陽春砂根莖多糖分離純化、結構表征及抗氧化活性

周洋，楊得坡,2，錢純果，何翠淇，鐘鏡堂，徐新軍,2，趙志敏,2*

1(中山大學 藥學院，廣東 廣州，510006)2(廣東省現(xiàn)代中藥工程技術研究開發(fā)中心，廣東 廣州，510006)3(廣東呀依山珍稀藥材種植有限公司，廣東 河源，517428)

砂仁為姜科植物陽春砂(AmomumvillosumLour.)、綠殼砂(AmomumvillosumLour.varxanthioidesT.L.Wu et Senjen)或海南砂(AmomumlongiligularT.L.Wu)的干燥成熟果實。藥理學研究證實，砂仁具有多種生物學活性，如：抗炎、抑菌、調節(jié)菌群、降血糖和抗氧化等[1]。其中陽春砂仁是砂仁的主要來源，為藥食同源藥材，需求量大。陽春砂為多年生草本植物，需每周期更新種植，以提升砂仁產(chǎn)量和品質，因此產(chǎn)生大量的陽春砂植株，這些植株大多被隨意丟棄或焚燒，對環(huán)境造成一定污染。造成這種現(xiàn)象的原因是目前國內(nèi)外關于陽春砂的研究多集中于種子團及其中的揮發(fā)油，對其他部位和其他成分的研究較少，陽春砂未能得到充分開發(fā)利用。尤小梅等[2]比較了陽春砂仁根和葉水提物的抗氧化活性，水提物對羥自由基清除率最高可達100%，活性大小依次為：根>葉>茶多酚。多糖是水提物中的一類重要物質，關于陽春砂根莖多糖(Amomumvillosrmrhizome polysaccharide，AVRP)的研究未見報道。

多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物，具有廣泛的生物活性，如：抗氧化[3]、免疫調節(jié)[4]、抗腫瘤[5]和降血糖活性[6]等。天然多糖因具有良好的生物活性和無毒性、良好的生物降解性和生物相容性等特點，成為目前國內(nèi)外研究的熱點。關于陽春砂多糖的研究較少，且多聚焦于陽春砂仁粗多糖的提取方法和生物活性[7-9]，關于陽春砂除果實外其他部位多糖的研究未見報道。

本研究通過對AVRP進行分離純化、結構特征及抗氧化活性的研究，旨在為充分利用陽春砂打下基礎，為AVRP的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：新鮮陽春砂根莖(經(jīng)鑒定為陽春砂)，廣州市從化區(qū)藥材基地；

實驗試劑：單糖標準品和三氟乙酸，美國Sigma-Aldrich公司；DEAE-52和Sephadex G-100填料，索萊寶公司；濃硫酸，廣州市梓興化玻儀器有限公司；氫氧化鈉，廣州化學試劑廠；苯酚，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

EYELA N-1100旋轉蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,FT-IR)光譜儀，美國Perkin-Elmer公司；SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀(配ELSD-LT 2蒸發(fā)光檢測器)，日本島津公司；FLUOstar Omega全自動多功能酶標儀，德國BMG Labtech公司。

1.3 AVRP的提取

稱取200 g粉碎后的陽春砂根莖粉末，加入4 L 95%(體積分數(shù))乙醇，80 ℃回流提取3 h，重復操作3次，將粉末烘干，得陽春砂根莖脫脂粉末。200 g陽春砂根莖脫脂粉末加4 L水，95 ℃提取3 h，重復3次，將水提液于60 ℃下減壓濃縮，得濃縮液。向濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，于4 ℃靜置12 h，離心收集沉淀。將沉淀復溶于去離子水中，得多糖溶液，向溶液中加入4倍體積的Sevage試劑(氯仿-正丁醇體積比4∶1)，劇烈振蕩后離心，取上清液，重復操作，直至溶液中無變性蛋白質，凍干后得AVRP。

1.4 AVRP的分離純化

稱取AVRP 100 mg，配制成質量濃度為20 mg/mL的溶液，經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱分離，依次用濃度為0、0.1、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，10 min/管，使用全自動餾分收集器收集，苯酚-硫酸法進行監(jiān)測，得到0和0.1 mol/L NaCl洗脫下的2個組分，收集含量更多的0.1 mol/L NaCl溶液洗脫下來的組分，60 ℃減壓濃縮，用截留分子質量為3 500 Da的透析袋透析，冷凍干燥得AVRPD-1。

取AVRPD-1粉末20 mg，配制成5 mg/mL的溶液，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱分離，去離子水洗脫，洗脫流速為3 mL/10 min，洗脫時間為10 min/管，使用全自動餾分收集器收集，苯酚-硫酸法測多糖含量，合并同一組份，經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得到AVRP-1。

1.5 AVRP-1的組分測定

1.5.1 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]測定AVRP-1的總糖含量，葡萄糖為標準品。精確稱取葡萄糖標準品25.0 mg，定容至500 mL，得葡萄糖標準液。分別取葡萄糖標準液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加去離子水補足至1.0 mL，即得不同濃度的標準溶液，加入0.5 mL 60 g/L的苯酚溶液，混勻后緩慢滴加2.5 mL濃硫酸，室溫下靜置30 min，于490 nm處檢測吸光度值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，求出回歸方程。配制質量濃度為0.04 mg/mL的AVRP-1溶液，測定方法同上，重復3次，根據(jù)回歸方程求得總糖含量。

1.5.2 蛋白質含量測定

蛋白質含量測定采用Bradford法[11]，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標準品。精確稱取50.3 mg考馬斯亮藍G250，溶于25 mL 90%(體積分數(shù))乙醇溶液中，加入85%(體積分數(shù))磷酸溶液55 mL，定容至500 mL，濾紙過濾后存于棕色試劑瓶中，得考馬斯亮藍標準溶液。精確稱量10.0 mg BSA溶于100 mL容量瓶中，去離子水定容，得BSA標準溶液。分別取0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL BSA標準溶液于試管中，以去離子水補足至1.0 mL，分別加入考馬斯亮藍溶液1.0 mL，充分混勻，于595 nm處測定其吸光度值。以吸光度值為縱坐標，BSA濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程。配制質量濃度為2.0 mg/mL的AVRP-1溶液，測定方法同上，重復3次，根據(jù)回歸方程求得蛋白質含量。

1.5.3 糖醛酸含量測定

糖醛酸含量測定采用m-間羥基聯(lián)苯法[12]，半乳糖醛酸(galacturonic acid，GalA)為標準品。精確稱取1.191 8 g四硼酸鈉，濃硫酸定容至250 mL，得0.012 5 mol/L四硼酸鈉溶液；精確稱取10.0 mg GalA，去離子水定容至100 mL，得0.1 mg/mL標準GalA溶液；精確稱取75.0 mg間羥基聯(lián)苯，用質量濃度5 g/L NaOH溶液定容至50 mL，得1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液。分別取標準GalA溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于試管中，加去離子水補足至1.0 mL，冰浴中冷卻數(shù)分鐘后，每個試管中加入四硼酸鈉溶液6.0 mL，輕輕振搖，沸水浴中加熱5 min后立即放入冰水浴中冷卻到室溫，加入1.0 mL間羥基聯(lián)苯，振搖混勻后于520 nm處測吸光度。以吸光度值為縱坐標，GalA濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程。配制質量濃度為0.1 mg/mL的AVRP-1溶液，測定方法同上，重復3次，根據(jù)回歸方程求得糖醛酸含量。

1.6 AVRP-1純度鑒定及相對分子質量(Mw)測定

利用高效凝膠滲透色譜法(high-performance gel permeation chromatography，HPGPC)測定樣品純度及Mw。取已知Mw的葡聚糖標準品(5、12、25、50、150、410 kDa)配制成2.0 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進樣，進樣量20 μL，洗脫時間30 min。色譜條件：色譜柱型號為PolySep-GFC-P4000，流動相為水，流速為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測器為ELSD-LT Ⅱ型號的蒸發(fā)光檢測器(SHIMADZU)，檢測器溫度為60 ℃，Gain值為10。以標準葡聚糖Mw的對數(shù)lgMw為縱坐標，保留時間為橫坐標，繪制標準曲線并得到回歸方程。取AVRP-1配制成2.0 mg/mL的溶液，相同條件下進樣，記錄保留時間。根據(jù)樣品峰形鑒定AVRP-1的純度，標準曲線求得Mw。

1.7 AVRP-1單糖組成分析

參照文獻方法[13]，采用HPLC法測定AVRP-1的單糖組成。

混合標準單糖的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone，PMP)衍生化：分別取0.05 mL 2.0 mmol/L單糖標準品：甘露糖(mannose，Man)、鼠李糖(rhamnose，Rha)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcA)、GalA、葡萄糖(glucose，Glc)、半乳糖(galactose，Gal)、木糖(xylose，Xyl)、阿拉伯糖(arabinose，Ara)和巖藻糖(fucose，F(xiàn)uc)溶液于反應管中混合，加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各0.45 mL，混勻后70 ℃反應30 min，冷卻后加入0.46 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，然后加入1.0 mL氯仿溶液，振搖，離心，棄氯仿層，重復3次去除過量的PMP，水層過0.45 μm濾膜后于HPLC檢測。HPLC條件：SHIMADZU高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX XDB-C18柱，波長250 nm，進樣量20 μL，流速1 mL/min，流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.7，A)-乙腈(B)。洗脫梯度為：0～40 min 16% B等度洗脫；40～41 min 16% B降至14% B；41～54 min 14% B等度洗脫;54～55 min 14% B升至16% B;55～70 min 16% B(均為體積分數(shù))等度洗脫。

AVRP-1的衍生化：稱取AVRP-1樣品5.0 mg于耐壓管中，加入3 mol/L TFA溶液2.0 mL，120 ℃水解6 h，冷卻后加入甲醇減壓濃縮至干，重復3次除去多余的TFA，加入0.8 mL去離子水溶解。取0.1 mL完全水解的AVRP-1于反應管中，加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各0.1 mL，混勻后70 ℃水浴反應30 min，冷卻后加入0.105 mL 0.3 mol/L HCl溶液中和，加入0.2 mL去離子水稀釋，然后加入0.6 mL氯仿溶液，振搖，離心，棄氯仿層，重復3次除去過量的PMP，水層過0.45 μm濾膜后于HPLC檢測。

1.8 FT-IR分析

取AVRP-1干燥粉末，使用傅里葉紅外光譜儀在4 000～450 cm-1處進行測定。

1.9 AVRP-1抗氧化活性測定

1.9.1 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻方法[14]，測定AVRP-1的DPPH自由基清除活性。吸取50 μL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液于96孔板中，加入50 μL不同質量濃度(1.0～5.0 mg/mL)的AVRP-1溶液，該組設置為樣品測定組；以無水乙醇代替DPPH乙醇溶液作樣品對照組；以去離子水代替AVRP-1溶液作空白對照組；以維生素C代替AVRP-1溶液作陽性對照組。以上各組混合均勻后，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值。清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白對照組吸光度值；A1為樣品測定組吸光度值；A2為樣品對照組吸光度值。

1.9.2 羥自由基清除能力測定

參照文獻方法[14]，測定AVRP-1的羥自由基清除活性。于96孔板的檢測孔中依次加入8 μL 18 mmol/L FeSO4溶液，8 μL 18 mmol/L水楊酸溶液，52 μL不同質量濃度(1.0～5.0 mg/mL)的AVRP-1溶液，該組設置為樣品測定組；檢測孔中加入8 μL 18 mmol/L水楊酸溶液，60 μL去離子水，該組設置為空白組；檢測孔中加入8 μL 18 mmol/L FeSO4溶液，8 μL 18 mmol/L水楊酸溶液，52 μL去離子水，該組設置為對照組；檢測孔中加入8 μL去離子水，8 μL 18 mmol/L水楊酸溶液，52 μL AVRP-1溶液，該組設置為樣品對照組；以維生素C代替AVRP-1溶液作為陽性對照組。以上組別均加入32 μL 0.1%(體積分數(shù))H2O2啟動反應，靜置30 min，于510 nm處測定吸光值。清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為空白組吸光度值；A1為對照組吸光度值；A2為樣品對照組吸光度值；A3為樣品測定組吸光度值。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism?version 7.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，所有結果均表示為3次重復的平均值±標準差(SD)。

2 結果與分析

2.1 AVRP的分離純化

DEAE-52纖維素柱為陰離子交換柱，使用不同濃度的NaCl溶液作為洗脫液可根據(jù)所帶電荷量強弱程度將樣品分成不同的組分。DEAE-52柱層析洗脫圖如圖1所示。經(jīng)過0、0.1、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，得到2個多糖組分，0和0.1 mol/L NaCl洗脫組分分別命名為AVRPD-0和AVRPD-1，收率分別為5.3%和13.8%。

圖1 AVRP的DEAE-52洗脫曲線Fig.1 Elution curve of AVRP on DEAE-52 cellulose column

凝膠色譜柱是利用分子篩的原理，根據(jù)分子質量大小對樣品進行分離，分子質量大的樣品先流出色譜柱，分子質量小的后流出。選擇含量更高的AVRPD-1進一步分離純化。如圖2所示，AVRPD-1經(jīng)Sephadex G-100純化后，得到單峰，命名為AVRP-1，凍干后得白色粉末，收率為54.7%。

圖2 AVRP-1的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.2 Elution curve of AVRP-1 on Sephadex G-100 column

2.2 AVRP-1的組分測定

如表1所示，AVRP-1的總糖含量為90.34%，蛋白質含量為0.64%，糖醛酸含量為43.59%，說明經(jīng)過Sevage試劑除蛋白和DEAE-52、Sephadex G-100柱層析進行分離純化后，多糖較純。AVRP-1中糖醛酸含量較高，說明AVRP-1是酸性多糖。

表1 AVRP-1的化學組成Table 1 Chemical composition of AVRP-1 n=3)

2.3 AVRP-1純度鑒定及相對分子質量測定

多糖的理化特性和生物活性常與分子質量聯(lián)系起來，如有文獻報道表明，多糖分子質量越大，其免疫調節(jié)活性或抗腫瘤活性越強[15]，但也有些研究者得出相反的結論[16]。這一現(xiàn)象說明影響多糖藥效的因素是多方面的，如單糖組成、糖苷鍵類型、三螺旋結構等，分子質量是其中的主要因素之一。影響多糖分子質量的因素包括產(chǎn)地、采收時間、提取方法和干燥方法等[17-19]。傳統(tǒng)的熱水提取法會導致多糖分子在高溫和長時間提取環(huán)境下聚合，得到分子質量較大的多糖，超聲輔助提取、酶輔助提取等提取方法會降解多糖，得到分子質量較小的多糖[18]。

如圖3所示，AVRP-1只有單一的洗脫峰，且峰型對稱，可以證明AVRP-1為純化多糖。以葡聚糖對照品求得Mw標準曲線，線性回歸方程為y=0.749 4x+10.332，R2=0.997 1，式中y為葡聚糖Mw的對數(shù)，x為保留時間。經(jīng)計算，AVRP-1的Mw為3 372.01 kDa，分子質量較大。

圖3 AVRP-1的HPGPC色譜圖Fig.3 HPGPC chromatogram of AVRP-1

2.4 AVRP-1的單糖組成分析

單糖組成在多糖的生物活性和多糖鑒別等方面起著重要的作用?；旌蠁翁菢藴势泛虯VRP-1的HPLC譜圖分別見圖4-A和圖4-B。通過比對標準單糖的出峰時間可以確定單糖種類，根據(jù)各峰面積比確定單糖的摩爾比。AVRP-1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖這7種單糖組成，摩爾比為4.14∶4.98∶ 5.10∶ 23.77∶ 17.30∶ 28.51∶16.19。

1-Man;2-Rha;3-GlcA;4-GalA;5-Glc;6-Gal;7-Xyl;8-Ara;9-FucA-混合標準單糖；B-AVRP-1圖4 混合標準單糖和AVRP-1的HPLC圖Fig.4 The HPLC spectra of mixed standard monosaccharide and AVRP-1

2.5 FT-IR分析

圖5 AVRP-1的紅外光譜圖Fig.5 The FT-IR spectrum of AVRP-1

2.6 抗氧化能力測定

AVRP-1和維生素C對DPPH自由基的清除活性如圖6-A所示，當多糖質量濃度從1.0增加到5.0 mg/mL時，清除能力逐漸增強，但隨著多糖質量濃度增加，增長趨勢逐漸減小。AVRP-1對DPPH自由基的半數(shù)有效濃度(half-maximal effective concentration，EC50)為4.50 mg/mL。

AVRP-1和維生素C對羥自由基的清除活性如圖6-B所示，當多糖質量濃度從1.0增加到5.0 mg/mL時，清除能力逐漸增強，但隨著多糖質量濃度增加，增長趨勢逐漸減小，之后趨于平穩(wěn)。AVRP-1對羥自由基的EC50為2.47 mg/mL。AVRP-1對羥自由基的清除能力強于對DPPH自由基的清除能力。

從抗氧化能力測定結果來看，AVRP-1的抗氧化能力一般，遠小于維生素C，對羥自由基的清除活性大于對DPPH自由基的清除活性。抗氧化活性強弱通常是多種因素綜合作用的結果，影響多糖抗氧化活性的因素包括：糖醛酸含量、硫酸根含量、分子質量大小、單糖組成和構象等。有大量文獻[25]報道表明，多糖的抗氧化作用與其供氫能力有關，糖醛酸基團的存在會激發(fā)多糖中端基碳的氫原子，糖醛酸含量越高，抗氧化能力越強。AVRP-1中糖醛酸含量較高，推測AVRP-1的抗氧化活性主要來源于糖醛酸。多糖的分子質量越小，抗氧化活性越強，可能是由于大分子質量多糖穿過細胞膜的滲透能力弱，且有研究顯示在相同重量基礎上小分子質量多糖有更多還原羥基末端與自由基反應，因此抗氧化活性提高[26]。比如當多糖采用不同提取方法提取后，微波輔助提取法和超聲輔助提取法會導致多糖降解，分子質量減小，抗氧化活性明顯升高[27]。AVRP-1的分子質量較大，推測這是限制AVRP-1發(fā)揮抗氧化活性的主要因素之一。此外，多糖抗氧化活性還受到單糖組成影響。ZHANG等[26]基于Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)，DPPH自由基清除活性與Ara和Gal含量相關(P<0.05)，亞鐵離子還原能力與Gal含量相關(P<0.05)；基于多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，多糖的金屬螯合能力隨著Xyl和Gal的含量升高而升高。

A-DPPH自由基；B-羥自由基圖6 AVRP-1抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of AVRP-1

3 結論

本研究成功從陽春砂根莖中分離純化了一種主要的多糖組分AVRP-1，并對其結構和抗氧化活性進行了初步研究。結果表明，AVRP-1的總糖含量為90.34%，蛋白質含量為0.64%，糖醛酸含量為43.59%；HPGPC結果顯示AVRP-1是純化多糖，分子質量為3 372.01 kDa；由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Ara這7種單糖組成，摩爾比為4.14∶4.98∶5.10∶23.77∶17.30∶28.51∶16.19。AVRP-1具有抗氧化活性，對DPPH自由基和羥自由基的EC50分別為4.50和2.47 mg/mL。本研究可為AVRP的結構及其活性研究提供技術支持，為進一步開發(fā)利用陽春砂提供理論依據(jù)。