量的增加，SPHs-EGCG復(fù)合物呈現(xiàn)出更高的抗氧化活性，這是由于EGCG的加入引入了許多酚羥基或者與多肽的協(xié)同作用[16]。

A-pH 7.0；B-pH 4.5圖3 SPHs-EGCG的自由基清除能力Fig.3 DPPHs scavenging ability of SPHs-EGCG

3 結(jié)論

本研究考察了利用EGCG從大豆分離蛋白酶解液中回收多肽的作用，并對(duì)大豆多肽與EGCG復(fù)合物性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在大豆分離蛋白酶解物中，隨著酶解時(shí)間的增延長(zhǎng)，中間肽的出現(xiàn)比例增加(96.96%)。EGCG的加入使多肽回收率增加，且聚集體的量與EGCG的添加量呈正相關(guān)。隨著酶解時(shí)間的添加量，肽回收率先降低后升高，且在30 min時(shí)回收率最高，表明EGCG可能與分子質(zhì)量5～10 kDa的肽更容易生成沉淀。通過(guò)紅外光譜分析，EGCG的加入使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量升高，β-折疊含量降低。EGCG的加入會(huì)降低蛋白質(zhì)的表面疏水性，且EGCG的添加量與蛋白質(zhì)表面疏水性值成反比。通過(guò)DPPH自由基清除法檢測(cè)證明EGCG添加量的增加會(huì)提高SPHs-EGCG復(fù)合物的抗氧化活性。