牡蠣過(guò)敏原肌漿鈣結(jié)合蛋白的分離純化和鑒定

程青麗，李國(guó)明，趙曉涵，馮曉文，盧知浩，谷瑞增，魯軍，劉文穎

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

水產(chǎn)品是蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽和維生素的良好來(lái)源，尤其是蛋白質(zhì)含量豐富，是人類攝取動(dòng)物性蛋白的重要食品來(lái)源之一，一直被世界各國(guó)公認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)、美味的放心食品。隨著經(jīng)濟(jì)全球化不斷加深，會(huì)有越來(lái)越多的消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品產(chǎn)生習(xí)慣性消費(fèi)。

然而水產(chǎn)品帶來(lái)的過(guò)敏問(wèn)題也是層出不窮，大多數(shù)的過(guò)敏反應(yīng)屬于Ⅰ型免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。IgE介導(dǎo)的食物過(guò)敏反應(yīng)程度可從輕微的局部癥狀發(fā)展到嚴(yán)重的全身性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為蕁麻疹、呼吸困難、嘔吐、腹痛、心血管衰竭等[1]，食物過(guò)敏已然逐漸成為全球化共性的人類健康問(wèn)題。2008年國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查表明，20%～30%世界人口受食品過(guò)敏的影響，水產(chǎn)品過(guò)敏尤其嚴(yán)重[2-3]，這一數(shù)據(jù)在近幾年仍在持續(xù)增長(zhǎng)。然而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有類似的系統(tǒng)調(diào)查，但有關(guān)食用蝦、魚(yú)、蟹等水產(chǎn)品引起過(guò)敏的報(bào)道很多，有5%的兒童和2%的成年人會(huì)對(duì)某些水產(chǎn)品產(chǎn)生過(guò)敏。臨床研究表明，在我國(guó)食物過(guò)敏患者中，海蝦、河蝦、海蟹的過(guò)敏率分別高達(dá)40.3%、39.0%和37.8%[4-5]。呂相征等[6]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)魚(yú)和海鮮類過(guò)敏者最多,共占36%；貝類和牛奶次之,分別占13.0%和 12.2%。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全中心的調(diào)查也表明，水產(chǎn)品是我國(guó)食品中最主要的過(guò)敏原，并且其所占過(guò)敏原比例逐年增加。

水產(chǎn)品中魚(yú)類和甲殼類動(dòng)物過(guò)敏原研究已經(jīng)較為深入，而對(duì)軟體動(dòng)物過(guò)敏的研究很少，一項(xiàng)有8 600名參與者的問(wèn)卷調(diào)查的顯示，1%的過(guò)敏癥狀與軟體動(dòng)物有關(guān)[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)甲殼類動(dòng)物(蝦、龍蝦和螃蟹)和軟體動(dòng)物(鮑魚(yú)、貽貝、扇貝和牡蠣)之間也有交叉反應(yīng)[8]。因此，很有必要對(duì)軟體動(dòng)物過(guò)敏原開(kāi)展深層次研究。

目前已鑒定出6種貝類過(guò)敏原，包括肌球蛋白(tropomyosin, TM)[9]、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)[10]、肌球蛋白輕鏈[11]、三糖磷酸異構(gòu)酶[12]、和肌漿鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP)[13]。貝類過(guò)敏原在臨床上缺乏研究，而TM是太平洋牡蠣中唯一公認(rèn)的過(guò)敏原[14]。

SCP是具有高親和力性的EF手形Ca2+緩沖液，在骨骼肌中表達(dá)量最高[15]。SCP主要存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中，其致敏性與對(duì)蝦的臨床反應(yīng)性有關(guān)[16]，在各種甲殼類動(dòng)物中構(gòu)成過(guò)敏原[13，17-18]，作用類似于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的小白蛋白，這2種蛋白都在快速抽搐骨骼肌中高水平表達(dá)。在黑虎蝦中，SCP被鑒定為對(duì)蝦過(guò)敏原[13]，在凡納濱對(duì)蝦中其IgE結(jié)合活性在分子水平上得到了證實(shí)[18]。YANG等[19]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，SCP在甲殼類水產(chǎn)中已經(jīng)鑒定出其線性表位和構(gòu)象表位，在軟體類水產(chǎn)中則只做到了基本理化性質(zhì)和特異性IgE結(jié)合分析。重組蛋白比天然蛋白易獲取、純度和穩(wěn)定性更高，在使用重組過(guò)敏原的體內(nèi)診斷過(guò)敏方面也取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[20-22]。本文從分子質(zhì)量、二級(jí)結(jié)構(gòu)方面對(duì)天然SCP和重組SCP進(jìn)行一致性比對(duì)，旨在獲取與天然蛋白過(guò)敏原本質(zhì)無(wú)差別甚至致敏性更強(qiáng)的替代重組體，對(duì)牡蠣中重組SCP的鑒定對(duì)未來(lái)全面研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

太平洋牡蠣，山東威海；硫酸銨、碳酸氫鈉、過(guò)硫酸銨、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)，北京化工廠；EDTA，中國(guó)Biotopped公司；Tris(超純級(jí))、考馬斯亮藍(lán)R-250(超高純)，美國(guó)Amresco公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker，碧云天公司；卡那霉素和異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)，美國(guó)VWR公司；PAS染色試劑盒，北京Solarbio公司。

振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)華美公司；多通道超聲破碎儀，寧波新芝；冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀，美國(guó)BioRad公司；KTA蛋白純化儀，美國(guó)GE Healtheare公司；圓二色(cireular dichroism, CD)光譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)儀，德國(guó)Ultraflextreme公司；UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天然SCP的提取純化

蛋白純化流程主要參考沈苑[23]的方法，并作適當(dāng)修改。取牡蠣閉殼肌，切碎，溶于10倍體積預(yù)冷的緩沖液A(50 mmol/L NaCl，2 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA)中，用高速勻漿機(jī)勻漿，離心(10 500×g，20 min，4 ℃)取上清液；進(jìn)行75%～90%硫酸銨鹽析，離心(10 500×g，40 min，4 ℃)取沉淀。將沉淀溶于少量緩沖液B(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中，并于透析液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，4 ℃)中透析16 h；最后上樣于已用緩沖液B平衡好的HiTrap-Q柱。用緩沖液B洗脫未吸附部分，再用1 mol/L NaCl線性洗脫2 h，流速為0.5 mL/min，收集洗脫部分于-80 ℃凍存，隨后與重組蛋白樣品同步進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析。

1.2.2 重組SCP的誘導(dǎo)表達(dá)

登錄Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站查找太平洋牡蠣SCP氨基酸序列(登錄號(hào)：CGI_10004435)并設(shè)計(jì)完整的基因序列，將其復(fù)制到大腸桿菌表達(dá)的目標(biāo)載體上，本實(shí)驗(yàn)以pET-30a(+)質(zhì)粒構(gòu)建重組載體克隆方案為NdeI-ATG-Sarcoplasmic calcium-binding protein-His tag-Stop codon--HindIII。從超低溫冰箱中取出 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化，加入重組質(zhì)粒(100 ng)，輕輕吹吸充分混勻，冰上放置30 min，水浴鍋42 ℃熱激90 s，冰上放置3 min加入100 μL室溫LB液體培養(yǎng)基，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)60 min，將菌液混勻后涂至卡那霉素抗性平板上。分別挑取3個(gè)單克隆，分別接種到4 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB 試管中，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，向2個(gè)試管中分別加入0.5 mmol/L IPTG，15 ℃培養(yǎng)16 h和37 ℃培養(yǎng)4 h，最后一支試管為陰性參照。

1.2.3 樣品準(zhǔn)備

取450 μL培養(yǎng)基離心后的沉淀，重懸于300 μL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油，pH 8.0)，用超聲破碎儀裂解10 min。

全菌樣品：取100 μL裂解液，與50 μL 5×上樣緩沖液(30%甘油，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS，300 mmol/L Tris，250 mmol/L DTT)混合均勻，100 ℃加熱10 min，15 000 r/min離心5 min。

細(xì)胞裂解物的上清液和沉淀樣品:取剩余200 μL裂解液，15 000 r/min離心10 min，分別收集細(xì)胞裂解液的上清液和細(xì)胞沉淀?；旌?0 μL 5×上樣緩沖液到180 μL上清液中，做為上清樣品。用150 μL 5×上樣緩沖液重懸沉淀，做為沉淀樣品。100 ℃加熱10 min后，15 000 r/min離心5 min，待上樣。

1.2.4 SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE探究重組蛋白在不同溫度和誘導(dǎo)時(shí)間以及BL21(DE3)菌的上清液和沉淀中的表達(dá)情況。SDS-PAGE：配制5%(聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù))濃縮凝膠和15%(聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù))分離凝膠進(jìn)行電泳。將重組SCP蛋白樣品溶液(20 μL)與 5 μL上樣緩沖液混合，并在95 ℃加熱5 min后進(jìn)行電泳。通過(guò)比較低分子質(zhì)量標(biāo)記蛋白的電泳遷移率來(lái)確定分子質(zhì)量。使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)鑒定組氨酸(His)標(biāo)簽標(biāo)記的目標(biāo)蛋白，抗His抗體能夠和帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。確定重組SCP最佳表達(dá)條件后，取天然SCP和重組SCP蛋白樣品各20 μL 直接與5 μL上樣緩沖液混合，后續(xù)操作相同。

1.2.5 MALDI-TOF-MS分析

利用MALDI-TOF-MS，進(jìn)一步分析重組SCP蛋白的準(zhǔn)確性。質(zhì)譜鑒定的操作：切下通過(guò)SDS-PAGE獲得的目標(biāo)蛋白，蛋白樣品經(jīng)DTT還原和碘代乙酰胺烷基化處理后，用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠消化。酶解后得到的肽段再經(jīng)C18ZipTip脫鹽后，與基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸混合點(diǎn)板。最后用MALDI-TOF-MS儀進(jìn)行分析，波長(zhǎng)337 nm；加速電壓25 kV；采用正離子模式，自動(dòng)獲得數(shù)據(jù)。最后使用Mascot搜索工具將目標(biāo)蛋白酶解后所產(chǎn)生的得到的肽片段的質(zhì)量圖譜與NCBIprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的指紋進(jìn)行比較分析。

1.2.4 CD光譜分析

利用CD光譜測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)備0.3 mg/mL的天然SCP和重組SCP樣品，用CD光譜儀分析其CD光譜，并將測(cè)得的3個(gè)光譜平均值作為最終數(shù)據(jù)。對(duì)于波長(zhǎng)分析，以0.5 nm的步長(zhǎng)和2.0 nm的帶寬掃描樣品，光譜范圍為190～260 nm，掃描速度為200 nm/min。

1.2.5 過(guò)碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain，PAS)和碳水化合物-肽連鎖特征

食物過(guò)敏原大多數(shù)是具有酸性等電點(diǎn)的糖蛋白，且分子質(zhì)量一般在10～80 kDa[24]。用PAS染色法確定天然SCP是否屬于糖蛋白，取經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析的純蛋白條帶，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)作為陰性對(duì)照。用β消除法繼續(xù)驗(yàn)證SCP上的多糖是否有O-糖苷鍵，根據(jù)CHEN等[25]的實(shí)驗(yàn)稍作修改，取0.25 mg/mL的天然SCP蛋白樣品90 μL與0.5 mol/L的NaOH溶液10 μL混合均勻，于37 ℃靜置孵育15 h，測(cè)量其在230～300 nm處的紫外吸光值，以10 μL的純水混合孵育作為對(duì)照組。

1.2.6 蛋白多糖含量測(cè)定

用苯酚硫酸法測(cè)定天然SCP中多糖的含量，以鐘巖等[26]和佟海菊等[27]的實(shí)驗(yàn)作為參考，取5 g重蒸酚定容于100 mL水中預(yù)先配制5%(體積分?jǐn)?shù))的苯酚溶液，外包錫箔紙放4 ℃?zhèn)溆?；?zhǔn)確稱取105 ℃干燥恒重的1 g葡萄糖定容于100 mL水中，再取上述溶液1 mL定容于100 mL水中，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，取10支試管分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，均補(bǔ)加蒸餾水至2 mL；取天然SCP蛋白溶液，蛋白質(zhì)量濃度為0.620 9 mg/mL，各0.2 mL于3支試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL。以上13支試管先加入5%(體積分?jǐn)?shù))苯酚溶液搖勻，迅速各加入濃硫酸5 mL，搖2 min，靜置10 min，再于100 ℃水浴加熱20 min，于避光處冷至室溫，在490 nm處測(cè)其紫外吸光值，樣品3次測(cè)量值取平均值作最終數(shù)據(jù)，以空白試劑作為參比。

1.2.7 氨基酸組成成分分析

Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)顯示太平洋牡蠣SCP共含有179個(gè)氨基酸，SCP的氨基酸組成已經(jīng)很清楚，本文將SCP的氨基酸組成進(jìn)行了簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組SCP最佳表達(dá)條件確定

將含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-30a(+)導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別在15 ℃誘導(dǎo)16 h和37 ℃ 誘導(dǎo)4 h。用SDS-PAGE和WB檢測(cè)全菌、上清液、包涵體樣品，結(jié)果如圖1-A所示，由圖1-A可以看出無(wú)論是15 ℃誘導(dǎo)16 h，還是37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解物的上清液和沉淀中，在22 kDa處均有明顯條帶，而在沒(méi)有加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解物中沒(méi)有條帶顯示。圖1-A表明15 ℃誘導(dǎo)16 h比37 ℃ 誘導(dǎo)4 h蛋白表達(dá)量高，且從裂解上清液條帶可以看出前者可溶性蛋白含量也高于后者。圖1-B表明重組的SCP蛋白中含有His標(biāo)簽，也為下一步的Ni-柱親和層析純化做好基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得最佳表達(dá)條件15 ℃誘導(dǎo)16 h蛋白表達(dá)水平為25 mg/L，可溶性為70%。

2.2 SDS-PAGE 分析

對(duì)牡蠣粗提物進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖2所示。牡蠣粗提物主要含有相對(duì)分子質(zhì)量為20、35和40 kDa 的蛋白條帶，經(jīng)過(guò)75%～90%硫酸銨鹽析等后續(xù)操作上樣于HiTrap-Q柱，接收第2個(gè)洗脫峰的洗脫部分與重組SCP樣品一起電泳。純化后得到的天然SCP蛋白條帶在20 kDa左右，天然提取的牡蠣蛋白除了目的蛋白SCP外，還有較多的雜蛋白，通過(guò)純化也很難得到特別高的純度，而重組SCP蛋白條帶在22 kDa左右，其相對(duì)分子質(zhì)量略大于天然SCP相對(duì)分子質(zhì)量，這主要是由于重組SCP添加組氨酸標(biāo)簽使得蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變大，重組SCP蛋白在經(jīng)過(guò)Ni-柱親和層析后可以得到比較純的目的條帶。

A-SDS-PAGE；B-Western blot圖1 太平洋牡蠣SCP(～21.5 kDa)在BL21(DE3)表達(dá)的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of human heavy chain ferritin (～21.5 kDa) expression in BL21 (DE3)注：M1-分子質(zhì)量標(biāo)記，kDa；M2-WB分子質(zhì)量標(biāo)記，kDa；PC1-牛血清白蛋白(1 μg)；PC2-牛血清白蛋白(2 μg)；NC-未誘導(dǎo)的全細(xì)胞；1-15 ℃誘導(dǎo)16 h的全細(xì)胞；2-37 ℃誘導(dǎo)4 h的全細(xì)胞；NC1-未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解上清；3-15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解上清；4-37 ℃ 誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解上清；NC2-未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解沉淀；5-15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解沉淀；6-37 ℃ 誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解沉淀；用于WB的抗體為anti-His抗體(GenScript，Cat.No A00186)

M-分子質(zhì)量標(biāo)記，kDa；1-牡蠣粗提液；2-HiTrap-Q柱洗脫后的純化天然SCP；3-純化的重組SCP圖2 太平洋牡蠣天然SCP與重組SCP SDS-PAGE分析圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of natural SCP and recombinant SCP of Pacific oyster

2.3 MALDI-TOF-MS分析多肽

采用質(zhì)譜法鑒定22 kDa蛋白。用MALDI-TOF分析純化蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的肽段。如圖3所示，純化蛋白的質(zhì)譜顯示多個(gè)峰，從800～4 000 Da不等，最高峰為2 377 Da。將2 377 Da處的信號(hào)與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，使用Mascot工具搜索并觀察Mowse值，肽段序列匹配的最高得分是太平洋牡蠣SCP(登錄號(hào)：XP_011436345.1)，匹配值為24，評(píng)分為212。質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)表明22 kDa蛋白質(zhì)是牡蠣SCP。

圖3 太平洋牡蠣重組SCP質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrometry of recombinant SCP of Pacific oyster

2.4 CD光譜分析

通過(guò)上述一系列的實(shí)驗(yàn)的分析，已經(jīng)可以證明重組的SCP是正確的，為了更進(jìn)一步探究重組SCP與天然SCP是否具有相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了CD光譜實(shí)驗(yàn)。CD光譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)域具有肽鍵吸收信號(hào)，并能反映蛋白質(zhì)特征二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。由圖4可以看出，天然SCP信號(hào)在198 nm處具有1個(gè)正峰值，并且在208和222 nm處具有2個(gè)負(fù)峰值，此外，摩爾橢圓率θ222/θ208>1，這些信號(hào)可以有力地證明它是典型的α-螺旋蛋白質(zhì)。重組SCP蛋白的CD光譜信號(hào)幾乎與天然SCP的信號(hào)相重疊，可能是由于天然牡蠣SCP純度不夠，而重組的SCP純度更高，使得在2個(gè)負(fù)峰處的值稍有偏差，且經(jīng)蛋白擬合軟件CDNN計(jì)算得到蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各組成含量如表1所示，2種蛋白各組成含量基本相同，但這足以證明重組SCP與天然的SCP具有近乎相同的空間結(jié)構(gòu)。

nSCP-天然SCP；rSCP-重組SCP圖4 CD光譜Fig.4 CD spectrum

表1 二級(jí)結(jié)構(gòu)各組成含量測(cè)定Table 1 Determination of components in secondary structure

2.5 PAS染色和碳水化合物-肽連鎖特征

PAS染色用于鑒定牡蠣天然SCP是否是糖蛋白，如圖5-A所示，陰性對(duì)照BSA經(jīng)PAS染色未出現(xiàn)顏色變化，而SCP蛋白條帶經(jīng)染色出現(xiàn)預(yù)期的紫紅色，證實(shí)SCP確為糖蛋白。如圖5-B所示，SCP經(jīng)NaOH處理后，在230～300 nm處的紫外吸光值明顯增加，尤其在244 nm處增加值最大。這一結(jié)果表明，SCP的結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)或多個(gè)O-糖苷鍵[28]。O-糖苷鍵與多肽鏈上的絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連，在堿的作用下，發(fā)生β消除反應(yīng)，分子內(nèi)脫去1個(gè)水分子生成不飽和鍵，在244 nm處產(chǎn)生了紫外吸收。上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證SCP是O-糖苷鍵型的糖蛋白，而研究表明糖蛋白與IgE結(jié)合能力有關(guān)，即糖蛋白與抗原致敏性存在關(guān)聯(lián)。

2.6 SCP多糖含量

根據(jù)梯度葡萄糖濃度在490 nm處測(cè)得的吸光值繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=9.463 6x-0.000 4，R2=0.986 2，樣品吸光值平均值為0.046，則稀釋10倍前的多糖質(zhì)量濃度為0.049 0 mg/mL，而蛋白質(zhì)量濃度為0.620 9 mg/mL，即求得蛋白中糖含量為7.89%。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Glucose standard curve

2.7 氨基酸組成

SCP氨基酸組成如圖7所示。由圖7可以清楚地看出SCP蛋白含有19種氨基酸，其含有非常豐富的天冬氨酸(D)和賴氨酸(K)，其次是丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)和苯丙氨酸(F)，包含人體的8種必需氨基酸，可見(jiàn)氨基酸組成很全面。另外，SCP含有半胱氨酸(C)，半胱氨酸與二硫鍵的形成有關(guān)，有利于形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能與蛋白的過(guò)敏性不易消除存在一定的聯(lián)系。

圖7 SCP氨基酸組成Fig.7 Amino acid composition of SCP注：*-表示人體必需氨基酸；D-天冬氨酸；K-賴氨酸；A-丙氨酸；M-蛋氨酸；F-苯丙氨酸；E-谷氨酸；Q-谷氨酰胺；I-異亮氨酸；G-甘氨酸；V-纈氨酸；T-蘇氨酸；S-絲氨酸；L-亮氨酸；W-色氨酸；N-天冬酰胺；R-精氨酸；Y-酪氨酸；P-脯氨酸；C-半胱氨酸

3 結(jié)論

本研究以太平洋牡蠣為對(duì)象，采用飽和硫酸銨鹽析及陰離子交換等方法分離純化天然SCP，進(jìn)行MALDI-TOF-MS以證實(shí)該蛋白為牡蠣中提取的天然SCP。通過(guò)基因工程重組表達(dá)并采用鎳柱親和層析分離純化重組SCP，進(jìn)行Western blot證實(shí)研究成功利用重組大腸桿菌表達(dá)出牡蠣重組SCP。對(duì)重組SCP和天然SCP進(jìn)行SDS-PAGE、CD光譜分析證明了利用重組大腸桿菌表達(dá)出的SCP與天然SCP除了分子質(zhì)量稍有差別，空間結(jié)構(gòu)近乎相同，而重組蛋白相對(duì)天然蛋白性質(zhì)更加穩(wěn)定便宜獲取，為后期利用重組SCP替代天然SCP進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供理論支撐。實(shí)驗(yàn)利用PAS染色法鑒定牡蠣天然SCP為糖蛋白，利用苯酚硫酸法測(cè)定其蛋白中多糖的含量，采用β消化法鑒定此糖蛋白為O-糖苷鍵型的糖蛋白，另外，也對(duì)SCP氨基酸組成成分進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，這一系列實(shí)驗(yàn)旨在證明SCP確為牡蠣中的潛在過(guò)敏原。牡蠣營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)種類較全，非常適合作為人體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品，但牡蠣中除原TM和AK 2種重要過(guò)敏原，SCP作為新型過(guò)敏原也應(yīng)被研究重視。